Name: במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: חקור ארגון עצמי של חלבוני MinD ו-MinE על שכבות שומן נתמכות במיקרו-תאים מוגדרי גאומטריה. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בתנאי היווצרות דפוסים לחקר דינמיקת ממברנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים היימן מיכאל, פרנק Siedler לייצור סיליקון ואפלים הליבה מתקן MPI-B לסיוע בסיימון Kretschmer וטיהור חלבונים ו ליאון הרינגטון להערות על כתב היד.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
<li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ParA%2FMinD+family+puts+things+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li>
<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
<li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
<li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MipZ%2C+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758(2014).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
<li>Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li>
<li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li>
<li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li>
<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116(2013).</li>
<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

תארנו פרוטוקול למפת במבחנה MinCDE לביצוע ארגון-עצמי על גרפים מישוריים נתמך השומנים bilayers, בהשומנים bilayer מכוסה מבנים תלת-ממד, באמצעות הדוגמה של מוט בצורת מזערים PDMS. על מנת לקבל נתונים יקרי ערך מן מבחני האלה, הם הגורמים החשובים ביותר כדי לשלוט חלבון ואיכות ממברנה.
כדי להבטיח איכות חלבון, חלבון המוני צריך להיות מאושרות מרחביות-דף באמצעות ספקטרומטר מסה. יתר על כן, כדאי לוודא כי החלבונים הם מסיסים ובחלקם לא צבור, באמצעות סינון ג'ל אנליטית או פיזור אור דינאמי. סינון ג'ל יכול לשמש כדי להסיר כל שבר צבורים של חלבונים. התאמת חומציות זהיר והאיכות של נוקלאוטידים נוסף הוא קריטי, כמו התוספת של נוקלאוטיד לא מנוכים או חלקית מפורק לחלבון מניות או מבחני התארגנות עצמית היא מספיקה כדי לחסל את פעילות החלבון, לכן המבטלת ארגון עצמי.
לצד איכות חלבון, ממברנה איכות הוא הקריטי ביותר, היווצרות קרום לא תקין הוא לרוב הסיבה לביצוע ארגון-עצמי פגום, המקור של מבנים משטח artefactual.
בעת ביצוע הפרוטוקול בפעם הראשונה, זה עוזר לה תווית bilayers את השומנים הנתמכות על-ידי הכללת שומנים שכותרתו כמו אטו-655-סמים או DiI-אחוזי טוחנת נמוך (0.05%). ובכך המאפיינים ואת האיכות של הקרום יכולה להישפט ישירות. באמצעות FRAP, הנזילות של הקרום יכול להיות מוערך. יתר על כן, אחד ישירות יכול להעריך את האיכות של שטיפה של סאט גלובל, כמו שם תהיה שלפוחית רבים מדי, אין ממברנה נוזלית או קרום אין בכלל, אם זה נשטף. הגישה קאמרית פתוחה מאפשרת לרחוץ בקפדנות הממברנה, ומכאן גם להסרת שלפוחית זה דבוקים על פני השטח של סאט גלובל. הגורמים המכריעים עבור קבלת נוזלית ואחידה השומנים הנתמכים הם bilayers ניקוי hydrophilicity של פני השטח תמיכה, בגודל הנכון והומוגניות סולעומת זה יכול להיות מועיל לבדוק את גודל שטח ושימוש התפלגות גודל פיזור אור דינאמי. עבור הפצות גודל צרה, אנו ממליצים הבלטת ממד השלפוחיות המוגלתיות ולא sonicating אותם. שיטות אחרות של ניקוי coverslips, למשל, טיפולים עם בסיסים חזקים, חומרי ניקוי בסיסי, או משתמש coverslips ישירות לאחר שטיפה עם מים, תניב תוצאות טובות, בהתאם התערובת יישום, שומנים בדם.
המחצית הראשונה של פרוטוקול המובאים כאן, במבחנה שיחזור על השומנים נתמך מישורי bilayers בתאי פתוח, יש את היתרון של עיבוד פני השטח נגיש עבור microscopies אופטי, כגון מיקרוסקופ TIRF30, FRAP ניתוח6, יחיד-חלקיקים מעקב34, כמו גם טכניקות בדיקה משטח כגון מיקרוסקופ כוח אטומי26. באזור הומוגנית הגדול מאפשר סטטיסטיקה טובה יותר בריכוזים מוגדרים. יתר על כן הגישה קאמרית פתוח מאפשר לשלוט במדויק ריכוז חלבון לבין תוספת מהירה ופשוטה של עוד רכיבים, ומכאן המתיר כדי titrate ריכוז חלבון יחיד קאמרית20. ניתן להרחיב את הבדיקה גם באמצעות תוספת של רכיבים אחרים divisome חיידקיים כגון22,FtsZ35, ZipA22 או ה10,FtsZ-YFP-MTS חלבון chimeric35.
קבוצות אחרות לקחו בגישה דומה כדי לשחזר את Min מערכת במבחנה, אבל שימוש זרימה-תא במקום18,17,תא פתוח19. זרימה-תאים יש יתרונות מסוימים, בפרט כאשר סביבה תלת-ממד מלא סגור הוא הצורך18, השפעת זרימת17,19,23 או קומפוזיציה ממברנה23 על דפוסי MinCDE חקר, או אם חלבון דפוסי להיות שנצפו תחת חלבון הגבלת תנאים19. למרות זאת, בקרה מקומית של ריכוזים מולקולרית קשה יותר. מרכיבי חלבון, בעיקר המוח, בחוזקה לאגד הקרום הם פוגשים לראשונה18,19. מניסיוננו, החלבונים לעתים קרובות להציג שאינם ספציפיים איגוד אבובים, פתחי הכניסה, מזרקים, חלקים אחרים microfluidic. לכן, ריכוז חלבון המקומי נבדלים ריכוזים קלט18 ו גם להשתנות לאורך של הזרימה-התא, וכתוצאה מכך מגוון של דפוסי חלבונים שונים על קרום בין כניסת ו שקע, כפי שנצפה על ידי אחרים19.
השני מחצית הפרוטוקול המובאים כאן, את הכינון במבחנה במוט בצורת מזערים מחדש באמצעות גישה פתוחה קאמרית על תמיכה בדוגמת מכוסה על ידי השומנים bilayers מאפשר לחקות פשוטה ההתנהגות חלבון ' ויוו למרות שליטה מדויקת ריכוז חלבון אובד עקב הסרת מאגר. שימו לב כי בגלל אורך הגל של גבירתי הוא סדר גודל אחד גדול במבחנה ויוו microcompartments מוט בצורת נמצאים גם על אחד בסדר גודל גדול יותר (10 x 30 מיקרומטר) מאשר מוט בצורת e. coli תא.
בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר שליטה מדויקת של כל התנאים, לרבות ריכוז חלבון, מאגר הרכב ומאפייני ממברנה. השימוש תומך 3D מובנה מאפשר התגובה שילמדו תחת כליאה המרחבי, מחקה התנהגות ויוו ללא צורך מיקרופלואידיקה מורכבים ציוד.

