Name: השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: למדו כיצד להעריך פוטנציאל ממאיר של תאי דם מונדסים גנטית באמצעות השתלת תאי גזע המטופויטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפקודי של תאי גזע סרטניים וזיהוי תאים מייזמי מחלה בתסמונות מיאלודיספלסטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לסרטן, מכון הבריאות הלאומי (מענק המספרים זיא SC 010378 ו לפנה ס 010983).

בעלי חיים בהליכים המתוארים במאמר זה אושרו על-ידי המכון הלאומי לסרטן ב Bethesda חיה אכפת והוועדה שימוש ולאחר לציית למדיניות הנכלל מדיניות שירות בריאות הציבור על טיפול אנושי, שימוש של חיות מעבדה, חוק צער בעלי חיים, המדריך עבור טיפול והשתמש של חיות מעבדה.
1. תא הכנה
<ol><li>מח עצם האיסוף nucleated תא (BMNC)<ol>
<li>השתמש רק סטרילי חומרים. לחטא כלי שמיש מחדש באמצעות של תא לחץ אדים. לרכוש את מחטי מזרקים, וואר פלסטיק במיכלים סטריליים לשימוש יחיד. ביצוע מניפולציות כל חיה ותא Class II, סוג A2 הקבינט בטיחות ביולוגית.</li>
		<li>להכין BMNCs ב mL 14 סיבוב התחתית התחתונה המכיל 3 מ"ל של HF2 (של האנק מאוזנת תמיסת מלח בתוספת 2% סרום שור עוברית).</li>
		<li>המתת חסד C57Bl6 בדרך כלל 2-6 חודשים, גיל התורם עכברים (חיובי עבור CD45 אלל CD45.2), באמצעות תא2 CO.</li>
		<li>לחטא את הגווייה העכבר ע י ריסוס אתנול 70% על פני הגוף כולו עם בקבוק ספריי. לקלף את העור מן הרגליים, מהאגן עד הקרסול.</li>
		<li>הסר את femora ואת tibiae הגווייה באמצעות מספריים סטרילי (ישר, חד/חד, 11.5 ס מ) וחדים (Graefe, משונן, עצה 0.8 מ מ רוחב). חתוך את השרירים המחוברים באופן ברור.</li>
		<li>חותכים את הקצוות לקרע, בשוקיים עם המספריים. מחזיקים בשוקיים עם מלקחיים, הכנס מזרק 27-מד 3 מ"ל המכילה 2.5 מ של HF2 לתוך חלל מח הטיביאלי בקצה הדיסטלי של עצם השוקה (קרסול). לרוקן את התאים במח העצם של עצם השוקה באמצעות לחץ עדין לתוך mL 14 סיבוב התחתית התחתונה.<ol>
<li>חזור על עצם השוקה אחרים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>חותכים את הקצוות הפרוקסימלית ו דיסטלי של עצם הירך עם מספריים. סומק חלל מח עצם הירך על ידי החדרת מחט 20 גאייג-לצרף מזרק 3 מ"ל המכילה 2.5 מ של HF2 בתוך הסוף דיסטלי של חלל מח עצם הירך והחלת לחץ עדין על המזרק.<ol>
<li>חזור על עצם הירך אחרים, איסוף כל מח עצם בשני tibiae, femora ב mL 14 באותו סיבוב התחתית התחתונה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לפזר את המסה מח על ידי כ רפה בעברית למעלה ולמטה מספר פעמים עם 20 גאייג-באותה המחט מחוברת המזרק 3 מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נוגדן מכתים של BMNC<ol>
<li>הרוזן BMNC. הוסף 20 µL של פתרון חומצה אצטית 3% µL 20 של ההשעיה BMNC שנוצר בשלב 1.1.8. לאחר מכן, לספור באמצעות hemocytometer של מיקרוסקופ הפוכה.</li>
		<li>גלולה של BMNC על ידי צנטריפוגה עדין ב g x 450 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר עם HF2 באמצעות 90 µL לכל 107 תאים ולהוסיף 10 µL של נוגדנים נגד השושלת biotinylated קוקטייל התליה תא.</li>
		<li>לאחר המקננת כעשרים דקות ב 4 ° C, לשטוף את התאים ויטראז'ים עם 3 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).</li>
		<li>Resuspend את BMNC עם µL 100 של HF2 לכל 107 תאים. להוסיף 2 µL של allophycocyanin (APC) מצומדת נוגדן אנטי ביוטין כדי התליה תא, ואחריו הדגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
		<li>לשטוף את BMNC ויטראז'ים עם 3 מ"ל של PBS, resuspend את BMNC עם HF2 בתוספת 0.2 µg/mL של יודיד propidium (PI) עבור מיון תא cytometry זרימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow cytometry מיון תא של BMNC<ol>
<li>כיילו סדרן התא cytometry זרימה. למטב את כל צינורות האופטיקה (PMTs), פיזור ופרמטרים פלורסצנטיות באמצעות תאים וללא רבב ולהגדיר בתוך הטווח. ליניארית של כל גלאי.</li>
