סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית

ככל שמבנים להגברת הפונקציונליות של מבנים סופר-מולקולריים גדלים, שיטה זו של שילוב קבוצות 1, 2-dithiolane עם פפטידים בהרכבה עצמית יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תגובתיות על משטחים סופר-מולקולריים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהצימוד וההגנה של מולקולת המבשר 1, 2-dithiolane מתרחשים על שרף עם שלב טיהור יחיד בלבד של הפפטיד הסופי שהשתנה. מכיוון שהזמן שלוקח למכלולים להבשיל למבנים הסופר-מולקולריים הסופיים שלהם משתנה, הדגמה חזותית של שיטות האפיון והתוצאות עבור המכלולים הסופר-מולקולריים היא קריטית.

כדי לסנתז את מבשר הדיתיולאן, יש להמיס תחילה גרם אחד של חומצה 3-ברומו-2-פרופריונית בכארבעה מיליליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד בבקבוק תגובה עגול של 50 מיליליטר ב-55 מעלות צלזיוס תוך ערבוב. כאשר כל המגיב הושעה בתמיסה, אטמו את בקבוק התגובה עם מחיצה והניחו את הבקבוק מתחת לאטמוספירת חנקן. לאחר מכן, הוסף 1.49 גרם אשלגן תיואצטט ושלושה מיליליטר של חומצה גופרתית דו-מולרית לארבעה מיליליטר של מים נטולי יונים כדי ליצור חומצה תיואצטית באתרה.

שאפו את תמיסת החומצה התיואצטית למזרק פלסטיק חד פעמי של 10 מיליליטר וציידו את המזרק במחט בגודל 18, ואז נקבו את המחיצה עם המחט כדי להוסיף את התערובת טיפה לבקבוק התגובה והמשיכו את התגובה למשך הלילה ב-55 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, עקוב אחר התגובה על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה על צלחות סיליקה ג'ל 60 F254 באמצעות תערובת של מתנול ודיכלורומתאן והדמיה של התקדמות התגובה על ידי כתם ירוק ברומוקרסול. כאשר התגובה שהושלמה התקררה לטמפרטורת החדר, יש להחמיץ את התערובת בחומצה גופרתית דו-טוחנית ל-pH של אחד.

שמן צהוב צריך להיפרד מהתמיסה, ואז לחלץ את המוצר בשלוש תוספות של 40 מיליליטר של כלורופורם קר ולשלב את השכבות האורגניות לייבוש על מגנזיום גופרתי, ולהסיר את הכלורופורם בלחץ מופחת. המוצר צריך להיות שמן צהוב עם תשואה כוללת של 83%וניתן להשתמש בו ללא טיהור נוסף. כדי לחבר את מבשר הדיתיולאן לקצה ה-N של הפפטיד על השרף, הוסף ארבעה מקבילים של מבשר דיתיולאן לחמישה מיליליטר של דימתילפורממיד, ארבע מקבילות ל-HBTU ו-10 מקבילות ל-DIPEA.

אפשר לתערובת הצימוד לפעול מראש למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הוספת הדגימה למזרק הפריט המכיל שרף N. לנער את תגובת הצימוד למשך שעתיים, ולאחר מכן שלוש שטיפות של חמישה מיליליטר בדימתילפורממיד טרי ולחזור על תגובת הצימוד וניעור הלילה. לאחר הצימוד השני, שטפו את השרף בשלוש שטיפות דימתילפורממיד של חמישה מיליליטר ואחריהם שלוש שטיפות שרף דיכלורומתאן של חמישה מיליליטר והעבירו את השרף המיובש לצינור תגובת מיקרוגל של 10 מיליליטר.

לאחר מכן, כדי להגן על קבוצת התיואצטט מפני מבשר N-terminus dithiolane, הוסף שני מיליליטר של דימתילפורממיד לשפופרת. הניחו לשרף להתנפח, הוסיפו מוט ערבוב מגנטי קטן לכלי והשעו מחדש את השרף תוך ערבוב מגנטי במהירות נמוכה. לאחר 15 דקות, הוסיפו שני מיליליטר אמוניום הידרוקסיד מרוכז לצינור, כסו את כלי התגובה במחיצת סיליקון והניחו את הכלי בכור מיקרוגל למשך 45 דקות בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס תוך ערבוב.