ייתכן דפוסי חיוניים בטבע, ויסות משימות מורכבות ברמה multicellular וסלולריות, מן מורפוגנזה מוסדר חלוקת התא1,2. התגובה דיפוזיה מערכות יש תפקיד חשוב בהקמת הדפוסים הללו, אבל הם עדיין לא מובנים היטב. דוגמה ומופת מערכת התגובה דיפוזיה לבין מערכת ביולוגית מאופיין בצורה הטובה ביותר עד כה הוא Escherichia coli MinCDE מערכת3,4,5,6,7. מערכת MinCDE מתנדנד מהקוטב תא לקוטב תא ב e. coli כדי לקבוע באמצע של התא כאתר חטיבת בעתיד. מערכת זו מבוססת על המוח ATPase, ATPase הפעלת חלבון שלי, ושל הקרום כמו מטריקס המרחבי תגובה8. MinC אינה חלק ממנגנון היווצרות תבנית, אלא הוא סוכן תפקודית בפועל: מעכב של החלבון העיקרי divisome FtsZ5,6. MinC נקשר לי בראש וזה ולכן עוקב אחר תנודות, וכתוצאה מכך הדרגתי ריכוז חלבון זמן ממוצע מקסימלי בקטבים תא, מינימלי באמצע התא, המאפשר רק FtsZ פולימריזציה midcell9,10 . מערכת MinCDE היא חלק ממשפחת גדול יותר של ווקר A ATPases כי הם המפתח לארגון ייתכן חיידקים2, מיצוב, הובלת חלבון מתחמי11 ו פלסמידים12 ולשם וויסות תא חטיבת13 ו כרומוזום סגרגציה14. לפיכך, מערכת התגובה דיפוזיה MinCDE מייצג מערכת ריאקציה ארכיטיפי-דיפוזיה אלא גם משכה תשומת לב בגלל להתאמתו של הארגון ייתכן בחיידקים.
מחקרים פונקציונלי מפורט של ה MinCDE מערכת ויוו הם מסובכים, מניפולציה של חלבונים ו ג'ין מחיקה התוצאה בדרך כלל פגמים חלוקת התא. יתר על כן, שינוי בהרכב הממברנה או את המאפיינים של ה ציטוזול ויוו הוא מאוד מאתגר15,16. שינויים במערכת והשפעה על גורמים שקשה לפרש בסביבה מורכבת של התא, אפילו יותר אם זה מופר ב פעולה הכרחית כמו חלוקת התא. אנחנו ואחרים ולכן פנו גישה למפת במבחנה , צמצום המערכת רכיבי הליבה שלה: המוח, שלי, ATP כמקור אנרגיה, ליפידית נתמך כמו התגובה מטריקס6,17, 18. גישה מלמטה למעלה זו מאפשרת לחקור את המנגנון של ארגון עצמי בפירוט ללא המורכבות של תא חי. הטופס חלבונים נסיעה משטח גלים6 וסוגים אחרים של דפוסי17,,19 , בתנאים אלה, אמנם עם אורך גל זה בדרך כלל בערך גודל גדול יותר ויוו. השימוש של חדר פתוח מאפשר בקרה מדויקת על כל האספקטים המשפיעים על היווצרות תבנית: ריכוז חלבון6, מאפייני חלבון20, ממברנה קומפוזיציה10, מאגר הרכב וריכוז ATP 6, וכן תוספת של גורמים אחרים כמו הצפיפות סוכנים21 ו- חלבונים אחרים divisome22. לשם השוואה, הכינון במבחנה של מערכת MinCDE19,18,תאים זרימה23 יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של17,זרימה23, חלבון הגבלת תנאים19, ממברנה קומפוזיציה19 ו 3D מלא כליאה18 על דפוסי חלבון, אבל רינדור פקד המדויק של ריכוז חלבון/רכיב, רציפים רכיב תוספת הרבה יותר מסובך.
באמצעות החדר פתוח הזה, אנחנו גם בדוגמת התמיכה של bilayers השומנים מישורי שבו אחד יכול לחקור איך גיאומטרי גבולות ההשפעה דפוס היווצרות21, תופעה בעלת לאחרונה גם היה ובדוקים ויוו באמצעות חיידקים יצוק לתוך מזערים7. אנחנו גם מועסקים זה וזמינותו לחקור כיצד מוגדרים מוטציות בגן שלי תבנית משפיעים על היווצרות מערכת20. יתר על כן, כבר מועסקים באותו פורמט בסיסי assay לחקור איך היווצרות דפוס יכול להיות נשלט על ידי אור, ידביקו פפטיד מכרה של תפור azobenzene וזמינותו, והדמיה עם מיקרוסקופ TIRF24.
מצאנו את זה, כדי לשכפל את התבנית גבירתי היווצרות נצפתה ויוו בבידוד מערכת, במבחנה היה מפתח. באמצעות מוט בצורת microcompartments, עם מידות מותאמות אורך הגל גדולה יותר של גבירתי במבחנה (10 x 30 מיקרומטר), לבושות עם שכבה ליפידית הנתמכות מותר את בנייתו מחדש של תנודות הקוטב-כדי-מוט גבירתי ויצירת חלבונים מעבר צבע 10,25. ב- assay הזה, bilayers השומנים נתמך מופקדים על מצע PDMS בדוגמת המכיל מספר מאה העתקים של microcompartments מוט בצורת שנותרו פתוחים על גבי. על ידי זה, התגובה ניתן להגדיר בחדר פתוח ולאחר מכן המאגר הוא הוריד את שפת microcompartments, ובכך מגבילה את התגובה לאמצעי אחסון קטן. למרות תאים אלה יש ממשק האוויר-מאגר בצד אחד, ולכן אינם מייצגים ריתוק 3D מלא על ידי קרום, הדינמיקה חלבון חיקה ויוו תנודות10,25. בהשוואה כליאה 3D מלא, אשר מראה דומה מאוד תוצאות18, וזמינותו מזערים פתוחה היא יחסית פשוטה וקלה כדי להתמודד עם, יכול להתבצע גם על ידי מעבדות כי אינם מצוידים ציוד מיקרופלואידיקה מיוחדים, מתקני החדר נקי.