		<li>להכין וללא רבב, מוכתם PI, APC שכותרתו שושלת התאים קוקטייל במקביל מהשלב 1.2. ניתוח ספקטרלי לפיצוי.</li>
		<li>תפלה כפיל תאים על-ידי gating רציפים של FSC-H נגד האס-H, 640-האס-A לעומת 640-האס-H ו- 640-האס-S לעומת 640-האס-וו</li>
		<li>הכללת תאים nonviable באמצעות PI נרגש 561 ננומטר, פליטה שנאסף עם מסנן לעבור הלהקה 614/20. לרגש השושלת APC המסומנת תאים על פליטת nm ולאסוף 640 671/30 מסנן.</li>
		<li>להקליט פלורסצנטיות ערכים כמו מתח גובה ולאסוף לפחות 100,000 אירועים בקבצי נתונים מצב הרשימה כדי להמחיש את אוכלוסיות ימוין.</li>
		<li>חישוב פיצויים ספקטרלי לאחר שרכשה שלוש דוגמאות של 10,000 תאים עבור הגורמים הבאים: ללא תווית תאים PI שכותרתו התאים, נוגדנים נגד השושלת קוקטייל מצומדת עם APC שכותרתו תאים.</li>
		<li>להגדיר שלושה אזורים כדי למיין השושלת שלילי (LN), שושלת היוחסין חיובי (LP) עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית דים (LP1), והאוכלוסייה LP עם פלורסצנטיות בהיר (LP2) לתוך צינורות 5 מ"ל המכילה 0.5 מיליליטר 10% FBS מדיה.</li>
		<li>סוג תאים באמצעות טיפה אחת אופפים ולטהר את מצב הביטול.</li>
		<li>מבצע ניתוח מיון פוסט עם תאים סך 1,000 כל מדגם ממוינים כדי לאשר את הטוהר ואת הכדאיות של תאים ממוינים.</li>
		<li>איסוף תאים ממוינים על ידי צנטריפוגה-g x 450 עבור 5 דקות ב 4 ° C, resuspend תא גלולה עם 0.5 מ של HF2.</li>
		<li>לאשר מספר עם hemocytometer ו- Trypan blue ממוינים התא. התאם מספר תאים עם HF2 עבור השתלת. הערה: קשת רחבה של אוכלוסיות BMNC ניתן לבודד עבור השתלת באמצעות שילובים נוספים של נוגדנים fluorochrome מצומדת בשלב 1.2.2 לעיל.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הנמען עכברים והכנה השתלת תא גזע Hematopoietic (HSCT)
<ol><li>הכנה של השתלת הנמענים<ol>
<li>לשמור על וטרינרי ועל גידול טיפול congenic הנמען עכברים (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) במתקן פתוגן מסוים (SPF) חינם בעלי חיים.</li>
		<li>טיהור מניעתי של המסלול במערכת העיכול, מספקים במים סטריליים המכיל 100 מ ג/ליטר של ציפרופלוקסאצין לנמענים עבור 7 ימים לפני מנה קטלנית (9 Gy) הקרנה, לשמור למשך 14 ימים בעקבות הקרנה.</li>
		<li>מספקים של הקרנה מנה קטלנית (9 Gy) ממקור מדעי המחשב כדלקמן. השתמש מפעיל מיומן, מוסמך במדעי המחשב. להגדיר את המכשיר מקור Cs לספק 70 cGy/min גמא גופית. מקום 10 עכברים בעל אישית מעוצבת והכנס את המחזיק אל החדר בעוצמה. לספק 9 Gy גופית 13 דקות ולחזור העכברים לכלובים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתלת תא גזע hematopoietic<ol>
<li>מערבבים פראי סוג (WT) BMNC מ- congenic הנמען עכבר (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) במינון תא של 2 x 105 תאי עכבר עם 2 עד 5 x 104 תאים של הבדיקה מטוהרים ש-BMNC מוכן עם לזרום cytometry מיון כמו שמתואר 1.3 לעיל. מערבבים תאים במזרק אותו. הערה: BMNC WT לספק קרינה ממעט-אפקט העכבר הנמען, לאפשר להישרדותה של העכבר הנמען אם התאים הבדיקה אינם תומכים hematopoiesis. BMNC WT השתמשו בסוג זה של הניסוי אקספרס אלל CD45.1, וניתן ובכך מכובד מתאי הבדיקה באמצעות נוגדנים אשר להפלות בין CD45.1 לבין CD45.2. התאים WT מוניטור מכונים "המסייע תאים", "קרינה ממעט תאים" או "המתחרה תאים".</li>
		<li>לכוון את עוצמת הקול של התא תערובת כדי µL 200 לכל נמען באמצעות HF2 סטריליות להקלה על הזריקה.</li>
		<li>השתלות של תערובות תא ועד לקרינה אולם עכברים נמען באמצעות הזנב תוך ורידי וריד להזרקה באמצעות מזרק 1 מ"ל ואת מחט בקוטר 28, בתוך 24 שעות של הקרנה. מקום זנב העכבר תחת מנורת חימום, כמו חום מוביל אל הזנב התרחבות וריד. הערה: המתת חסד כל העכברים הנמען בסוף המחקר ולהעריך את התקדמות המחלה על ידי necropsy, היסטולוגיה cytometry זרימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. engraftment Assay באמצעות Cytometry זרימה
