Name: דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למדו על מודל ריאה ex vivo לחקר התקדמות גידולי סרטן. שיטה זו מאפשרת יצירת גידולים ראשוניים, תאי גידול מסתובבים ונגעים מטסטטיים במודל עכברוש מופחת תאים או תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מין עמ' קים קיבלה מענק תמיכה השני ג'ון וו קירקלין מחקר המלגה, האגודה האמריקאית החזי ניתוח, גראהם מחקר קרן, יוסטון המתודיסטית המומחיות רופא קבוצת גרנט, ואת מיכאל מ פרס מחקר של חרוט ה ג'ואן. אנו מודים Saikin אן על שפת עריכה של כתב היד.

הפרוטוקולים עבור ניסויים בבעלי חיים היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש במכון מחקר המתודיסטי ביוסטון, מתבצעת על פי כל תקנות, חוקים ישימים, קווים מנחים ומדיניות.
1. עכברוש ריאות קציר
<ol><li>עזים ומתנגד חולדה ספראג-Dawley 4 כדי 6-בת הזכר על ידי זריקה (IP) בקרום הבטן של קטאמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג) בהאגף שלו. להבטיח הרדמה על-ידי בדיקה היעדרות של התנועה כאשר הבוהן הינד האיבר הוא צבט עם מלקחיים.</li>
	<li>לאחר 10 דקות, מגלח את החזה והבטן, לנגב את העור עם מקלון chlorhexidine.</li>
	<li>מסירים את העור על ידי כשהרמתי אותו עם מלקחיים ועל ידי אם זה באזמל חד פעמיות. לאחר פתיחת בחלל בית-החזה על ידי אם עם האזמל, לבצע ניקור הדו-צדדיים על ידי חיתוך בצד הקדמי של כלוב הצלעות בצד השמאל וצד ימין של הסרעפת עם מספריים. הערה: זה ניתוח ההישרדות.</li>
	<li>. חכו הצלעות, להזריק 2 מ של הפארין (1,000 יחידות/mL) לתוך החדר הימני של הלב הפועם באמצעות מחט 27 גרם. הערה: פעולה זו תמנע כל היווצרות של קרישי דם בריאה.</li>
	<li>לחלוטין להסיר את כלוב הצלעות עם מספריים ובאותו מקום מחט 18 גרם של החדר השמאלי אוורור, עד הדם יוצא. לאחר מכן, להזריק 15 מ"ל תמיסת heparinized באגירה פוספט (יחידות/מ"ל; heparinized PBS) לתוך החדר הימני באמצעות מחט 25 גרם.</li>
	<li>לחתוך את נחות והסופריור הווריד הנבוב, שני ורידים גדולים מצד ימין של הלב, ו ריקון הריאות עם אוטם 10 נוספים ל- PBS heparinized בתוך החדר הימני באמצעות מחט 27 גרם. הערה: הכלילי התחתון הוא מדמיין תחת התחתון של הלב ככלי קיבול גדול מלא דם אדום. באופן דומה, הווריד הנבוב העליון הוא מדמיין בחלק העליון של הלב ככלי קיבול גדול.</li>
	<li>לחתוך את קנה הנשימה בבסיס של בלוטת התריס. הסר בזהירות את העורקים ברמה של וריד hemiazygos, סניפים של אבי העורקים בשער הניצחון.</li>
	<li>. תוציא החוצה מהבניין לב-ריאה בחלל בית-החזה ואת שאר הגוף עכברוש</li>
	<li>לבצע ventriculotomy על ידי חיתוך חצי ימינה ושמאלה החדרים ולמקם בהזמנה אישית שמולאו מראש 18 גרם מפלדת המחט בצינורית דרך החדר הימני לתוך עורק הריאה הראשי (PA).</li>
	<li>לאבטח את הצינורית עם עניבה משי 2-0, בזהירות לחשוף את החדר הימני אטריום.</li>
	<li>מקום המחיצה סכינים סטריליים הנשי של החדר השמאלי ואבטח אותו עם עניבה משי 2-0.</li>
	<li>ריקון בלוק לב-ריאה עם 20 mL heparinized PBS דרך הצינורית הרשות הפלסטינית ולמקם אותו בצינור 50 מ ל תרבות המדיה או heparinized PBS הכוללת. הערה: עבור מודל הסלולר, עבור לשלב 3.1 כדי להגדיר את ביוריאקטור. עבור מודל acellular, המשך לשלב 2.1 עבור decellularization.</li>
</ol>2. ריאות Decellularization
<ol><li>
הכנה של היחידה decellularization
	<ol>