כאן, אנו מציגים טיפול נסיוני לשחזר MinCDE דפוס היווצרות על תמיכה השומנים bilayers במבחנה באמצעות חדר פתוח המאפשר שליטה על כל רכיבי וגישה נוחה על ידי מיקרוסקופ אופטי ו, עם קטין שינויים, גם היא יכולת הסתגלות עבור השטח-בדיקה טכניקות26. ליד bilayers מישורי השומנים הנתמכים, אנו גם מראים איך כליאה חלבון יכול להיות מושגת באמצעות פשוטה השומנים נתמך בדוגמת bilayers על מוט בצורת מזערים PDMS. מבחני האלה, למרות ממוטב עבור מערכת MinCDE, ניתן גם להעביר למערכות אחרות חלבון המקיימים אינטראקציה באופן דומה עם הקרום, כגון FtsZ27 או של אקטין מינימלית קורטקס28.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>ליפידים קוטביים אוונטי</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>אוונטי ליפידים קוטביים</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שומנים קוטביים E.coli ליפידים קוטביים</td><td>Avanti</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט מלח דיסודיום טריהידרט</td><td>רוש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5&פריים;-דיפוספט מונופוטסיום מלח דיהידרט</td><td>סיגמא</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>רוט</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>טריס-בסיס</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T1503-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>רוט</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>טרמו פישר סיינטיפיק</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>אתילן דיאמין טטרה-אצטט</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית 98%</td> <td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן 50%</td> <td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>גליצרול 86%</td> <td>רוט</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB בינוני</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>base Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS crosslinker</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 ו-#63 שניהם עובדים היטב</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 מ"מ</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסויים #1 24x24 מ"מ</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td>משמש רק למיקרו-מבנים PDMS</td></tr><tr><td>0.5 מ"ל צינור תגובה</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית 0030123301 2 ליטר</td><td>קורנינג</td><td>למשל 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap עמודת</td> ג'לסנון ג'ל של HP <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: HiLoad Superdex 75 PG או 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG עמוד התפלה ארוז מראש</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר דיאליזה: קלטות דיאליזה Slide-A-Lyzer, 3.5K MWCO, 0.1 - 0.5 מ"ל או 0.5-3 מ"ל</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 או 66330</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><חזק>מכשירים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד: Milli-Q Type 1 מערכות מים אולטרה-טהורים</td> מערכת טיהור חלבון אוטומטית <td>של Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: &Auml; kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור אמבטיה</td><td>ברנסון</td><td></td><td>למשל דגם 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 מיקסר</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה Zepto</td><td>Diener אלקטרוני</td><td></td><td>שימוש בחמצן כתהליך</td></tr><tr><td>גז תזוזה חיובי פיפטות</td><td></td><td></td> מותג <td>Transferpettor דגמי עם קצות זכוכית</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מצויד ב-Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 אובייקטיבי</td></tr><tr><td><חזק>פלסמידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>המחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שוויל</td><td></td><td>מקודד פלסמיד His-MinD ו-MinE לא מתויג לשיפור התשואה</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>המחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שוויל</td><td></td><td>מקודד פלסמיד His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-HIS-EGFP-MinD</td><td>המחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שוויל</td><td></td><td>מקודד פלסמיד His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>המחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שוויל</td><td></td><td>קידוד פלסמיד His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>המחלקה לביופיזיקה תאית ומולקולרית, MPI לביוכימיה, פרופ' שוויל</td><td></td><td>מקודד פלסמיד His-MinC</td></tr></tbody></table>