לאחר השלמת תגובת המיקרוגל, העבירו את השרף למזרק נקי, חד פעמי ופריט ושטפו את השרף בשתי שטיפות דימתילפורממיד של חמישה מיליליטר ושתי שטיפות מתנול של חמישה מיליליטר. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו חמישה מיליליטר קוקטייל מחשוף למזרק המכיל שרף למשך שעה וחצי דגירה עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר. להכנת מיליליטר אחד של פפטיד גולמי לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או טיהור HPLC, הוסף 400 מיקרוליטר של מלאי פפטיד מרוכז באצטוניטריל ל-600 מיקרוליטר מים בתוספת 0.1% של חומצה טריפלואורואצטית וסנן את התמיסה דרך מסנן מזרק של 22 מיקרומטר לבקבוקון HPLC.

כדי לטהר את הפפטיד, השתמש בעמודת הכנה למחצה C18 בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה על פני שיפוע ליניארי של 15 עד 55% אצטוניטריל תוך 20 דקות כאשר גלאי ה-UV מוגדרים ל-222 ננומטר ו-330 ננומטר. לאחר מכן אסוף ושלב את פסגות העניין. לאישור מוצר פפטיד על ידי זמן ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה או ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF, מערבבים 0.5 מיקרוליטר מהשיא שנאסף על צלחת ספיגה/יינון לייזר בעזרת מטריצה המכילה 0.5 מיקרוליטר של מטריצת חומצה 2, 5-דיהידרוקסיבנזואית.

כדי להכין תמיסה להרכבה עצמית, ממיסים מיליגרם אחד של אבקת הפפטיד הליופילית בתערובת של 20% אצטוניטריל ו-HEPES של 10 מילי-מולרי בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ואז מערבל את תמיסת ההרכבה והשאיר את הדגימה להרכבה בטמפרטורת החדר. כאשר מכלול הפפטידים מגיע להבשלה, יבש שמונה עד 10 מיקרוליטר מתמיסת ההרכבה כסרט דק על גביש היהלום המוחלש בעל ההשתקפות הכוללת ועקוב אחר היעלמותו של פסגת מים גדולה ורחבה מ-1640 עד 1631 סנטימטרים הפוכים עם היווצרות הסרט היבש. רכוש ספקטרום רקע ואינפרא אדום מ-1500 עד 1800 סנטימטרים הפוכים בממוצע 50 סריקות ברזולוציה של שני סנטימטרים הפוכים, תוך הפחתת סריקות הרקע לפני כל סריקת דגימה.

יש לראות את חתימת האינפרא אדום להרכבת יריעות בטא כשיא חד בין 1625 ל -1635 סנטימטרים הפוכים. כאשר דגימות הפפטיד הבשילו למבנים סופר-מולקולריים עשירים ביריעות בטא, טען 10 מיקרוליטר מתמיסת הרכבת הפפטידים על פני רשת הפחמן של מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה ואפשר למכלולים לספוג על פני הרשת למשך דקה עד שתיים. גע בנייר סינון לקצה הרשת כדי להסיר את הדגימה העודפת, והוסף 10 מיקרוליטר של כתם אורניל אצטט טרי 2% שהוכן למשטח הרשת למשך שתיים עד שלוש דקות, ולאחר מכן הסר כתם עודף עם נייר סינון והנח את הרשת במייבש ואקום למשך הלילה לפני הדמיה למחרת על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

מלבד הסינתזה הראשונית בשלב אחד של מולקולת הפרקורסור דיתיולאן, שאר סינתזת הפפטיד 1, 2-dithiolane ששונה מתרחשת על תמיכה מוצקה. ההמרה של חומצה 3-bromo-2-proprionic לחומצה 3-2-propanoic, מבשר הדיתיולאן, מאושרת על ידי תהודה מגנטית גרעינית של פרוטון ופחמן-13 לפני שהיא מחוברת לאמין N-terminus החופשי של פפטיד שעדיין על שרף. לאחר הסרת ההגנה, הפפטיד הגולמי מטוהר על ידי HPLC בשלב הפוך ומסת המוצר מאושרת על ידי ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

ניתן להשתמש בספקטרוסקופיה אינפרא אדום ודיכרואיזם מעגלי של טרנספורמציה פורייה כדי לנטר את ההרכבה העצמית של הפפטיד המטוהר 1, 2-dithiolane לסיבי עמילואיד בוגרים כדי לאפיין את קונפורמציה של יריעות הבטא המורחבות שלהם. לאחר מכן ניתן לדמות את הסיבים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. בעוד שניתן להשתמש בשיטות אלו כדי לשנות את מסוף ה-N של כל רצף פפטידים שעדיין על שרף, חשוב לזכור שיש למטב את תנאי ההרכבה העצמית של הפפטיד עבור כל פפטיד.

טכניקות אלה, המוסיפות קבוצות 1, 2-dithiolane לפפטידים בהרכבה עצמית, יאפשרו לחוקרים בתחום הביו-חומרים לחקור תגובתיות פני שטח סופר-מולקולרית.