<ol><li>כדי להעריך את התורם תא engraftment, לאסוף דם היקפיים (PB) העכברים הנמען-בשבוע ה-6, בשבוע ה-12, ובשבוע ה-16 לאחר ההשתלה.</li>
	<li>לחמם את הנמענים בכלוב עם מנורת החימום עבור 1 דקות והניחו העכבר לתוך restrainer.</li>
	<li>לחתוך את וריד הזנב עם איזמל (להב 10, ידית האזמל #3) ולאסוף µL 100 של PB לכל נמען באמצעות צינור microcapillary המכילה EDTA בתור נוגדת קרישה.</li>
	<li>לחלק את PB שנאספו aliquots שווה שני על ידי הצבת 50 µL צינור microcentrifuge סטרילי. השתמש aliquot אחד עבור ספירת אוטומטיות דם (CBC) (מתבצעות בתוך ליבת Histopathology NCI) לשימוש נוגדן מכתימה את aliquot השנייה, flow cytometry.</li>
	<li>כדי לזהות engraftment התורם cytometry זרימה, lyse בתאי הדם האדומים (RBC) על-ידי הוספת 1 מ"ל של RBC היפוטוניק פירוק מאגר (8.29 g/L של NH4קלרנית, 1 g/L של KHCO3, 0.037 g/L של נה2EDTA, pH 7.2) µL 50 של PB שנאספו. מערבולת הדגימה כדי לערבב דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Centrifuge את lysed PB ב 4,600 x g עבור 1.5 מינימלית בקפידה וארוקן את תגובת שיקוע ולמחוק.</li>
	<li>חלקית לשבש בגדר תא על-ידי בעדינות הקשה או "מצליף" בתחתית הצינורית. להוסיף מ 1.3 ל- PBS לתוך בגדר הממוקמים צינור צנטריפוגה ב g 4,600 x עבור 1.5 מינימלית בקפידה וביופסיה, להשליך תגובת שיקוע.</li>
	<li>לשבש בגדר תא על-ידי הקשה או להכות אותך, וכן להוסיף 200 µL של HF2 בתוספת 5% עכברוש לנסיוב בגדר התא.</li>
	<li>מוסיפים נוגדן anti-CD45.2 (1 µL) מצומדת עם allophycocyanin (APC) כדי התליה תא. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות, בקצרה מערבולת התערובת.</li>
	<li>לאחר ההכתמה, לשטוף את התאים פעמיים כמתואר לעיל, resuspend עם µL 400 של HF2 בתוספת 1 µg/mL של פאי.</li>
	<li>לאתר את engraftment באמצעות cytometer 4-צבע זרימה. לקבלת מידע נוסף על סוגי תאים בתוך הדם ההיקפיים על-ידי הוספת נוגדנים נוספים כדי לזהות סוגי תאים ספציפיים, כגון B או T לימפוציטים.</li>
	<li>רישום נתונים טורי engraftment באמצעות גיליון אלקטרוני כדי לאפשר ניתוח נוסף של נתונים.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
<li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+2015+Update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li>
<li>Heaney, M. L., Golde, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10341278">Myelodysplasia.</a> The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18467609">Myelodysplastic syndromes.</a> Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).</li>
<li>Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+features+of+myelodysplastic+syndromes%3A+results+from+regional+cancer+surveys+and+hospital-based+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics.</a> International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).</li>
<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
<li>Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98+gene+fusions+and+hematopoietic+malignancies%3A+common+themes+and+new+biologic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights.</a> Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXD13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. <a target="_blank" href="https://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/286455">Preleukemic acute human leukemia.</a> Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).</li>
<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