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

היבטים רבים של הארגון ייתכן הבסיסית של תאים נשלטים על ידי מערכות סוג התגובה דיפוזיה. במבחנה הכינון של מערכות כאלה מאפשר לימודים מפורטת מנגנוני הבסיסית שלהם, אשר לא יהיה ריאלי ויוו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול את במבחנה בנייתו מחדש של המערכת MinCDE של Escherichia coli, אשר עמדות מחצה חלוקת התא באמצע תא. וזמינותו נועד לספק רק את הרכיבים הנחוצים לביצוע ארגון-עצמי, דהיינו קרום, את שני החלבונים המוח ואת שלי, ושל אנרגיה בצורת ATP. אנחנו ולכן לפברק תא התגובה פתוח על coverslip, שבו נוצרת שכבה ליפידית הנתמכות. עיצוב החדר פתוח מאפשר הכנת ליפידית האופטימלית ומניפולציה מבוקרת של התוכן בצובר. שני החלבונים, המוח שלי, וכן ATP, יתווספו לאחר מכן לתוך האחסון בצובר מעל הקרום. הדמיה אפשרי על ידי רבים microscopies אופטי, עיצוב תומך קונאפוקלית, שדה רחב ומיקרוסקופ TIRF כאחד. וריאציה של הפרוטוקול, ליפידית נוצר על תמיכה בדוגמת, בצורת תא מזערים PDMS, במקום זכוכית. הנמכת הפתרון בתפזורת על החישוק של תאים אלה יקיף את התגובה בתא קטן יותר ומספק גבולות המאפשרים מחקה התנהגות ויוו מתנדנדות. יחדיו, נתאר פרוטוקולים כדי לשקם את המערכת MinCDE עם וללא כליאה המרחבי, ומאפשר לחוקרים דווקא לשלוט בכל ההיבטים המשפיעים על היווצרות תבנית, כגון ריכוז טווחים או גורמים אחרים או חלבונים, ולהגדיל באופן שיטתי מערכת המורכבות הגדרת נסיוני יחסית פשוטה.

