במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ארגון התא והממברנות, למשל, איזה תפקיד ממלאים רמזים גיאומטריים בתהליך. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת שליטה מדויקת על כל ההיבטים המשפיעים על היווצרות דפוסים, כגון ריכוזי חלבון. כדי להתחיל, צור שלפוחיות מרובות שכבות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כעת, הקפיאו והפשירו את השומנים במשך שבעה עד 10 מחזורים, על ידי הכנת עם מים בטמפרטורה של 70 עד 99 מעלות צלזיוס על פלטה חמה, כמו גם מיכל המכיל חנקן נוזלי. החזיקו את הבקבוקון בחנקן נוזלי בעזרת פינצטה גדולה עד שהחנקן מפסיק לרתוח. לאחר מכן העבירו את הבקבוקון למים חמים עד להפשרה מלאה של התמיסה.

חזור על שלבים אלה עד שתערובת השומנים נראית צלולה לעין, בהתאם לתערובת. לאחר מכן, הרכיבו מכבש שומנים ושטפו מראש את המערכת עם מאגר Min. הוציאו את תערובת השומנים בין 35 ל-41 פעמים דרך קרום בגודל נקבוביות של 50 ננומטר.

הקפד לסיים במספר אי זוגי של מעברים כדי למנוע אגרגטים שמעולם לא חצו את הממברנה. מחלקים כיסויי זכוכית על צלחת פטרי מזכוכית הפוכה או משטח אינרטי אחר. בעזרת פיפטה מזכוכית, הוסף שבע טיפות של חומצה גופרתית מרוכזת למרכז כל כיסוי.

לאחר מכן הוסף שתי טיפות של מי חמצן 50% לאמצע טיפות החומצה. מכסים את התגובה ודוגרים לפחות 45 דקות. כעת, הרם את הכיסויים בנפרד באמצעות פינצטה ושטוף את החומצה במים טהורים במיוחד.

הנח את הכיסויים השטופים במחזיקי טפלון או במכשיר הובלה דומה. כעת שטפו כל כיסוי בהרחבה במים טהורים במיוחד וייבשו את המשטח בגז בלחץ. סמן את הצד הנקי של הכיסוי בטוש קבוע.

כדי להרכיב את החדר, ראשית חתכו והשליכו את המכסה ואת החלק החרוטי של צינור תגובה של 0.5 מיליליטר בעזרת מספריים חדים. לאחר מכן מרחו דבק UV על השפה העליונה של הצינור והפיצו את הדבק באופן שווה באמצעות קצה פיפטה. הדביקו את הצינור הפוך לצד הנקי של הכיסוי.

לבסוף, רפאו את דבק ה-UV על ידי הנחת תאים מרובים מתחת למנורת 360 ננומטר או LED למשך חמש עד 15 דקות. להיווצרות דו-שכבתית נתמכת של שומן, מחממים גוש חום ל-37 מעלות צלזיוס ודוגרים שני צינורות תגובה של מיליליטר עם מאגר Min או SLB בצינור אחד לכל תא. נשפו חנקן לתוך התאים המורכבים והנרפאים כדי להסיר אבק או חלקיקים אחרים שאולי שקעו במהלך הריפוי וההרכבה של UV.

לאחר מכן, הנח את התאים על גוש החום. יש לדלל כמות של 20 מיקרוליטר של שומנים שקופים עם 130 מיקרוליטר של מאגר Min, ולבנות ריכוז עבודה של 0.53 מיליגרם למיליליטר. הוסף 75 מיקרוליטר מתערובת השומנים לכל תא.

כעת, הגדר טיימר לשלוש דקות. במהלך זמן הדגירה, השלפוחיות מתפוצצות על משטח הזכוכית ההידרופילית, ומתמזגות ליצירת SLB קוהרנטי. לאחר שחלפו 60 שניות, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר Min לכל תא.

לאחר 120 השניות הנותרות, שטפו כל תא על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר Min או SLB, צנרת בזהירות למעלה ולמטה כמה פעמים, הסרה והוספת עוד 200 מיקרוליטר. לאחר שכל תא נשטף פעם אחת, המשך לשטוף היטב את החדר הראשון עד ששני מיליליטר החיץ נגמרים. שטיפה של שכבות דו-שכבתיות נתמכות של שומנים זקוקה לניסיון מסוים כדי לשכלל את היקף התנועות בתא, ולמצוא את עוצמת הכביסה הנכונה.