<li>להכין את כל decellularization קאמרית/בקבוק על ידי פירסינג שני חורים הפקק של סכינים סטריליים הנשי החורים (איור 1A ו 1B). לאבטח אותו עם טבעת ניילון שחורה בצד השני. באופן דומה, לקדוח חור אחד פקק בקבוק נוסף של הקובץ המצורף קבע תוך ורידי (איור 1C). הערה: איור 1A ו- 1B הם באותו פקקי בקבוקים משני צדדים שונים. איור 1C הוא כובע שונים עם חור אחד כאמור לעיל בשלב 2.1.1.</li>
		<li>לצרף צינור 0.5 אינץ (ב עורק הריאה או הרשות הסיום) וצינורות 6 אינץ (איור 1J) סכינים סטריליים נקבה מן בתוך פקקי בקבוקים (איור 1A ו 1B) ולצרף מנעול סכינים סטריליים זכר בקצוות. הגדר את המנעול עם בקבוק 500 מ"ל הקאמרית/הבקבוק decellularization.</li>
		<li>חבר קצה אחד של שני צינורות רגל 2 (אשר מחוברים עם מנעול סכינים סטריליים זכר) או בסוף הצינור משאבה (איור 1 H), אשר מוצמד לראש המשאבה (איור 1E ו 1F) על-ידי מחסנית (איור 1 ג'י) עם סכינים סטריליים נקבה מנעול (איור 1I).</li>
		<li>לחבר את הקצוות האחרים של רגל 2 הצינורות (מתוך שלב 2.1.3) כל ראש נעל זכוכית הנשי על המכסה קאמרית/בקבוק decellularization (איור 1 L).</li>
		<li>הגדר 250 מ ל heparinized PBS בקבוק (עם 200 מ של PBS) על-ידי תליית בקבוק הפוך על דוכן עם תום הפרוקסימלית של ערכה תוך ורידי (איור 1D) יש להוסיף את הפקק, ואת הקצה הדיסטלי החלפת הצינור רגל 2 מחובר decellularization c הפרובינציאלי האמבר/הבקבוק בקצה הרשות הפלסטינית (איור 1B). להתחבר הצינורית הזאת במרחק של הבקבוק להשליך. הערה: הבקבוקים שוכנים בינות קרטון, כפי שמוצג באיור 1 K. הצינורות תוך ורידי לצאת הבקבוקים תלוי לוותר ריאגנטים ב לגרדום ריאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תהליך decellularization ריאות
	<ol>
<li>להפעיל את PBS heparinized, בלחץ זלוף הפיזיולוגיות של 30 מ מ כספית (איור 1 K) עד זורם בחופשיות בבקבוק decellularization הקאמרית/וצרף, ואז, הרחוב לב-ריאה עד הסוף הרשות הפלסטינית דרך הצינורית הרשות הפלסטינית.</li>
		<li>תמשיך לרוץ המשאבה ללא הרף, כך כל פתרון/מאגר עודף שבתוך decellularization הקאמרית/הבקבוק מקבל שנמחקו.</li>
		<li>הפעל את PBS heparinized דרך הרשות למשך 15 דקות, בלחץ זלוף של 30 מ מ כספית בשביל הכביסה הראשונית (איור 1 K).</li>
		<li>החלף את הבקבוק PBS heparinized 0.1% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) במים יונים, perfuse הריאה עבור 2 h עבור decellularization.</li>
		<li>לאחר decellularization, perfuse יונים בלוק מים דרך לגרדום ריאות למשך 15 דקות.</li>
		<li>לאחר מכן, perfuse דטרגנט ללא יונית 1% במים יונים למשך 10 דקות.</li>
		<li>החלף הקאמרית/הבקבוק decellularization 500 מ ל- PBS בלוק בתוספת x 1 אנטיביוטיקה (פניצילין-סטרפטומיצין שהוא גוסס), שמירה על הריאה תלויה ללא פגע עם הפקק שבתוך הבקבוק.</li>
		<li>למחוק את ורידי להגדיר, שמכניסים את נקז רגל 2 מחובר המיכל ביטול חזרה עד לסוף עורק הריאה תא decellularization, ולהפעיל את המשאבה ב 6 מ ל/דקה (L איור 1).</li>
		<li>Perfuse הריאות בשביל 72 h ולשמור על שינוי טוב, מגניב עם אנטיביוטיקה כל 12 שעות. הערה: הריאה acellular מוכן לשימוש מיידי. ניתן לאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט עד שהוא נדרש. אם כתמים ורודים או קרישי דם, ניתן לאבחן בבירור בתוך האונות ריאות, למחוק את הריאה. זה אפשרי לבחון באופן אקראי עבור ה-DNA או histopathology. Acellular ריאה מלאה לא יציג יהיה שטף התאים ואת 99.9% של ה-DNA. הערה: בעת עבודה עם מודל הסלולר ריאות, לדלג על decellularization. הריאה שנקטפו (שלב 1) ניתן להגדיר ישירות באת ביוריאקטור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ביוריאקטור הקמה