טיהור חלבון הפרוטוקול שלנו אמור להניב מינימום חלבונים של טוהר נאותה. כאסמכתא, איור 1 מספק תמונה מרחביות-דף של המוח, fluorescently מתויג המוח שלי, מינק. השלבים בודדים של ההליך לביצוע assay ארגון עצמי של גבירתי על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers מתוארים באיור2. באמצעות פרוטוקול זה, גבירתי רגיל בנסיעות גלי המשטח יכול להיות שנצפו ברחבי החדר (איור 3). אורך הגל יכול להשתנות מעט בתוך החדר, אך באופן כללי תבניות דומות. קצות החדר צריך לא לשמש להשוואות כמותיות, ממברנות כי הטופס על הדבק UV נראה שיש לה מאפיינים שונים מאשר על הזכוכית על פני השטח (ראה איור 3C). ניתן לנתח את גלי המשטח הנוסע ידי עוצמת לאורך כיוון התפשטות (איור 3B). תוך המוח פלורסצנטיות מישורים די מהר מ בחוד החנית של הגל, ואז יורדת בחדות בקצה נגרר, זריחה שלי מגביר באופן ליניארי כמעט מההתחלה של גל המוח ומגיע המקסימאלית שלה אחרי המוח בקצה נגרר, איפה זה נופל במידה ניכרת6.
חלבון איכותי, האיכות של bilayers השומנים נתמך נמצא הקריטי ביותר עבור ארגון עצמי רגיל של MinCDE. מצד אחד אם הקרום נשטף גם יתר על המידה או המשטח שמתחת מנקים את ובכך טעונה בכוח רב מדי, חורים יכולים ליצור ממברנה (איור 6A, העליון). לעומת זאת אם הקרום לא נשטף כראוי או השטח המשמש כבסיס אינו מנקה/hydrophilized, שלפוחית ידבק הקרום או נזילות ממברנה ייחשף (איור 6A, התחתון). אפילו לא כמו לכאורה כמו בעת התבוננות קרום ישירות באמצעות ליפידים שכותרתו, בעיות אלו ניתן לזהות גם האות פלורסצנטיות המוח, כמו דפוסי אינם קבועים זריחה ב- מקסימה אינה הומוגנית אלא מכיל "חורים" או נקודות האור כפי שמוצג בחלונית האמצעית של איור 6A.
עבור הארגון עצמית גבירתי מוט בצורת מזערים PDMS ההליך מסוכם באיור4. פרוטוקול מספר שלבים לא צריך להיות חוזרות ונשנות, כמו חלבונים ושומנים הניתנים לשימוש חוזר. כאילו על שאינם בדוגמת מצעים, המצע הוא ניקה hydrophilized (על-ידי ניקוי פלזמה), ליפידית הנתמכות נוצר ב- PDMS ואת וזמינותו ארגון עצמי מוגדר באמצעי אחסון של 200 µL. כדי לבדוק כי קרום נאות הקימה ומארגן גבירתי עצמית על הקרום, עם תמונה של הצ'יימברס. כאשר קרום נאות נוצר, גבירתי טפסים רגיל בנסיעות גלי המשטח על פני PDMS בין מזערים בודדים עצמי מארגן גם בתחתית מזערים הגלים יכול באופן חופשי תעבור את כל השטח מכוסה קרום (איור 5A). לאחר הסרת מאגר, פני השטח בין התאים צריך לא להראות כל דפוסי גבירתי כציוד (איור 5B), כמו שזה צריך להיות יבש לחלוטין. אם גבירתי דפוסי עדיין זז, מאגר נוסף צריך להיות מוסר. החלבונים עכשיו מרותק microcompartments מוט בצורת PDMS את קרום לבושת ועל ידי אוויר על הממשק העליונה (איור 5C), שבו הם יארגן עצמית. בתנאים אלה שני החלבונים ניתן לבצע תנודות הקוטב-כדי-מוט כפי שמוצג באיור 5D. כמו חלק של המוח ושלי הוא תמיד מאוגד-ממברנה, גם במהלך הסרת מאגר, ריכוז לאחר הסרת מאגר אינם דומים קלט ריכוזים. בשל אפקט זה ריכוז גם משתנות בין מזערים בודדים על coverslip אותו כפי שהם תלויים המיקום של הדפוסים לפני הסרת מאגר. ייצור פרוסות הסיליקון או PDMS לכייר מ כשהפחד סיליקון יכול לגרום מזערים שלם לא יכול לשמש לניתוח (איור 6B). יתר על כן, עקב המאגר להסרת מזערים עלולה להתייבש בתהליך, לפיכך, לא להיות כלולים ניתוח נוסף (איור 6B). כתוצאה מכך רק שבריר מזערים בתא אחד מראה תנודות הקוטב-כדי-העמוד הרצוי. כדי לנתח חלבון דינאמיקה של מזערים, kymograph ניתן להשיג על ידי ציור מבחר מעל המבנה כולו (איור 5E). בעת MinCDE נעים מן הקוטב-אל-עמוד, מינק והנפש יציג הדרגתי ריכוז זמן ממוצע עם ריכוז מרבי בקטבים תא וריכוז מינימלי באמצע התא (איור 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> איור 1: מרחביות-דף מציג את המוצרים הסופיים של חלבון purifications. מדעתו (33.3 kDa), eGFP-מדעתו (60.1 kDa), mRuby3-מדעתו (59.9 kDa), שלו-שלי (13.9 kDa) שלו-מינק (28.3 kDa) מוצגים לפי סדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> איור 2: זרימת תהליך דיאגרמה מציג את השלבים בודדים והתזמון של הפרוטוקול עבור ארגון עצמי על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers (שלבים 1-6). תיבות מקווקווים מציינים כי אחת מתוך שתי אפשרויות אלה יכולים לשמש לניקוי. חיצים מסומן על ידי חוגים מציינים היכן הפרוטוקול ניתן להשהות, חודשה מאוחר יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> איור 3: הדמיה של גבירתי assay מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית- A) מין רגיל ספירלה, באיזה מהירות התפשטות הגל, עוצמת מגרש, מהירות ניתן לקבל מדידות. ריכוזים בשימוש: מיקרומטר 0.6 אכפת לך (30% eGFP-נפש), מיקרומטר 1.8 