כדי לייצר מיקרו-מבנים PDMS מפרוסות סיליקון מעוצבות, השתמש תחילה בכוס פלסטיק לשקילת 10 גרם בסיס PDMS וגרם אחד של PDMS crosslinker. השתמש במכשיר ערבוב כדי לערבב ולהסיר את תערובת ה-PDMS. כעת, השתמש בקצה פיפטה כדי להפיל כמות קטנה של PDMS ישירות על המבנה על פרוסת הסיליקון.

הנח מיד כיסוי 1 על טיפת ה-PDMS וקח את הקצה העליון של קצה פיפטה נקי כדי ללחוץ בעדינות את החלקת הכיסוי על פרוסת הסיליקון. ה-PDMS צריך להתפשט דק בין הכיסוי לפרוסת הסיליקון. הכניסו את הוופל עם הכיסויים לתנור ורפא את ה-PDMS למשך שלוש עד ארבע שעות, או למשך הלילה, בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הוציאו את הוופל מהתנור ותנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר. בעזרת סכין גילוח, הסר בזהירות את הכיסוי עם ה-PDMS המצורף מפרוסת הסיליקון. כעת, חבר תא פלסטיק ל-PDMS כפי שתואר קודם לכן עבור זכוכית.

קח את הכיסויים עם תא מחובר והניח במנקה פלזמה עם חמצן כגז התהליך. נקה את הכיסויים בפלזמה. בעבודה זו נעשה שימוש בהספק של 30% ולחץ חמצן של 0.3 מיליבר למשך דקה אחת.

כעת, הכינו SLB בתא כפי שתואר קודם לכן על זכוכית. כדי לבצע את בדיקת הארגון העצמי, התאם את נפח המאגר בתא ל-200 מיקרוליטר של מאגר Min, מינוס כמות החלבון ותמיסת ה-ATP. לאחר מכן מוסיפים MinD, שכותרתו MinD, MinE, ואם רוצים, MinC, ומערבבים בעדינות את הרכיבים על ידי פיפטינג.

כעת, הוסף 2.5 מילי-מולרי ATP כדי להתחיל את הארגון העצמי של MinDE. במהלך 10 עד 30 הדקות הבאות, בדוק אם יש היווצרות דפוס MinDE רגילה ומיקרו-מבנים שנוצרו כהלכה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאשר נוצרו דפוסי MinDE רגילים, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה פעמיים כדי לערבב את הרכיבים.

הסר את החלק הארי של המאגר באמצעות פיפטה של 100 מיקרוליטר, ולאחר מכן הסר בזהירות את השאר באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר. כדי לאפשר זמני הדמיה ארוכים יותר, חבר חתיכת ספוג לחה בתוך החדר. ודא שהספוג אינו נוגע במשטח הכיסוי.

סגור מיד את החדר עם מכסה כדי למנוע ייבוש של המאגר הנותר במיקרו-מבנים. לפני הדמיה של המיקרו-מבנים, ודא שהארגון העצמי של MinDE נעצר על גבי המיקרו-מבנה של PDMS בזמן שהחלבונים במיקרו-חללים מתנודדים. בסרטון מייצג זה, הדמיה בצבע כפול מראה כיצד MinD ו-MinE מתארגנים בעצמם לגלי שטח נעים התואמים דפוסים ספירליים על שכבות דו-שכבתיות ליפידים נתמכות.

כאן, הדמיה בצבע יחיד מראה MinD ו-MinE מבצעים תנודות קוטב-לקוטב במיקרו-מבנים של PDMS. התנודות קובעות שיפוע ריכוז MinD ממוצע בזמן עם ריכוז מקסימלי בקטבי התא וריכוז מינימלי באמצע התא. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מעקב אחר חלקיק בודד, על מנת לקבוע קינטיקה של קשירת הממברנה וזמני השהייה.

אל תשכח שעבודה עם תמיסת פיראנה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.