חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

מטרת פרוטוקול זה היא ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם המבטאים חלבוני היתוך אנדוגניים המאוחים לתגי פלואורסצנט סופיים של מסגרת N או C. כדי להשיג את הדפיקות הרצויות, אנו משתמשים במערכת CRISPR-Cas9 ובגישה מבוססת ריבונוקלאופרוטאין המשתמשת בחלבון S.pyogenes Cas9 מסוג בר ו-CRSPR RNA סינתטי דו-חלקי ו-tracrRNA. RNP זה מועבר במשותף עם רצף התגים הפלואורסצנטי הרצוי כפלסמיד תורם באמצעות אלקטרופורציה.

תאים ערוכים כביכול המבטאים את החלבון המתויג הפלואורסצנטי, מועשרים על ידי FACS. לאחר מכן נוצרים קווים משובטים לניתוח תוצאות עריכה מדויקות. לפרוטוקול עריכת גנים זה יתרונות רבים על פני מבנים מסורתיים של ביטוי יתר.

מכיוון שתג פלואורסצנטי מוחדר לגנום, ניתן לחקור את הלוקליזציה והדינמיקה התת-תאית של חלבון ההיתוך המתקבל תחת בקרה רגולטורית אנדוגנית. כאן אנו משתמשים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כמערכת מודל מכיוון שהיא מאפשרת לנו לחקור את החלבונים המתויגים בתאים דיפלואידים שאינם מותמרים. בנוסף, מכיוון שניתן להתמיין את התאים למספר סוגי תאים, כמו תאי הקרדיומיוציטים המוצגים כאן, גישה זו מספקת את ההזדמנות ליצור ולחקור חלבונים מתויגים במגוון הקשרים תאיים איזוגניים.

עם זאת, עם אופטימיזציה זהירה, ניתן להתאים פרוטוקול זה לעריכת הגנום של סוגי תאי יונקים אחרים. היי, אני אמנדה האופט, אני חלק מצוות תאי הגזע ועריכת הגנים כאן במכון אלן למדעי התא. כיום, השתמשנו בגישה זו כדי ליצור למעלה מ-35 קווי תאים שונים המבטאים חלבוני היתוך אנדוגניים.

אנו משתמשים בהם כדי לחקור מגוון רחב של מבנים ותהליכים תאיים ייחודיים. גישה זו הצליחה עבור עד 95% מהמיקומים שניסו עד כה עם הקבוצה שלנו. שיטה זו תהיה שימושית במיוחד לביולוגים של תאים המעוניינים להבין טוב יותר את הדינמיקה של חלבון בתאים חיים.

עם זאת, ברגע שנוצרים קווי השיבוט הערוכים אפשרויות המחקר הן אינסופיות. בשיטה זו אנו מסוגלים לזהות באופן עקבי שיבוטים בעלי תגי חלבון פלואורסצנטיים מונואלליים ללא הפרעות אחרות ברצף הגנומי. אנו גם מסוגלים מדי פעם להשיג שיבוטים ערוכים באופן ביאללי.

בסרטון זה נציג כמה מהשלבים המרכזיים בטרנספקציה, העשרת FACS ובידוד קווי תאים משובטים המבטאים חלבוני היתוך פלואורסצנטיים מווסתים אנדוגנית. שעתיים-שלוש לפני הטרנספקציה, יש לטפל ב-hiPSCs עם עשרה מעכבי ROCK מיקרו-מולאריים בתוספת מצעי גדילה. זה יקדם את ההישרדות לאחר אלקטרופורציה.

לתאים יהיה מראה קוצני לאחר טיפול זה. יש להסיר תאים מצלחת סגירת הרקמה באמצעות אזור דיסוציאציה של תא בודד ולאסוף את תרחיף התאים בצינור חרוטי לפני הטרנספקציה. הכן מינון של 1.84 כפול 10 לששת התאים עבור כל תנאי ניסוי שיש להעביר.