שלו-שלי (30% שלו-שלי-Alexa647) B) למשל מגרש בעוצמה מנורמלת עבור האזור המסומן בא C) סקירה של הקאמרית assay כולו (סרגל קנה מידה: 1 מ מ, באותו ריכוז חלבון כמו לעיל). ספירלות הפיכת הכיוונים כמו גם דפוסי היעד יכול להיות שנצפו. האזור המוגדל מראה כיצד תבניות גל שונה ב- UV-הדבק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> איור 4: זרימת תהליך דיאגרמה מציג את השלבים בודדים והתזמון של הפרוטוקול עבור ארגון עצמי של מוט בצורת מזערים (שלבים 1-5, 7, 8). תיבות אפורים מציינים היכן המוצרים הניתנים לשימוש חוזר של צעדים הפרוטוקול על השומנים נתמכים שאינם בדוגמת bilayers. חיצים מסומן על ידי חוגים מציינים היכן הפרוטוקול ניתן להשהות, חודשה מאוחר יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> איור 5: תוצאות נציג גבירתי דפוס-צורה מוט בצורת microcompartments PDMS. A) גבירתי לארגן עצמית על פני PDMS להרכיב נוסע גלי המשטח (1 מיקרומטר אכפת (30% EGFP-נפש), 2 מיקרומטר שלי ושל 2.5 מ מ ATP). B) לאחר המאגר הוא הוריד את הגובה של מזערים, ארגון עצמי חלבון עוצר על משטח מישורי בין microcompartments. C) סכמטי של microcompartment בצורת מוט אחד. D) להחליפן בתמונות של גבירתי תנודות הקוטב-אל-עמוד לאחר הסרת מאגר. E) Kymograph של תנודות לאורך הקו המסומן מוצג ברה). F) תמונה ופרופיל של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הממוצע של הזמן-סדרת שמוצג D) מציג בבירור את המילוי ההדרגתי של חלבון מקסימלי-microcompartment הפולנים, מינימלי-התיכון תא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> איור 6: דוגמאות של תוצאות שליליות ניסיוני. A) יתר שטף ממברנות לצבור חורים, בזמן ההכנות שלפוחית שיוצרת ויצירות השומנים להוביל דבק שלפוחית. הלוחות מרכז שני מציגים שילוב של בעיות וגם איך הם הופכים גלויים, כאשר תנודות Min. ממברנות היו בלוחיות 0.05% Atto655-סמים. (גודל ברים: 50 מיקרומטר) B) הדף פאנל: התייבש microcompartments יכולה להיגרם על ידי הסרת מאגר מדי, או כאשר המאגר מתאדה לאורך זמן. פאנל התחתונה: תאים לא שלמים יכולים להיווצר במהלך ייצור פרוסות או דפוס PDMS. (גודל ברים: 30 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
קובץ משלים 1: מפת פלסמיד מדעתו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ משלים 2: פלסמיד מפת EGFP-מדעתו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
קובץ משלים 3: פלסמיד מפת mRuby3-מדעתו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הקבצים המשלימים 4: מפת פלסמיד שלו-שלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הקבצים המשלימים 5: מפת פלסמיד MinC שלו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
הקבצים המשלימים 6: קובץ ה-CAD עבור סיליקון וופל של מוט בצורת microcompartments. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ארגון התא והממברנות, למשל, איזה תפקיד ממלאים רמזים גיאומטריים בתהליך. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת שליטה מדויקת על כל ההיבטים המשפיעים על היווצרות דפוסים, כגון ריכוזי חלבון. כדי להתחיל, צור שלפוחיות מרובות שכבות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כעת, הקפיאו והפשירו את השומנים במשך שבעה עד 10 מחזורים, על ידי הכנת עם מים בטמפרטורה של 70 עד 99 מעלות צלזיוס על פלטה חמה, כמו גם מיכל המכיל חנקן נוזלי. החזיקו את הבקבוקון בחנקן נוזלי בעזרת פינצטה גדולה עד שהחנקן מפסיק לרתוח. לאחר מכן העבירו את הבקבוקון למים חמים עד להפשרה מלאה של התמיסה.חזור על שלבים אלה עד שתערובת השומנים נראית צלולה לעין, בהתאם לתערובת. לאחר מכן, הרכיבו מכבש שומנים ושטפו מראש את המערכת עם מאגר Min. הוציאו את תערובת השומנים בין 35 ל-41 פעמים דרך קרום בגודל נקבוביות של 50 ננומטר.הקפד לסיים במספר אי זוגי של מעברים כדי למנוע אגרגטים שמעולם לא חצו את הממברנה. מחלקים כיסויי זכוכית על צלחת פטרי מזכוכית הפוכה או משטח אינרטי אחר. בעזרת פיפטה מזכוכית, הוסף שבע טיפות של חומצה גופרתית מרוכזת למרכז כל כיסוי.לאחר מכן הוסף שתי טיפות של מי חמצן 50% לאמצע טיפות החומצה. מכסים את התגובה ודוגרים לפחות 45 דקות. כעת, הרם את הכיסויים בנפרד באמצעות פינצטה ושטוף את החומצה במים טהורים במיוחד.הנח את הכיסויים השטופים במחזיקי טפלון או במכשיר הובלה דומה. כעת שטפו כל כיסוי בהרחבה במים טהורים במיוחד וייבשו את המשטח בגז בלחץ. סמן את הצד הנקי של הכיסוי בטוש קבוע.כדי להרכיב את החדר, ראשית חתכו והשליכו את המכסה ואת החלק החרוטי של צינור תגובה של 0.5 מיליליטר בעזרת מספריים חדים. לאחר מכן מרחו דבק UV על השפה העליונה של הצינור והפיצו את הדבק באופן שווה באמצעות קצה פיפטה. הדביקו את הצינור הפוך לצד הנקי של הכיסוי.