אין לנו לחשוף.

למרות MDS הפרעה בתאי גזע hematopoietic המשובטים, MDS "גזע", או תאים ייזום, לא עוד היה שאפיינו. אנחנו הפגינו בעבר כי MDS ניתן שיפותחו לעכברים WT באמצעות מח העצם של עכברים NHD13 מאת HSCT, המאופיין האנמיה, לויקופניה, נויטרופניה, ראיות מורפולוגיות של דיספלזיה15. בנוסף, מבחני איכלוס תחרותי מזוהה יתרון צמיחה של תאים ממח העצם NHD13 MDS. ממצאים אלה יחדיו, לרמוז קיומו של גזע MDS או תא ייזום. ניסויים נוספים נמצאים כעת בעיצומו, מכוון זיקוק immunophenotypic את המאפיינים של MDS ייזום תא15</su...

תסמונות Myelodysplastic (MDS) מייצגים קבוצה מגוונת של הפרעות במחזור הדם המשובטים מאופיין hematopoiesis לא יעילה, ראיות מורפולוגיות של דיספלסיה, נטייה לשינוי לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)1,2 3, ,4. Hematopoiesis לא יעיל מזוהה כמספר מעצר ההבשלה במח העצם, ותוצאות דם היקפיים cytopenias למרות במקרי מח עצם1,3. השכיחות של MDS הוערך בדרכים שונות כמו 2-12 מקרים לכל 100,000 אנשים מדי שנה בארצות הברית, השכיחות של MDS עולה עם הגיל, שהופך את תנאי חשוב להבין לאור הזדקנות האוכלוסייה בארה ב3, 5. למרות ברוב המקרים של MDS אין אטיולוגיה ברורה, בחלק מהמקרים MDS הם חשבו להיות עקב חשיפה לסוכנים genotoxic ידועים, לרבות ממיסים כמו בנזן, כימותרפיה לסרטן6.
בדרך כלל חולי MDS שרכשו מוטציות בגן התאים MDS7. למרות נדיר יחסית, מספר חולי MDS שרכשו translocations כרומוזומלית מאוזנת המערבים גנים כגון NUP98, EVI1, RUNX1 ו- MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). המעבדה שלנו יש עניין ארוכת שנים translocations כרומוזום, שכרוכים ג'ין NUP988. העכברים הטרנסגניים כך מפורשת transgene NUP98-HOXD13 (NHD13) מוסדר על ידי האמרגן Vav1, משפר אלמנטים להציג את כל התכונות העיקריות של MDS, כולל cytopenias דם היקפיים, ראיות מורפולוגיות של דיספלסיה, וטרנספורמציה ל AML9 .
למרות MDS זוהו למעלה מ-60 שנה10, נחשבים הפרעה בתאי גזע המשובטים, מאמצים engraft התא האנושי MDS בעכברים immunodeficient לא הצליחו במידה רבה, כי התאים MDS engraft גרוע11, 12,13,14 ו העכברים אינם מפתחים מחלה קלינית. במאמץ לזהות אילו תאים hematopoietic יכול לשדר MDS, אנחנו הפך למודל NHD13, והראה כי אנחנו יכולים engraft MDS כישות המחלה הראה את כל התכונות קרדינל של MDS האנושי, כולל cytopenias דם היקפיים, דיספלסיה, ו טרנספורמציה AML15. בדו ח זה, אנו מציגים את הפרטים הטכניים של ניסויים אלה, כמו גם גישות נוספות fractionate hematopoietic גזע ותאים קודמן (HSPC), בניסיון לזהות תאים ייזום-MDS.