הכן צינורות קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין לכל טרנספקציה על ידי הוספת 2.88 מיקרוליטר של 10 רנ"א מדריך מיקרומולרי ו-2.88 מיקרוליטר של 10 מיקרומולרי Cas9 לצינור של 1.5 מיל. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות, מקסימום שעה. גלולה את אליקוט התא שהוכן בשלב הקודם ב -211 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט ומיהרו לסובב את כדור התא ב-220 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה. הוסף 220 מיקרוליטר של תאים תלויים מחדש לצינור קומפלקס RNP בנפח 1.5 מיל שהוכן בעבר. הוסף 4.6 מיקרוליטר של מיקרוגרם אחד לכל פלסמיד תורם מיקרוליטר.

השתמש בקצה הגרעין ובפיפטה כדי לערבב את שני התוכן פעמיים עד שלוש ואז העביר מאה מיקרוליטר של תרחיף למכשיר האלקטרופורציה המוכן. הימנע מהכנסת בועות בקצה. החל שלוש מאות וולט למשך דופק אחד של שלושים אלפיות השנייה.

מעבירים בעדינות את המתלה לצלחת מוכנה של שש בארות בתנועה מסתחררת. פזרו את התאים על ידי הזזת הצלחת בעדינות מצד לצד ומקדימה לאחור. לאחר חזרה על כל תנאי הניסוי והבקרות, דגרו תאים שעברו טרנספטציה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות והחליפו את המדיה למצע גידול רגיל ללא מעכב ROCK ב-24 שעות.

לאחר מכן המשיכו להזין את ה-hiPSCs כל 24 שעות במשך 72 עד 96 שעות תוך ניטור המפגש שלהם. כאשר hiPSCs מגיעים ל-68 עד 80% מפגש המשך להעשרת FACS. שעתיים-שלוש לפני הטרנספקציה יש לטפל ב-hiPSCs עם 10 מעכבי ROCK מיקרו-מולאריים בתוספת למצע הגידול כדי לקדם את ההישרדות לאחר העשרת FACS.

כדי למיין תאים, הסר אותם מהצלחת באמצעות מגיב הדיסוציאציה של תא בודד ולאחר מכן סנן את תרחיף ה-hiPSC דרך מסנן רשת 35 מיקרון לצינורות עם תחתית עגולה מפוליסטירן. מיין תאים באמצעות פיזור קדימה ופיזור צדדי, כולל: גובה לעומת רוחב, פסולת שלישייה וכפולות. השתמש בתאי בקרה של מאגר חי בלבד כדי להגדיר את השער החיובי של FP כך שפחות מ-1.1% מתאי המאגר בלבד נופלים בתוך השער.

בעת מיון תאי גזע התאימו את הגדרות המכשיר כדי לקדם את הישרדות התאים כפי שהוצע בסעיף הדיון. דפיקה אופיינית ביעילות כפי שנקבעה על ידי אחוז התאים החיוביים FP על ידי FACS יכולה לנוע בין 0.1% ל-5%מיון תאים לתוך צינור פוליפרופילן של 1.5 עד 15 מיל המכיל 0.5 עד 2 מיל של מצע גידול בטמפרטורת החדר בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרו-מולרי. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב-211 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

שאפו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מצע גידול בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרו-מולרי. העבירו עד שלושת אלפים תאים מגוונים לבאר אחת של צלחת 96 בארות מצופה מטריג'ל טרייה. דגירה של תאים ממוינים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך 24 שעות, החלפת המדיה למצעי גידול בתוספת מעכב ROCK מיקרו-מולרי 5 ב-24 שעות.

לאחר מכן, לאחר 48 שעות, המשיכו להזין את התאים באמצעי גדילה רגילים, ללא מעכב ROCK כל 24 שעות למשך 72 עד 96 שעות תוך ניטור המפגש. לאחר שהתאים בשלים מספיק כדי לעבור מתוך צלחת 96 הבארות אנו ממליצים להעביר אותם בהדרגה לצלחות גדולות יותר. כך למשל מבאר אחת של צלחת 96 בארות, העבירו אותם לבאר אחת עד שתיים של צלחת 24 בארות.