לבסוף, רפאו את דבק ה-UV על ידי הנחת תאים מרובים מתחת למנורת 360 ננומטר או LED למשך חמש עד 15 דקות. להיווצרות דו-שכבתית נתמכת של שומן, מחממים גוש חום ל-37 מעלות צלזיוס ודוגרים שני צינורות תגובה של מיליליטר עם מאגר Min או SLB בצינור אחד לכל תא. נשפו חנקן לתוך התאים המורכבים והנרפאים כדי להסיר אבק או חלקיקים אחרים שאולי שקעו במהלך הריפוי וההרכבה של UV.לאחר מכן, הנח את התאים על גוש החום. יש לדלל כמות של 20 מיקרוליטר של שומנים שקופים עם 130 מיקרוליטר של מאגר Min, ולבנות ריכוז עבודה של 0.53 מיליגרם למיליליטר. הוסף 75 מיקרוליטר מתערובת השומנים לכל תא.כעת, הגדר טיימר לשלוש דקות. במהלך זמן הדגירה, השלפוחיות מתפוצצות על משטח הזכוכית ההידרופילית, ומתמזגות ליצירת SLB קוהרנטי. לאחר שחלפו 60 שניות, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר Min לכל תא.לאחר 120 השניות הנותרות, שטפו כל תא על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר Min או SLB, צנרת בזהירות למעלה ולמטה כמה פעמים, הסרה והוספת עוד 200 מיקרוליטר. לאחר שכל תא נשטף פעם אחת, המשך לשטוף היטב את החדר הראשון עד ששני מיליליטר החיץ נגמרים. שטיפה של שכבות דו-שכבתיות נתמכות של שומנים זקוקה לניסיון מסוים כדי לשכלל את היקף התנועות בתא, ולמצוא את עוצמת הכביסה הנכונה.כדי לייצר מיקרו-מבנים PDMS מפרוסות סיליקון מעוצבות, השתמש תחילה בכוס פלסטיק לשקילת 10 גרם בסיס PDMS וגרם אחד של PDMS crosslinker. השתמש במכשיר ערבוב כדי לערבב ולהסיר את תערובת ה-PDMS. כעת, השתמש בקצה פיפטה כדי להפיל כמות קטנה של PDMS ישירות על המבנה על פרוסת הסיליקון.הנח מיד כיסוי 1 על טיפת ה-PDMS וקח את הקצה העליון של קצה פיפטה נקי כדי ללחוץ בעדינות את החלקת הכיסוי על פרוסת הסיליקון. ה-PDMS צריך להתפשט דק בין הכיסוי לפרוסת הסיליקון. הכניסו את הוופל עם הכיסויים לתנור ורפא את ה-PDMS למשך שלוש עד ארבע שעות, או למשך הלילה, בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הוציאו את הוופל מהתנור ותנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר. בעזרת סכין גילוח, הסר בזהירות את הכיסוי עם ה-PDMS המצורף מפרוסת הסיליקון. כעת, חבר תא פלסטיק ל-PDMS כפי שתואר קודם לכן עבור זכוכית.קח את הכיסויים עם תא מחובר והניח במנקה פלזמה עם חמצן כגז התהליך. נקה את הכיסויים בפלזמה. בעבודה זו נעשה שימוש בהספק של 30% ולחץ חמצן של 0.3 מיליבר למשך דקה אחת.כעת, הכינו SLB בתא כפי שתואר קודם לכן על זכוכית. כדי לבצע את בדיקת הארגון העצמי, התאם את נפח המאגר בתא ל-200 מיקרוליטר של מאגר Min, מינוס כמות החלבון ותמיסת ה-ATP. לאחר מכן מוסיפים MinD, שכותרתו MinD, MinE, ואם רוצים, MinC, ומערבבים בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג.כעת, הוסף 2.5 מילי-מולרי ATP כדי להתחיל את הארגון העצמי של MinDE. במהלך 10 עד 30 הדקות הבאות, בדוק אם יש היווצרות דפוס MinDE רגילה ומיקרו-מבנים שנוצרו כהלכה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאשר נוצרו דפוסי MinDE רגילים, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה פעמיים כדי לערבב את הרכיבים.הסר את החלק הארי של המאגר באמצעות פיפטה של 100 מיקרוליטר, ולאחר מכן הסר בזהירות את השאר באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר. כדי לאפשר זמני הדמיה ארוכים יותר, חבר חתיכת ספוג לחה בתוך החדר. ודא שהספוג אינו נוגע במשטח הכיסוי.סגור מיד את החדר עם מכסה כדי למנוע ייבוש של המאגר הנותר במיקרו-מבנים. לפני הדמיה של המיקרו-מבנים, ודא שהארגון העצמי של MinDE נעצר על גבי המיקרו-מבנה של PDMS בזמן שהחלבונים במיקרו-חללים מתנודדים. בסרטון מייצג זה, הדמיה בצבע כפול מראה כיצד MinD ו-MinE מתארגנים בעצמם לגלי שטח נעים התואמים דפוסים ספירליים על שכבות דו-שכבתיות ליפידים נתמכות.כאן, הדמיה בצבע יחיד מראה MinD ו-MinE מבצעים תנודות קוטב-לקוטב במיקרו-מבנים של PDMS. התנודות קובעות שיפוע ריכוז MinD ממוצע בזמן עם ריכוז מקסימלי בקטבי התא וריכוז מינימלי באמצע התא. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מעקב אחר חלקיק בודד, על מנת לקבוע קינטיקה של קשירת הממברנה וזמני השהייה.אל תשכח שעבודה עם תמיסת פיראנה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר היווצרות סינפסות חיסוניות בין תאי T אנושיים ראשוניים לבין דו-שכבות שומנים נתמכות (SLB). חלבוני פני השטח של תאי T מתקשרים עם ליגנדות בהתאמה המשותקות על SLB כדי ליצור סינפסה חיסונית, ואחריה תנועה של גרגירים ליטיים לכיוון הסינפסה, אשר מומחשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

