דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות להתקדמות הגידול. מודל הריאות הא-תאי והתאי ex vivo מאפשר היווצרות גידול ראשוני הגדל עם הזמן ויוצר תאי גידול במחזור ונגעים גרורתיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחקור את התקדמות הסרטן בזמן מקוצר וצמיחה של סוגים שונים של תאים סרטניים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול המותאם אישית שלנו שכן ניתן להשתמש בתאי גידול מחולים במודל כדי להעריך את היעילות של תרופות טיפוליות כולל תאים חיסוניים. התחל עם חולדה מורדמת עמוק. לגלח את החזה והבטן, ולנגב את העור בעזרת ספוגית כלורהקסידין.

לאחר פתיחת חלל בית החזה, בצע כריתת בית חזה דו צדדית על ידי חיתוך הצד הקדמי של כלוב הצלעות משמאל בצד ימין של הסרעפת. החזיקו את כלוב הצלעות והזריקו שני מיליליטר של 1000 יחידות למיליליטר הפרין לחדר הימני של הלב הפועם באמצעות מחט בקוטר 27 כדי למנוע היווצרות קרישי דם בריאה. לאחר הסרת כלוב הצלעות, הנח מחט בגודל 18 בחדר השמאלי כפתח אוורור כדי לאפשר לדם לצאת, ולאחר מכן השתמש במחט בגודל 25 כדי להזריק 15 מיליליטר של 12.5 יחידות למיליליטר של PBS הפריני לחדר הימני.

לאחר מכן, חותכים את קנה הנשימה בבסיס בלוטת התריס ומסירים בזהירות את אבי העורקים היורד בגובה וריד ההמיזיגוס וענפי אבי העורקים בקשת. לאחר הסרת גוש הלב-ריאה מחלל בית החזה, חתכו מחצית מהחדר הימני והשמאלי ולאחר מכן הניחו צינורית מחט נירוסטה בגודל 18 בהתאמה אישית דרך החדר הימני לעורק הריאה הראשי. אבטח את הצינורית עם עניבת המשי 2-0 וחשוף בזהירות את החדר והאטריום הימני.

התחל בהפעלת PBS הפריני בלחץ זלוף פיזיולוגי של 30 מילימטר כספית עד שהוא זורם בחופשיות לתוך הבקבוק של יחידת הדסלולריזציה, ולאחר מכן חבר את גוש הלב-ריאה ליחידת הדה-סלולריזציה בקצה עורק הריאה דרך צינורית עורק הריאה. לאחר 15 דקות של שטיפה עם PBS הפריני, החלף את בקבוק ה-PBS ההפריני בבקבוק המכיל 0.15% נתרן דודציל סולפט ומים נטולי יונים, והחדיר את הריאה למשך שעתיים לדה-סלולריזציה. לאחר הדה-סלולריזציה, הזרמת מים אוטוקלאבים נטולי יונים דרך פיגום הריאה למשך 15 דקות ולאחר מכן חומר ניקוי לא יוני 1% במים נטולי יונים למשך 10 דקות.

לבסוף, החלף את הבקבוק ב-500 מיליליטר PBS חיטוי בתוספת אנטיביוטיקה. הפעל את המשאבה במהירות של שישה מיליליטר לדקה והחדיר את הריאות למשך 72 שעות, ולאחר מכן הריאה הא-תאית מוכנה לשימוש מיידי. רססו 70% אתנול על מחסנית המשאבה והגדירו את המחמצן על ידי חיבור קצה היציאה של המחמצן לצינור המשאבה והקצה השני לצינור של 1.5 רגל בביו-ריאקטור.

הגדר את בקבוק הביוריאקטור בארון בטיחות ביולוגית בתנאים אספטיים. חבר פקק תלת-כיווני לראש של נקבת מנעול לואר כדי לשלוט בזרימה דרך עורק הריאה, ולאחר מכן חבר פקק חד כיווני למחסום מנעול לואר נקבה אחרת לזריעת תאים דרך קנה הנשימה. חבר צינורות בגודל שני אינץ' מבחוץ וצינורות בגודל שישה אינץ' בחלק הפנימי של הבקבוק כדי להפיץ את המדיום.