ואז משם לצלחת של 6 בארות, וכן הלאה, עד שיש לך מספיק תאים למטרות במורד הזרם. בדרך כלל שלושה עד ארבעה מיליון תאים לפחות. כדי ליצור קווים משובטים מהאוכלוסייה המועשרת של FACS של תאים ערוכים עונשיים, עברו לתרחיף תא בודד וצלחו עשרת אלפים תאים על צלחת של 10 סנטימטר ואפשרו למושבות לגדול במשך חמישה עד שבעה ימים.

כאשר המושבות נראות לעין באופן מקרוסקופי הן גדולות מספיק כדי להיות מבודדות. במיקרוסקופ ניתוח השתמש בפיפטה P200 כדי לגרד ולשאוב בעדינות מושבות בודדות משטח הצלחת. העבירו את הנפח המכיל את המושבה לבאר אחת של צלחת 96 הבארות.

לאחר שכל המושבות הועברו יש לדגור את הצלחת בחממת תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות. החלף את המדיה למצע גידול רגיל ללא מעכב ROCK תוך 24 שעות. לאחר מכן המשיכו להאכיל את התאים כל 24 שעות במשך 72 עד 96 שעות עד שהמושבות ישלשו את גודלן.

יהיה צורך לגדל את התאים ולעבור אותם ב-96 צלחות באר על מנת שיהיו מספיק תאים לשימור בהקפאה לצורך מיצוי DNA גנומי. עיין בפרוטוקול הכתוב לפרטים נוספים. כדי לעבור ב-96 לוחות באר השתמש בשואב שמונה ערוצים כדי להסיר ולזרוק מדיה מהעמודה הראשונה.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית P200 הוסף כ -200 מיקרוליטר DPBS לעמודה הראשונה של הצלחת כדי לשטוף את התאים. בעזרת שואב שמונה ערוצים הסר והשליך את שטיפת ה-DPBS מהעמודה הראשונה. לאחר מכן הוסף 40 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה לעמודה הראשונה.

חזור על שלבים אלה בעבודה עמודה אחת בכל פעם עד שש עמודות בסך הכל של לוח 96 הבאר. שנה טיפים כדי לוודא לא לחצות בארות מזהמות. מניחים את הצלחת בחממה למשך שלוש עד חמש דקות מרגע הוספת מגיב הדיסוציאציה לעמודה הראשונה.

כאשר התאים בעמודה הראשונה של הצלחת החלו להתרומם מהתחתית, השתמש בפיפטה רב-ערוצית P200 כדי להוסיף 160 מיקרוליטר של DPBS לעמודה הראשונה ולשלש בעדינות את התאים במיקומי השעה 12, השעה 3, השעה 6 והשעה 9 של כל באר. העבירו את כל הנפח עם מתלה תאים לצלחת באר V-bottom 96. חזור על שלבים אלה עבור העמודות הנותרות שיש בהן מגיב דיסוציאציה ומשנה טיפים כדי לא לזהם את הבארות.

סובב את צלחת ה- V התחתונה בצנטריפוגה ב -385 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. המשנה המוצגת עד לנקודה זו עבור 96 מעבר בארות מבוצעת באותו אופן בכל פעם שהתאים מועברים בפורמט צלחת זה. בשלב הבא נראה לך כיצד להמשיך אם אתה מוכן לשמר בהקפאה את התאים בפורמט 96 באר.

עיין בפרוטוקול הכתוב למידע נוסף. לאחר שלב הצנטריפוגה שהוצג בסעיף הקודם, שאפו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה רב-ערוצית P200 ולאחר מכן השעו מחדש 60 מיקרוליטר של מצע גידול בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומולרי. חזור על כל הבארות, ושנה טיפים כדי לא לזהם את הצלב.