<ol><li>להכין את הבקבוק ביוריאקטור את הפריטים הדרושים עבור הסידור.<ol>
<li>קודחים חורים שלוש אחת פקק בקבוק 500 מ"ל במרחק שווה ולתקן סכינים סטריליים הנשי בשלושת החורים, באמצעות טבעות ניילון שחור (איור 2A ו- 2B). הערה: שני חורים, המנעול סכינים סטריליים מסתיים הפנים בחוץ, כאשר קצה אחד פונה בתוך הבקבוק.</li>
		<li>לחתוך 6 משאבת צינור, 2 בצינור, 6 ב שפופרת, צינור 1.5 מטרים, צינור רגל 2 ו צינור oxygenator 10 רגל לכל ביוריאקטור.</li>
		<li>חתך של מחט נירוסטה 18 גרם ו, שוב, לחבר את הקצוות עם אבובים מסתיימים עבור בצינורית והכו אותי.</li>
		<li>לעטוף את הצינור oxygenator, עם סכינים סטריליים מחברים נעל בקצוות, על ברז חשמלי מחוט באמצעות קלטות autoclave (איור 2C).</li>
		<li>אוטוקלב הנ פריטים ולשמור אותם ב- UV אור למשך 10 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכבתי את המשאבה בתוך החממה תרבות תא רגיל (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) עם מרווח נאות בין המגשים להתאמה בקלות בקבוק 500 מ"ל.</li>
	<li>תרסיס אתנול 70% על הדיו משאבת וחבר את צינור משאבת טלפוניה נעל זכוכית נקבה בשני הקצוות המשאבה.</li>
	<li>להגדיר את oxygenator העוטפת רשת התיל ברז חשמלי בתוך החממה התרבות התא על-ידי חיבור קצה אחד (זרימה החוצה) של oxygenator צינור המשאבה ואת הקצה השני עם הצינור 1.5 מטרים ב ביוריאקטור.</li>
	<li>להגדיר את הבקבוק ביוריאקטור ב אבטחה ארון עם תנאים אספטי.<ol>
<li>לצרף של צימוד 3-way (צהוב) בראש של אחד Luers הנשי כדי לשלוט בזרימה דרך הרשות הפלסטינית.</li>
		<li>להתחבר עם צימוד בכיוון אחד (כחול) עוד המחיצה נעל נשית סכינים סטריליים תא זריעה דרך קנה הנשימה (2F איור).</li>
		<li>לחבר 2 באבובים מבחוץ (לבן) ו-6 באבובים בתוך הבקבוק לזרום התקשורת החוצה. מתאים מנעול סכינים סטריליים זכר לרכבת התחתית רגל 2 וצרף סגנון לוג סכינים סטריליים הנשי טי לספק נגישות כדי להוסיף או להסיר כל דבר.</li>
		<li>לצרף אחד הפתחים של המחבר-כיוונית (נקבה סכינים סטריליים לוג סגנון טי) של צימוד בכיוון אחד.</li>
		<li>לצרף רגל 2 צינורות מנעול סכינים סטריליים זכר, מנעול סכינים סטריליים הנשי.</li>
		<li>להוסיף 200 מ של RPMI1640 עם 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה תא תרבות בינוני (משתנה לפי דרישה תא) ולהעביר את ביוריאקטור החממה. לחבר את הצינור oxygenator שני הקצוות פתוחים (צימוד בכיוון אחד, מחבר טי) כדי להפוך אותו מגיב ביולוגי לולאה סגורה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מראש להפעיל את המשאבה ב 6 מ ל/דקה בתוך החממה התרבות תאים עם תא תרבות המדיה כדי למלא את oxygenator ואת צינורות, כך אין בועות אוויר קיימים הצנרת.</li>
	<li>ברגע הצינורות מלאים עם המדיה, לסגור את צימוד ולהסיר את הבקבוק ביוריאקטור מן החממה על ידי ניתוק של oxygenators משני קצוות הבקבוק ביוריאקטור.</li>
	<li>לשים את הבקבוק ביוריאקטור הקבינט אבטחה, עוברים תרבות המדיה באמצעות צימוד, לצרף צימוד דרך מחבר ה-סכינים סטריליים זכר את הצינורית הרשות הפלסטינית של לגרדום ריאות (acellular או סלולרי). הערה: הנה זה ניתן להשתמש המודל acellular (בעקבות תהליך decellularization) או בלוק שנקטפו זה עתה לב-ריאה (קרי, המודל הסלולר, כפי שהוא שומר על תאי עכבר מקורית).</li>
	<li>עוברים תרבות המדיה באמצעות צימוד בכיוון אחד כדי להסיר את כל האוויר וקושרים את הצינורית והכו אותי על חוט משי לקנה הנשימה.</li>