הכן את הצינור לחיבור בקבוק הביוריאקטור למחמצן. התקן מנעול לואר זכר לצינור של שני רגליים והצמד זיז לואר נקבה בסגנון T כדי לספק נגישות, והצמד מנעול לואר זכר ומנעול לואר נקבה לשני צינורות רגליים. הוסף מדיום תרבית תאים והעביר את הביוריאקטור לחממה.

חבר את צינור המחמצן לשני הקצוות הפתוחים כדי להפוך אותו לביו-ריאקטור בלולאה סגורה. הפעל מראש את המשאבה בשישה מיליליטר לדקה כדי למלא את המחמצן והצינורות במדיום תרבית כך שלא יהיו בועות אוויר בצינור. לאחר מילוי הצינורות במדיום, סגור את תא העצירה ונתק את המחמצנים משני קצוות בקבוק הביוריאקטור.

הכניסו את בקבוק הביוריאקטור לארון הבטיחות הביולוגית, העבירו את מדיום התרבות דרך תא העצירה והצמידו את צינורית הריאות של פיגום הריאה. אם אתה עובד עם מודל הריאות התאי, דלג על הפירוק. ניתן למקם את הריאה שנקטפה באופן דיאדי בביו-ריאקטור.

העבירו שוב את מדיום התרבות דרך תא העצירה החד-כיווני כדי להסיר אוויר וקשרו את צינורית קנה הנשימה בחוט משי לקנה הנשימה, ולאחר מכן סגרו את מכסה בקבוק הביוריאקטור. העבירו את הביוריאקטור לחממה והפעל את המשאבה. הפעל תרבית בינונית למשך 10 עד 15 דקות כדי לוודא שכל האונות מתנפחות והריאה נראית במצב טוב.

שנה את פיגום הריאה הא-תאי או התאי כדלקמן עבור המודל הגרורתי. פתח את מכסה הביוריאקטור עם פיגום הריאה התלוי והשתמש במזרק נעילת Luer כדי להעביר חמישה מיליליטר של מדיום תרבית דרך קנה הנשימה. השתמש במלקחיים זוויתיים כדי להעביר 2-0 משי דרך קנה הנשימה בנקודת ההתפצלות.

קשרו את קנה הנשימה העובר לריאה הימנית בנקודת ההסתעפות ובדקו את הזרימה החופשית של המדיה דרך קנה הנשימה לריאה השמאלית על ידי העברת מדיום תרבית. הכן נפח של 50 מיליליטר של תאי סרטן ריאות כגון A549 או H1299 באמצעי תרבית שלמים RPMI 1640 בריכוז של שניים עד שלושה מיליון תאים למיליליטר. הניחו מזרק נעילת לואר בנפח 20 מיליליטר על גבי צינורית קנה הנשימה והוסיפו 15 מיליליטר תאים למזרק.

אפשר לתרחיף התאים לעבור דרך אונות הריאה על ידי כוח הכבידה. הוסף את שאר התאים לפני שבועות אוויר כלשהן עוברות. לאחר הזריעה, הסר את המזרק והמתן 15 דקות, ואז הוסף מדיום טרי לביו-ריאקטור.

החזירו אותו לחממה, ולאחר הסרת בועות אוויר, החליפו את פיגום הריאות בשישה מיליליטר לדקה. היסטופתולוגיה של ריאה שלמה מציגה את הנאדיות והפנאומוציטים. כפי שניתן לראות כאן, דה-סלולריזציה מובילה להסרה מוחלטת של תאי הריאה, והיסטופתולוגיה של ריאות א-תאיות חושפת קרום בסיס שלם.

כתם הפנטכרום והאלסטין של מובט של ריאה נטולת תאים חושף נוכחות של קולגן, פיברין ואלסטין עם כלי דם וסימפונות שלמים. ניתוח DNA של הריאה הנטולת תאים מראה ירידה בתכולת ה-DNA של יותר מ-99%ניתן להשתמש בריאה הא-תאית ישירות בביו-ריאקטור לתרבית תאים. ניתוח היסטולוגי מראה נוכחות של גידול גידול.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להזריק את הפרין לחדר הימני של הלב. לאחר פיתוח זה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן לחקור את השינויים הגנטיים והאפיגנטיים המובילים לגרורות של תאי גידול בסרטן הריאות.