טכניקת מבחנה לחקר אינטראקציה של תאי T עם דו-שכבות שומנים מישוריות נתמכות

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים מרביים הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes, פיוז'ן של proteoliposomes כזה עם היעד bilayers השומנים למסירה ללא אבקת החלבונים האלה ממברנה לתוך bilayer postfusion. השילוב של גישות אלה מאפשר הרכבה מהירה וקלה לשליטה של מערכות ממברנה רב רכיבים מורכבים.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

נתמכת solid, נטול חלבון, כפול פוספוליפיד bilayer ממברנות (DLBM) יכולה להיהפך מורכב ודינמי, השומנים nanotube רשתות, יכול לשמש מלמטה למעלה 2D, דגמי רשתית תוך-פלזמית.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

היתוך מיטוכונדריאלי הוא תגובה הוםוסטטית חשובה הבסיסית לדינמיקה המיטוכונדריאלית. מתואר כאן היא מערכת איסוף חוץ תוך כדי לימוד היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שיכול לפתור רצועה קרום, עגינה, המיתוך, ופתיחת נקבוביות. הרב-תכליתיות של גישה זו בחקר מערכות קרום התא נדון.

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

שחזור ללא תאים היה כלי מרכזי להבנת הרכבת השלד של הציטוסקלטון, והעבודה בעשור האחרון ביססה גישות לחקר דינמיקת ספטין במערכות מינימליות. מוצגות כאן שלוש שיטות משלימות לצפייה בהרכבת ספטין בהקשרים שונים של ממברנות: דו-תאיים מישוריים, תומכים כדוריים ותמיכות מוטות.

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

כאן, מתואר פרוטוקול ליצירת תבניות חלבון מווסתות אור והפיכות עם דיוק מרחבי-זמני גבוה בקרומי שומנים מלאכותיים. השיטה מורכבת מפוטואקטיבציה מקומית של החלבון iLID (דימר משופר המושרה באור) המשותק על קרומי המודל אשר, תחת אור כחול, נקשר לחלבון השותף שלו ננו (SspB מסוג פראי).

תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל

חקור ארגון עצמי של חלבוני MinD ו-MinE על שכבות שומן נתמכות במיקרו-תאים מוגדרי גאומטריה. שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת בתנאי היווצרות דפוסים לחקר דינמיקת ממברנות.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

גלה סרטונים נוספים