	<li>הקפד להימנע כל פיתול של הרשות הפלסטינית ושל קנה הנשימה. קרוב הפקק ביוריאקטור עם הריאות לגרדום בפנים, שוב, גילוח ורחיצה כירורגית להעביר את ביוריאקטור החממה ולהתחיל את המשאבה במהירות 6 מ לדקה.</li>
	<li>הפעל מדיה תרבות למשך 10-15 דקות לוודא כל האונות לקבל בניפוח הריאה נראה במצב טוב (איור 2G).</li>
</ol>4. מודל גרורות, זריעה תא
הערה: להמשיך תא זריעה במודל ריאות הנ למחקר בצמיחה הגידול העיקרי. לשנות לגרדום ריאות (acellular או סלולרי) כדלקמן עבור דגם גרורתי.
<ol><li>להוציא את ביוריאקטור עם לגרדום ריאות מן החממה ותשחיל אבטחה הקבינט.</li>
	<li>להשתמש מזרק נעל זכוכית לעבור 5 מ של תרבות התקשורת דרך קנה הנשימה לפתוח את הפקק ביוריאקטור עם התליה לגרדום ריאות (2F איור).</li>
	<li>בשלב זה, אדם נוסף נדרש כדי לסייע ב השינוי של הריאה למודל גרורתי.</li>
	<li>קבל משי 2-0 ומוכן להשתמש מלקחיים זוויתי כדי לגרום למעבר דרך קנה הנשימה בנקודת נגע הסתעפות.</li>
	<li>לקשור את קנה הנשימה הולך הריאה הימנית בנקודה נגע הסתעפות וסמנו את הזרימה החופשית של מדיה דרך קנה הנשימה לריאה שמאלית על-ידי העברת תרבות המדיה. הערה: פעם אחת קנה הנשימה קשורה בנקודת נגע הסתעפות, תאים נזרע דרך קנה הנשימה באופן אוטומטי יופנו זרע אל האונות שמאל. זה יכול להיבדק לפני זריעה התאים על ידי התקשורת תרבות לדחוף דרך קנה הנשימה. במודל גרורתי, התקשורת יזיז האונות שמאל בלבד, אשר לנפח ולא את האונות נכון10.</li>
	<li>הגדר מזרק נעל זכוכית 20 מ"ל על גבי הצינורית והכו אותי ולהוסיף בקרת האוויר תאים של סרטן הריאה (A549, H1299) ב- 50 מ של מדיה תרבות שלמה RPMI1640 (2F איור).</li>
	<li>לבצע את התא זריעת ב אבטחה ארון. להוסיף 15 מ"ל של תאים במזרק ולתת לו לעבור אונות הריאה על ידי הכבידה. להוסיף את שאר התאים לפני כל בועות האוויר לעבור דרך.</li>
	<li>Acellular ריאות זריעה, לאסוף את המדיה perfused מטפטף בתוך הבקבוק ביוריאקטור, נותן להם לעבור דרך קנה הנשימה שוב 3 x. הערה: המדיה perfused יש לפעמים התאים הסרטניים נזרע. לכן, עבור יעיל זריעה, להחזיר התקשורת שוב קנה הנשימה דרך המזרק.</li>
	<li>ברגע נזרע, להסיר את המזרק, לחכות 15 דקות, להוסיף מדיה טריים, ומחזירים את ביוריאקטור בחזרה אינקובטור. הסר כל בועות האוויר הצנרת.</li>
	<li>. הפעל את המשאבה כדי perfuse התקשורת ב 6 מ ל/דקה</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2017%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Cancer+Statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li>
<li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+don%27t+we+get+more+cancer%3F+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308(2012).</li>
<li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer.+Journal+International+du+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li>
<li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441(2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הריאה 4-D שמחוץ מספקת הזדמנות ללמוד הגידול ו גרורות ב תרגיל מעבדה. מטריצה ריאות מקורית היא מערכת מורכבת מספק תמיכה הרקמות ומתחזק אינטראקציות תא-תא, התא-מטריקס אינטראקציות, התמיינות, בארגון רקמות. הוא מספק הזדמנות להוסיף רכיבים microenvironment הגידול ללמוד והשפעותיהם על הגידול ואת האינטראקציה עם תאים אחרים.
הקציר ריאות היא השלב הקריטי עבור דגם 4-D ריאות שמחוץ . עיכוב מתן הזריקה הפארין לאחר פתיחת בית החזה עלול לגרום קריש דם בריאות, העשויים להשפיע על זרימה חופשית של ריאגנטים במ...