<table><tbody><tr><td>צינור תחתון עגול 14 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>לונזה</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-CD45.2 Southern</td><td>Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT # A077-T044O</td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרק</td><td>מונו-ג'קט</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>מחט 27-G BD</td><td></td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>מחט 20-G</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>305176 קוקטייל שושלת</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT # 5170418221</td></tr><tr><td>נוגדנים נגד ביוטין</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT #</td></tr><tr><td>5171109046 1 מ"ל מזרק</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>מנורת חימום מזרק אינסולין</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>מכונת FACS</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 לייזרים, 5 גלאי צבע</td></tr><tr><td>מכשיר מיון FACS</td><td>בקמן קולטר</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 לייזרים, 23 פרמטרים, 6 מיון אוכלוסייה בו זמנית</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Irradiator</td><td>הטוב ביותר Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>צינור איסוף דם</td><td>RAM Scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>נמען עכברים</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>B6-LY5.1 / Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 עכברים</td><td>n/a</td><td>C57Bl / 6, CD45.2</td><td>מושבה מתוחזקת בצינור</td></tr><tr><td>תחתון עגול NIH 5 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

השימוש השתלת תא גזע hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

תסמונות Myelodysplastic (MDS) הם קבוצה מגוונת של תא גזע hematopoietic הפרעות המוגדרות על-ידי hematopoiesis לא יעילה, cytopenias דם היקפיים, דיספלסיה, נטייה לשינוי כדי לוקמיה חריפה. העכברים הטרנסגניים NUP98-HOXD13 (NHD13) מסכם את הדברים MDS האנושי במונחים של דם היקפיים cytopenias דיספלזיה, טרנספורמציה כדי לוקמיה חריפה. אנחנו בעבר הראו כי MDS יכול להיות מועבר מן עכבר מהונדסים עם MDS פראי-סוג הנמענים על-ידי משתילים MDS תאים במח העצם nucleated (BMNC). יותר מבין בבירור את התא MDS ממוצא, פותחו גישות להשתיל ספציפי, immunophenotypically מוגדרת hematopoietic קבוצות משנה. במאמר זה, אנו מתארים את תהליך בידוד משתילים אוכלוסיות ספציפיות של גזע hematopoietic, ובתאים. בעקבות ההשתלה, נתאר גישות כדי להעריך את היעילות של השתלת ויכולת ההתמדה של התאים MDS התורם.

אנו מראים דמויות נציג עבור התוצאות של מספר ניסויים. איור 1 מראה של cytometry זרימה נציג מיון הניסוי. במהלך התמיינות hematopoietic נורמלי, כמו התאים להיות מחויבים שושלת hematopoietic ספציפיים, הם רוכשים מגדיר-שושלת היוחסין סמני פני שטח התא, לאבד את פוטנציאל התחדשות עצמית. לכן, בעכברים פראי-סוג, התחדשות עצמית בתאי גזע מוגבל BMNC היוחסין-שלילי. בניסוי זה, אנחנו מיון BMNC ממח העצם NHD13 לתאי שושלת היוחסין-חיובית חיובי וגבוה שושלת היוחסין-שלילי, נמוכה. דייב תאים ו...

אנו מתארים את השימוש השתלת תא גזע hematopoietic (HSCT) כדי להעריך את פוטנציאל ממאיר של תאים מהונדסים גנטית hematopoietic. HSCT שימושית לצורך הערכת שונים תאים ממאירים hematopoietic ויוו , כמו גם יצירת קבוצה גדולה של עכברים עם תסמונות myelodysplastic (MDS) או לוקמיה להעריך טיפולים חדשניים.