העבר 30 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצלחת תרבית רקמות 96 באר שאינה מצופה מטריג'ל. העבירו את 30 המיקרוליטר הנותרים של המתלים לצלחת אחות, ואז הוסיפו במהירות 170 מיקרוליטר של מאגר הקפאה לכל באר מבלי לערבב. שימו לב שתהליך זה נעשה בלוחות אחיות כפולים כך שקיימת אוכלוסיית גיבוי של תאים לאחר הפשרת אחת הלוחות הבודדים.

הכנסת תאים שמורים בהקפאה רק לכל עמודה אחרת של צלחת 96 הבאר מאפשרת הפשרה מהירה יותר. עטפו את הצלחת בפרפילם והניחו אותה בקופסת קלקר בטמפרטורת החדר עם מכסה. מניחים את כל הקופסה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.

לאחר 24 שעות ניתן להוציא צלחות מקופסת הקלקר ולמיין במינוס 86 מעלות צלזיוס עד ארבעה שבועות. שימור בהקפאה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בפורמט של 96 בארות מאפשר הפסקה זמנית בתרבית התאים. החוקר יכול לבצע בדיקות אימות גנומיות על המכרות המשובטים כדי לזהות את השיבוטים הרצויים מבחינה גנטית להפשרה למחקרים עתידיים.

ארבעה ימים לאחר העברת קו ה-WTC hiPSC עם חלבון RNA Cas9 מדריך ספציפי למטרה ופלסמיד תבנית תורם שתוכנן בקפידה, נצפו 0.95% מהתאים מבטאים GFP. FACS שימש למיון כל התאים החיוביים ל-GFP כאוכלוסייה מועשרת. מחקרי מיקרוסקופיה ראשוניים חשפו את הלוקליזציה הצפויה של חלבון ההיתוך הגרעיני mEGFP lamin B1 למעטפת הגרעין.

החלבון המסומן פלואורסצנטי נצפה בכ-95% מהתאים בעוצמות שונות. לאחר יצירת קו משובט, התקבלו שיבוטים עם עוצמת mEGFP אחידה ונותחו עוד יותר לעריכה מדויקת. לסיכום, הראינו שיטת טרנספקציה לעריכת גנים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים לביטוי של חלבוני היתוך פלואורסצנטיים מווסתים אנדוגנית.

מכיוון שחוסר יעילות דפיקות טיפוסי הוא נמוך, אסטרטגיית העשרה מסוימת כמו שיטת FACS המוצגת כאן מביאה לאוכלוסייה של תאים ערוכים כביכול המבטאים את חלבון ההיתוך. ניתן להשתמש באוכלוסייה המועשרת למחקרים ביולוגיים או ליצור קווים משובטים כמתואר בשיטה זו המאפשרת לזהות קווי תאים שנערכו במדויק על ידי גנים. חשוב לזכור שהפסקות גדיל כפול המושרות על ידי Cas9 בגנום מתוקנות לעתים קרובות בצורה לא מדויקת למרות שילוב התג בלוקוס המיועד.

בנוסף בשיבוטים ערוכים מונואללית, האלל הלא מתויג מכיל לעתים קרובות אינדלים הנגרמים ככל הנראה על ידי תיקון הצטרפות קצה לא הומולוגי. ממצאים אלה מדגישים את החשיבות של אימות גנטי לאחר דפיקה של CRISPR Cas9 שהתגלתה רק באמצעות ניתוח הגנום של קווי תאים משובטים. ביטוי חלבון ההיתוך הצפוי לבדו אינו מבטיח עריכה מדויקת.

בעת שימוש בפרוטוקול זה לעריכת תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, הקפד לעקוב אחר ההמלצות המפורטות בפרוטוקול הכתוב כדי להבטיח טיפול עדין בתאים להישרדות תאים אופטימלית והתמיינות ספונטנית מינימלית. אנו מקווים שהסרטון הזה והפרוטוקול ורשימת החומרים הקשורים אליו יסייעו לכם לבצע ניסויים דומים במעבדה שלכם על החלבון האהוב עליכם. תודה שצפית.