גרורות סרטן הוא האשם מאחורי רוב מקרי מוות מסרטן, מהווה את האתגר האולטימטיבי במאמץ להילחם בסרטן. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לעצב עבור תרבות ארבע-ממדי התא (4-D) אשר יש מימד של זרימה, בנוסף צמיחת תאים (תלת-ממדי) תלת ממדי פרוטוקול. הוא מייצג ברורים משלושת השלבים של תהליך גרורות [קרי, הגידול העיקרי, מחזורי תאים סרטניים (CTCs), נגעים גרורתי].
בשלושת העשורים האחרונים, מדענים ברחבי העולם הניב של שפע ללא תחרות של מידע כדי להבין את המנגנונים את התקדמות גרורתי, סוגי סרטן שונים, זה שיפור הסיכוי התרופה או ההישרדות ללא התקדמות המחלה. ניהול קליני של כמה סוגי סרטן, כגון סרטן השד, שיפור משמעותי1; עם זאת, כמה סוגי סרטן, כגון סרטן ריאות, עדיין יש עניים הישרדות2. מודלים בעלי חיים במבחנה , ויוו סייעו ביצירת תובנות חדשות שהתקנתי לחזק את התפתחות המחלה. בשנים האחרונות, תא xenografts נגזר קו (CDX), החולה, נגזר xenografts (PDX) היה עניין נוסף כפי הם משמרים הרלוונטיים תכונות רבות של הגידול העיקרי אנושי3, כגון צמיחה קינטיקה, תכונות היסטולוגית, התנהגותית מאפיינים, ואת התגובה לטיפול. עם זאת, כל דגם יש מגבלות משלו כדי להבין את המנגנון של מערך CTC, גרורות אל איבר מרוחק4,5,6.
לאחרונה, פיתחנו מודל סרטן ריאות 4-D ex-vivo על ידי ניצול הרעיון של איברים מניפולציות, תרבית תאים מבוססת זלוף. היא מחקה את הצמיחה סרטן ריאות האנושית על ידי יצירת גושים סרטניים perfusable לגדול לאורך זמן עם בני אדם דומים מופרש סרטן ייצור חלבון7. הוא מייצג את החתימה ביטוי גנים מנבאת המסכן ההישרדות בחולים עם סרטן, גם מראה תגובה טיפולית באמצעות רגרסיה הגידול על ציספלטין בטיפול8,9. דגם לונג השתנה עוד יותר כך הוא יכול לדמות נגעים גרורתי. CTCs להתפתח להערכת הגידול העיקרי, intravasate, בורחת אל תוך הריאה contralateral כדי ליצור נגעים גרורתי10. ג'ין ביטוי מחקרים מראים פרופיל ביטוי מובהק של הגידול העיקרי, את CTCs, נגעים גרורתי, קולטנים upregulation את קבוצת המשנה של גנים הדרושים עבור פנוטיפ10. תהליך גרורתי זה מתרחש בשל נוכחותם של תנאים וחיסונים אצל חולים עם סרטן. היתרון של מודל זה הוא הנוכחות של מטריצה טבעי ואדריכלות, זלוף של חומרים מזינים שמוביל היווצרות גושים סרטניים. בנוסף, הוא גם מספק הזדמנות לחקור את ההשפעות של מרכיבים שונים של גידול microenvironment או סמים על הגידול התקדמות לאורך זמן. מודל זה יכול לשמש כדי לגדל מגוון של תאים סרטניים (סרטן ריאות, סרטן השד, סרקומה וכו) תרגיל מעבדה.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td></td></tr><tr><td>ספוגית כלורהקסידין</td> זכר <td>Prevantics, ניו יורק, ארה"ב</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, שאומבורג, אילינוי, ארה"ב</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>מחט 18 מד</td><td>מקמאסטר קאר, ארה"ב</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 עניבת משי</td><td>Ethicon, סן אנג'לו, טקסס, ארה"ב</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>משאבת Masterflex L/S</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>ראש משאבת Masterflex L/S</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>מחסנית משאבת Masterflex L/S</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>צינור טיגון</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>צינור משאבת MasterFlex</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>מחברי מנעול לואר נקבה</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>מחברי מנעול לואר זכר</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>טבעת ניילון שחורה</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>סט תוך ורידי</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>מחמצן סיליקון</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>ABW00011</td><td>רשת תיל Saint-GoBain</td></tr> <tr><td></td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>ניו יורק חוט</td></tr><tr><td>נקבה luer סגנון זיז TEE</td><td>קול-פארמר, ורנון הילס, אילינוי, ארה"ב</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>טבעת נעילה אינטגרלית זכר לואר 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, ורנון הילס, IL, ארה"ב</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>מצמד נקבה בסגנון חוט luer</td><td>Cole-Parmer, ורנון הילס, IL, ארה"ב</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>מחבר Clave</td><td>טיפול נמרץ רפואי</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>היי-פלו וסחר; 4 כיוונים Stopcock עם מסתובב זכר Luer</td><td>Lock smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex Pump Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, ארה"ב</td><td>06598-13</td><td>לצינורית</td></tr></tbody></table>