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות בשיטה של שדה ממאירות על אפיון של תא ליזום ממאירות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת בסיס לניתוח תפקודי של תאי גזע סרטניים אלה. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב למקום שבו הטיפול של תסמונות myelodysplastic או MDS, כפי שהוא יכול לסייע בזיהוי של המחלה יוזם תאים.כדי להכין את הנמענים להעברה מאמצת, שבוע לפני ההשתלה לספק מים סטריליים בתוספת 100 מיליגרם לליטר של ציפרופלוקסאצין כדי con genic הנמען בעלי חיים במשך שבעה ימים במתקן מסוים, ללא פתוגן בעלי חיים. ביום השביעי, יש מאומן, מוסמך צסיום 17 מפעיל להגדיר את מכשיר מקור צסיום לספק 70 centigrayS של הקרנה גמא הגוף הכולל לדקה. מניחים 10 עכברים במחזיק מעוצב בהתאמה אישית.הכנס את המחזיק לתא ההקרנה, לספק 9 אפורים הכולל הקרנה הגוף ב 13 דקות. ואז להחזיר את החיות לכלובים שלהם. למחרת בבוקר, לרסס 70 אחוז אתנול על כל שניים עד שישה עש ישן C57 שחור שישה עכבר ולהשתמש מספריים כדי להסיר את העור מהאגן לקרסוליים.השתמש מדפים עם המספריים כדי להסיר את הירך ואת השוקה. חותכים בצורה נקייה את השרירים מהעצמות. חותכים את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים עבור השוקה ומרים השוקה אחת עם מלקעות.הכנס מזרק שלושה מיליליטר מצויד מחט 27 gage לתוך חלל מח העצם לשטוף את מח העצם לתוך צינור תחתון עגול 14 מיליליטר המכיל 2.5מיליליטרS של הנקס חיץ תמיסת מלח בתוספת 2% נסיוב חזיר עוברי או HF2. כאשר כל מח העצם נאסף, שאפו את הרקמה מספר פעמים דרך קצה מחט 20 gage כדי לפזר את מסת מח העצם לתוך השעיה אחת לספירה. כדי לתייג את תאי מח העצם הגרעינים, או BMNC, למיון זרימה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגליזציה ולהשעות מחדש את גלולה באחת פעמים עשרה עד BMNC השביעי לכל 90 microliters של ריכוז HF2.לאחר מכן, מוסיפים עשרה מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים ביוטיניילציה נגד שושלת להשעיית התא למשך 20 דקות דגירה ב-4 מעלות צלזיוס. ואחריו שטיפת צנטריפוגה בשלושה מיליליטר של PBS. להשעות מחדש את גלולה ב 100 microliters של HF2 לכל אחד פעמים עשר עד התאים השביעי.שנית, תייג את התאים עם שני מיקרוליטרים של נוגדן אנטי ביוטין גדיד APC. לאחר 20 מינואים בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור, לשטוף את התאים בשלושה מיליליטר של PBS טרי. להשעות מחדש את גלולה HF2 בתוספת 0.2 מיקרוגרם למיליליטר של יודיד פרופידיום על קרח.עכשיו לכייל את סדרן תא cytometry זרימה באמצעות תאים נגועים כדי למטב את כל צינורות photomultiplier, פיזור, ופרמטרים פלואורסצנטיים בתוך הטווח ליניארי של כל גלאי. לרכוש שלוש דגימות של 10, 000 תאים עבור תאים APC ללא תווית, PI שכותרתו ואנטי שושלת APC שכותרתו. בסוף המיון, לנתח 1, 000 תאים מכל מדגם כדי לאשר את הטוהר ואת הכדאיות של התאים ממוינים.תסובב את הדגימות בצנטריפוגה. ואז להשעות את כדורי ב 0.5 מיליליטר של HF2 לספירה. להעברה מאמצת של התאים הממוינים, יש לערבב 100 מיקרוליטרים של פי שניים מ-BMNC מסוג הבר החמישי מבעל חיים בעל קון ג'יני ב-HF2 סטרילי.עם 100 מיקרוליטרים של פעמיים עד חמש פעמים עשר עד הרביעי התורם הממוין BMNC של עניין HF2 סטרילי בצינור מיקרו צנטריפוגה לכל בעל חיים הנמען. טען מזרק אחד מיליליטר, מצויד 28 gage לכל נמען עם 200 microliters של תאים. לאחר מכן, מניחים את העכברים המטופל תחת מנורת חום כדי לגרום וריד הזנב תפוגה.מעבירים את תערובות התאים לכל חיה נמענת מוקרנת קטלנית דרך וריד הזנב. כאשר התחדשות עצמית של תאי גזע מוגבלת לשושלת BMNC שלילית מסוג פראי, שושלת שלילית, שושלת שלילית, חיובית שושלת נמוכה ותאים חיוביים שושלת גבוהה ממוינים ומושתלים לנמענים מסוג פראי כדי לקבוע את יכולת ההתחדשות העצמית של כל אוכלוסיית תא. BMNC טרנס טרנס מושתל מאמץ מבעלי חיים מודל MDS ניתן להבדיל ex vivo על ידי ביטוי סמן משטח התא CD45.2 שלהם.על ידי 16 שבועות לאחר השתלת שושלת שלילית BNMC, או BMNC ממוין מבעלי חיים תורמים MDS מהודק, התאים מהודק החוצה להתחרות בתאים מסוג הבר כפי שמוצג על ידי אחוז גדל והולך של CD45.2 תאים תורמים חיוביים, נצפה בדם ההיקפי של בעלי חיים הנמען מוקרן קטלנית. כאן מוצגים תאים מטרנספורמציה לויקמית מעכבר המושתל בתאי MDS מהודרים. שים לב לנוכחותם של פיצוצים רבים וצורות לא בוגרות.בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור להגביל את הזמן של מניפולציה ex vivo, כפי שהוא יכול לשים מתח מופרז על התאים, וכתוצאה מכך מוות תאי או אובדן תפקודי. לאחר התפתחותה טכניקה זו סוללת את הדרך עבור החוקרים בתוכנית השדה, לשים ממאירות לחקור את מקור המחלה בעכברים מהונדסים גנטית.

use-hematopoietic-stem-cell-transplantation-to-assess-origin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

פרוטוקול זה מספק הנחיות שלב אחר שלב להגדרת ניסויים תחרותיים בהשתלת מח עצם של עכבר כדי לחקור את תפקוד תאי הגזע/אב המטופויאטיים ללא טיהור מוקדם של תאי גזע על ידי מיון תאים.

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

כימות של תאי התורם-derived נדרש לעקוב אחר engraftment לאחר השתלת תא גזע בחולים עם פתולוגיות של המוגלובין. שילוב של מיון תא מבוססי cytometry זרימה המושבה היווצרות assay, לאחר מכן ניתוח של טנדם קצר חזרה ניתן להשתמש כדי להעריך את התפשטות ובידול של אבות בתוך התא erythroid.

זיהוי של התורם שיורית Erythroid ובתאים לאחר השתלת תא גזע Hematopoietic עבור חולים עם פתולוגיות של המוגלובין

גילוי של מחלה שיורית מינימלית או מדיד (MRD) הוא סמן prognostic חשוב זיקוק הערכת סיכונים, חיזוי relapse ב לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). אלה מקיף הנחיות והמלצות עם שיטות עבודה מומלצות עבור זיהוי עקבי ומדויק וזיהוי של MRD, עשויים לסייע בקבלת החלטות לטיפול יעיל של AML.

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לזהות ביטוי בו זמנית של סמנים תאי לוקמיה בתאי לוקמיה מיאלואידית חריפה הראשי על-ידי cytometry זרימה. אנו מראים כיצד ניתן לכמת שלוש אוכלוסיות קדמון, אוכלוסיה ה-LSC בשם עם הגדלת מידת ההבשלה. אנחנו אישרו הנוכחות של אוכלוסיות אלה ב המתאים לחולה-נגזר-xenografts.

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

האבחנה MDS קשה בהיעדר קריטריון מורפולוגי או ציטוגנטיקה אינפורמטיבי. MFC יכול לעזור לעדן את תהליך האבחון של MDS. כדי להיות שימושי עבור הקלינית, הניתוח MFC חייבת להתבסס על פרמטרים מספיקה ירידה לפרטים ורגישות, נתונים צריכים להיות לשחזור בין המפעילים השונים.

Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד והכתמה של תאי מח עצם מורין לפנוטיפ תאי גזע המופויטיים ותאי אב יחד עם תאי גזע אנדותל ומזנכימליים תומכים. כמו כן נכללת שיטה להעשרת תאים הממוקמים באזורי אנדוסטל ומח עצם מרכזי.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים של מח עצם מורין ותאי נישה סטרומליים

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.

זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה

זריקות תוך פמורליות מאפשרות קליטה של מספר קטן של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs), על ידי הצבת התאים ישירות בחלל מח העצם. כאן אנו מתארים פרוטוקול ניסיוני של הזרקה תוך-פמורלית של HSPCs אנושיים לעכברים מדוכאי חיסון.

הזרקה תוך-פמורלית של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים אנושיים לעכברים מדוכאי חיסון 

למדו כיצד להעריך פוטנציאל ממאיר של תאי דם מונדסים גנטית באמצעות השתלת תאי גזע המטופויטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תפקודי של תאי גזע סרטניים וזיהוי תאים מייזמי מחלה בתסמונות מיאלודיספלסטיות.

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

גלה סרטונים נוספים