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

קשה לבודד תאים סרטניים בנקודות שונות של התקדמות הגידול. יצרנו שמחוץ ריאות מודל שיכול להציג את האינטראקציה של תאים סרטניים עם מטריצה טבעי וזרימת מתמיד של חומרים מזינים, כמו גם מודל זה מציג את האינטראקציה של תאים סרטניים עם רכיבים סלולרית רגילה מטריצה טבעי. המודל ריאות acellular ex-vivo נוצר על ידי בידוד בלוק לב-ריאה עכברוש והסרה של כל התאים באמצעות תהליך decellularization. הסמפונות העיקריים ממש קשורה מחוץ, תאים סרטניים מוצבים קנה הנשימה על ידי מזרק. התאים להזיז ואכלוס הריאה השמאלית. הריאה ממוקם אז מגיב ביולוגי שבו עורק הריאה מקבל זרם מתמיד של מדיה במעגל סגור. הגידול גדל על הריאה השמאלית הוא הגידול העיקרי. התאים הגידול מבודדים בתקשורת במחזור יאומנו. תאים סרטניים, תאי גידול בריאה הימנית נגעים גרורתי. דגם לונג הסלולר שמחוץ נוצר על-ידי דילוג על התהליך decellularization. כל דגם ניתן לענות על שאלות מחקריות שונות.

הריאה שנקטפו עכברוש שומר על שלמות להערכת ו alveoli11 (איור 3A ו- 3B). על decellularization, רכיבי מטריצה חוץ-תאית הריאות acellular, כגון, fibronectin, האלסטין והקולגן, נשמרים11 (3C דמות תלת-ממד, 3E, 3F). Decellularization מוביל הסרה מלאה של תאי עכבר מקורית מתנת בריאות, אשר יכול להיות שנצפו על ידי hematoxylin אאוזין ...

כאן, אנו מציגים עבור ex-vivo ריאות סרטן מודל מחקה את השלבים של התקדמות הגידול ומסייעת לבודד גידול ראשוני, פרוטוקול מחזורי תאים סרטניים נגעים גרורתי.

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות להתקדמות הגידול. מודל הריאות הא-תאי והתאי ex vivo מאפשר היווצרות גידול ראשוני הגדל עם הזמן ויוצר תאי גידול במחזור ונגעים גרורתיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחקור את התקדמות הסרטן בזמן מקוצר וצמיחה של סוגים שונים של תאים סרטניים.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול המותאם אישית שלנו שכן ניתן להשתמש בתאי גידול מחולים במודל כדי להעריך את היעילות של תרופות טיפוליות כולל תאים חיסוניים. התחל עם חולדה מורדמת עמוק. לגלח את החזה והבטן, ולנגב את העור בעזרת ספוגית כלורהקסידין.לאחר פתיחת חלל בית החזה, בצע כריתת בית חזה דו צדדית על ידי חיתוך הצד הקדמי של כלוב הצלעות משמאל בצד ימין של הסרעפת. החזיקו את כלוב הצלעות והזריקו שני מיליליטר של 1000 יחידות למיליליטר הפרין לחדר הימני של הלב הפועם באמצעות מחט בקוטר 27 כדי למנוע היווצרות קרישי דם בריאה. לאחר הסרת כלוב הצלעות, הנח מחט בגודל 18 בחדר השמאלי כפתח אוורור כדי לאפשר לדם לצאת, ולאחר מכן השתמש במחט בגודל 25 כדי להזריק 15 מיליליטר של 12.5 יחידות למיליליטר של PBS הפריני לחדר הימני.לאחר מכן, חותכים את קנה הנשימה בבסיס בלוטת התריס ומסירים בזהירות את אבי העורקים היורד בגובה וריד ההמיזיגוס וענפי אבי העורקים בקשת. לאחר הסרת גוש הלב-ריאה מחלל בית החזה, חתכו מחצית מהחדר הימני והשמאלי ולאחר מכן הניחו צינורית מחט נירוסטה בגודל 18 בהתאמה אישית דרך החדר הימני לעורק הריאה הראשי. אבטח את הצינורית עם עניבת המשי 2-0 וחשוף בזהירות את החדר והאטריום הימני.התחל בהפעלת PBS הפריני בלחץ זלוף פיזיולוגי של 30 מילימטר כספית עד שהוא זורם בחופשיות לתוך הבקבוק של יחידת הדסלולריזציה, ולאחר מכן חבר את גוש הלב-ריאה ליחידת הדה-סלולריזציה בקצה עורק הריאה דרך צינורית עורק הריאה. לאחר 15 דקות של שטיפה עם PBS הפריני, החלף את בקבוק ה-PBS ההפריני בבקבוק המכיל 0.15% נתרן דודציל סולפט ומים נטולי יונים, והחדיר את הריאה למשך שעתיים לדה-סלולריזציה. לאחר הדה-סלולריזציה, הזרמת מים אוטוקלאבים נטולי יונים דרך פיגום הריאה למשך 15 דקות ולאחר מכן חומר ניקוי לא יוני 1% במים נטולי יונים למשך 10 דקות.לבסוף, החלף את הבקבוק ב-500 מיליליטר PBS חיטוי בתוספת אנטיביוטיקה. הפעל את המשאבה במהירות של שישה מיליליטר לדקה והחדיר את הריאות למשך 72 שעות, ולאחר מכן הריאה הא-תאית מוכנה לשימוש מיידי. רססו 70% אתנול על מחסנית המשאבה והגדירו את המחמצן על ידי חיבור קצה היציאה של המחמצן לצינור המשאבה והקצה השני לצינור של 1.5 רגל בביו-ריאקטור.הגדר את בקבוק הביוריאקטור בארון בטיחות ביולוגית בתנאים אספטיים. חבר פקק תלת-כיווני לראש של נקבת מנעול לואר כדי לשלוט בזרימה דרך עורק הריאה, ולאחר מכן חבר פקק חד כיווני למחסום מנעול לואר נקבה אחרת לזריעת תאים דרך קנה הנשימה. חבר צינורות בגודל שני אינץ' מבחוץ וצינורות בגודל שישה אינץ' בחלק הפנימי של הבקבוק כדי להפיץ את המדיום.הכן את הצינור לחיבור בקבוק הביוריאקטור למחמצן. התקן מנעול לואר זכר לצינור של שני רגליים והצמד זיז לואר נקבה בסגנון T כדי לספק נגישות, והצמד מנעול לואר זכר ומנעול לואר נקבה לשני צינורות רגליים. הוסף מדיום תרבית תאים והעביר את הביוריאקטור לחממה.חבר את צינור המחמצן לשני הקצוות הפתוחים כדי להפוך אותו לביו-ריאקטור בלולאה סגורה. הפעל מראש את המשאבה בשישה מיליליטר לדקה כדי למלא את המחמצן והצינורות במדיום תרבית כך שלא יהיו בועות אוויר בצינור. לאחר מילוי הצינורות במדיום, סגור את תא העצירה ונתק את המחמצנים משני קצוות בקבוק הביוריאקטור.הכניסו את בקבוק הביוריאקטור לארון הבטיחות הביולוגית, העבירו את מדיום התרבות דרך תא העצירה והצמידו את צינורית הריאות של פיגום הריאה. אם אתה עובד עם מודל הריאות התאי, דלג על הפירוק. ניתן למקם את הריאה שנקטפה באופן דיאדי בביו-ריאקטור.העבירו שוב את מדיום התרבות דרך תא העצירה החד-כיווני כדי להסיר אוויר וקשרו את צינורית קנה הנשימה בחוט משי לקנה הנשימה, ולאחר מכן סגרו את מכסה בקבוק הביוריאקטור. העבירו את הביוריאקטור לחממה והפעל את המשאבה. הפעל תרבית בינונית למשך 10 עד 15 דקות כדי לוודא שכל האונות מתנפחות והריאה נראית במצב טוב.שנה את פיגום הריאה הא-תאי או התאי כדלקמן עבור המודל הגרורתי. פתח את מכסה הביוריאקטור עם פיגום הריאה התלוי והשתמש במזרק נעילת Luer כדי להעביר חמישה מיליליטר של מדיום תרבית דרך קנה הנשימה. השתמש במלקחיים זוויתיים כדי להעביר 2-0 משי דרך קנה הנשימה בנקודת ההתפצלות.קשרו את קנה הנשימה העובר לריאה הימנית בנקודת ההסתעפות ובדקו את הזרימה החופשית של המדיה דרך קנה הנשימה לריאה השמאלית על ידי העברת מדיום תרבית. הכן נפח של 50 מיליליטר של תאי סרטן ריאות כגון A549 או H1299 באמצעי תרבית שלמים RPMI 1640 בריכוז של שניים עד שלושה מיליון תאים למיליליטר. הניחו מזרק נעילת לואר בנפח 20 מיליליטר על גבי צינורית קנה הנשימה והוסיפו 15 מיליליטר תאים למזרק.אפשר לתרחיף התאים לעבור דרך אונות הריאה על ידי כוח הכבידה. הוסף את שאר התאים לפני שבועות אוויר כלשהן עוברות. לאחר הזריעה, הסר את המזרק והמתן 15 דקות, ואז הוסף מדיום טרי לביו-ריאקטור.החזירו אותו לחממה, ולאחר הסרת בועות אוויר, החליפו את פיגום הריאות בשישה מיליליטר לדקה. היסטופתולוגיה של ריאה שלמה מציגה את הנאדיות והפנאומוציטים. כפי שניתן לראות כאן, דה-סלולריזציה מובילה להסרה מוחלטת של תאי הריאה, והיסטופתולוגיה של ריאות א-תאיות חושפת קרום בסיס שלם.כתם הפנטכרום והאלסטין של מובט של ריאה נטולת תאים חושף נוכחות של קולגן, פיברין ואלסטין עם כלי דם וסימפונות שלמים. ניתוח DNA של הריאה הנטולת תאים מראה ירידה בתכולת ה-DNA של יותר מ-99%ניתן להשתמש בריאה הא-תאית ישירות בביו-ריאקטור לתרבית תאים. ניתוח היסטולוגי מראה נוכחות של גידול גידול.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להזריק את הפרין לחדר הימני של הלב. לאחר פיתוח זה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן לחקור את השינויים הגנטיים והאפיגנטיים המובילים לגרורות של תאי גידול בסרטן הריאות.

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מאמר זה מתאר את הנהלים של assay גרורות ניסיוני המשמש כדי לקבוע את פוטנציאל גרורתי של שורות תאים סרטניים אנושיים.

גרורה ניסויית Assay

גרורות הריאה ניסיוניים מודל CTL עכבר חיסוני לניתוח האינטראקציה תאים סרטניים...

גרורה ניסויית חיסוני CTL המאמצת העברת דגם עכבר

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד. בטכניקה זו מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. פרוטוקול מיצוי ריאות כלול לחקר גרורות ריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים מעובר העכבר.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.

ריאות הגידול תא גיוס Assay

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה vivo לשעבר החי של אינטראקציות תא-stroma הגידול בתוך גרורות ריאה, ניצול כתבים ניאון בעכברים. באמצעות מיקרוסקופ confocal ספינינג-דיסק, טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאים חיים לפחות 4 שעות ויכול להיות מותאם ללמוד תנאים ריאות דלקתיות אחרות.

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

היכולת של שיבוטים גרורתיים ליישב אתרים מרוחקים תלויה ביכולת ההתפשטות שלהם ו/או ביכולתם לשרוד במיקרו-סביבה המארחת ללא התפשטות משמעותית. כאן, אנו מציגים מודל של בעלי חיים המאפשר הדמיה כמותית של שני סוגי ההתיישבות בכבד על ידי שיבוטים גרורתיים.

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

במודל חיה יש צורך לפענח את התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום קולוניזציה ריאות במהלך גרורות סרטן. . הנה, הקמנו, לבצע בהצלחה של ויוו assay לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבה fibronectin פולימריים (polyFN) על CTCs ריאות קולוניזציה.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת חלון אופטי השוכנות לצמיתות עבור בית החזה מורין, המאפשר הדמיה תוך-ויאלית ברזולוציה גבוהה של הריאה. קביעות החלון הופכת אותו מתאים היטב לחקר תהליכים תאיים דינמיים בריאה, במיוחד אלה המתפתחים לאט, כגון התקדמות גרורתית של תאים סרטניים מופצים.

חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

למדו על מודל ריאה ex vivo לחקר התקדמות גידולי סרטן. שיטה זו מאפשרת יצירת גידולים ראשוניים, תאי גידול מסתובבים ונגעים מטסטטיים במודל עכברוש מופחת תאים או תאי.

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

גלה סרטונים נוספים