כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ
18 באוגוסט 2018
Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.
ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום האפרוציטוזיס כגון תפקידן של מולקולות איתות בתיווך ספיגת תאים אפופטוטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כימות ברור של ספיגת תאים אפופטוטיים, כולל קליטה חלקית או חלקית של תאים אפופטוטיים, מה שלא תמיד ניכר בשיטות אחרות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אפרוציטוזיס על ידי תאי חיסון, ניתן ליישם אותה גם על סוגי תאים אחרים כגון תאי אפיתל או סרטן.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הקושי לייעל את הגדרות רכישת המיקרוסקופ. לאחר הכנת מקרופאגים אנושיים ותאי ג'ורקט אפופטוטיים, השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים האפופטוטיים. לאחר מכן העבירו כמות מספקת של תאים אפופטוטיים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
גלולה את תאי הג'ורקאט באמצעות צנטריפוגה ב-500 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב -500 מיקרוליטר PBS. בזמן שתאי הג'ורקט נמצאים בצנטריפוגה, מכניסים 10 מיקרוליטר של DMSO לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.
לאחר מכן, יש להמיס כמות מינימלית של NHS-Biotin ב-DMSO. לאחר מכן, העבירו 500 מיקרוליטר של התא האפופטוטי ותרחיף PBS לצינור המכיל DMSO ו-NHS-Biotin. לאחר מכן, יש לדלל צבע מתאים למעקב אחר תאים בהתאם להוראות היצרן.
דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בחושך. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של RPMI 1640 עם 10% FBS, ודגר את המתלה בטמפרטורת החדר בחושך למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה ב -500 פעמים גרם למשך חמש דקות.
לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים המוכתמים ב-100 מיקרוליטר של RPMI 1640 עם 10% FBS. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים מוכתמים טיפה חכמה לכל באר של מקרופאגים. ואז צנטריפוגה את הצלחת ב -200 פעמים גרם למשך דקה.
דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 באינקובטור תרבית רקמות. לאחר תקופת הדגירה המתאימה, הסר את התאים מהחממה. לאחר מכן שטפו את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS.
לאחר מכן, הוסף סטרפטווידין מצומד FITC מדולל לכל באר. ודוגרים על הצלחת למשך 20 דקות בחושך. שטפו את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS, ונערו בעדינות את הדגימות במשך חמש דקות לאחר כל שטיפה.
לאחר מכן תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב- PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים פעם אחת עם PBS כדי להסיר עודפי PFA. הרכיבו כיסויים על שקופית הדמיה, והעבירו את השקופית למיקרוסקופ פלואורסצנטי.
לכוד ערימות Z של מספר מספיק של תאים לצורך כימות. זה קריטי להגדיר את המרחק בין החלקים האמורים כך שכל החומר האפופטוטי שנבלע יתגלה. המרחק המרבי בין החלקים האמורים לא צריך להיות גדול מעומק המוקד של עדשת האובייקט שלך, בדרך כלל 0.5 עד 1 מיקרומטר.
טען את אחת מערימות ה-Z לתוכנה באמצעות תכונת הייבוא. לאחר מכן בחרו באפשרות 'צפיפות משולבת' כאפשרות מדידה בחלונית 'קביעת מדידות'. הניתוח הוא הקל ביותר לביצוע אם גם הסטרפטווידין וגם ערוצי הצבע למעקב אחר תאים מוצגים כשכבת-על.
כל חפץ עם מכתים סטרפטווידין בכל מקום לאורך היקף צריך להיחשב חיובי לסטרפטווידין, ולכן אין לכמת אותו כשלילי לסטרפטווידין. לאחר טעינת התמונה, באמצעות הסטרפטווידין והיד החופשית, או כלי בחירת המצולעים, הקיפו בעיגול את כל החומר השלילי של סטרפטווידין העוקב אחר תאים במישור אחד של מחסנית Z. לאחר מכן, מדוד את העוצמה המשולבת של צבע מעקב התאים באזור.
באותו קטע Z השתמש בצביעה של סטרפטווידין, ובכלי בחירת היד החופשית או המצולע כדי להקיף את כל החומר החיובי לסטרפטווידין העוקב אחר תאים. לבסוף, למדוד את האינטנסיביות המשולבת של אזור זה. באמצעות הליך זה, יותר מ-95% מתאי הג'ורקאט שטופלו בסטאורוספורין עברו אפופטוזיס.
ברוב הניסויים, חלק התאים האפופטוטיים שעברו אפרוציטוז גדל בצורה תלוית זמן. בעת אופטימיזציה של פרוטוקול זה עבור סוגי תאים אפרוציטיים שונים, או מטרות שונות של תאים אפופטוטיים, חשוב לבדוק את טווח היחסים בין תאים אפופטוטיים לתאים אפרוציטיים. בדרך כלל יחסים של 10 לאחד או 30 לאחד עובדים הכי טוב.
ניתן לשנות הליך זה בקלות כדי לעקוב אחר הפעלת מולקולות איתות, או סחר תוך-תאי על ידי ביטוי גנים מדווחים פלואורסצנטיים בתאים האפרוציטים, ובכך לאפשר הדמיה של תהליכים אלה במהלך אפרוציטוזיס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לכימות אפרוציטוזה (efferocytosis), התהליך של סילוק פגוציטרי של תאים אפופטוטיים. השיטה מאפשרת להעריך מסלולי איתות של אפרוציטוזה ומספקת כימות ברור של בליעת תאים אפופטוטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- אפרוציטוזה (Efferocytosis) היא קריטית לשמירה על הומאוסטזיס תאי.
- היא כוללת זיהוי והפנמה של תאים אפופטוטיים על ידי פגוציטים.
- הבנת המנגנונים של אפרוציטוזה יכולה לספק תובנות לגבי מחלות שונות.
- ניתן להחיל שיטה זו על סוגי תאים שונים, כולל תאי מערכת החיסון ותאי סרטן.
מטרת המחקר
- לכימות ספיגת תאים אפופטוטיים על ידי תאי מערכת החיסון.
- לבחינת תפקידם של מולקולות איתות בתהליך האפרוציטוזה (efferocytosis).
- לספק שיטה מהימנה לחקר אפרוציטוזה בסוגי תאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של מקרופאגים אנושיים ותאי Jurkat אפופטוטיים.
- ספירת תאים אפופטוטיים באמצעות המוציטומטר.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך ויזואליזציה וכימות.
- אופטימיזציה של הגדרות הרכישה של המיקרוסקופ לקבלת תוצאות מדויקות.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות ברור של בליעת תאים אפופטוטיים.
- ניתן להעריך בליעה חלקית או הדרגתית של תאים אפופטוטיים.
- ניתן להפיק תובנות לגבי מנגנוני אפרורוציטוזה באמצעות גישה זו.
- הטכניקה ישימה לסוגי תאים שונים מעבר לתאי מערכת החיסון.
מסקנות
- פרוטוקול מיקרוסקופיה פלואורסצנטית זה משפר את ההבנה של תהליך האפרוציטוזיס (efferocytosis).
- הוא מספק כלי בעל ערך לחוקרים הלומדים על מוות תאי ופינוי תאים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומי מחקר אחרים העוסקים באינטראקציות בין תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של אפרocytosis באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תא בודד נותנת מענה לצורך קריטי במדידה מדויקת של בליעת תאים אפוप्टוטיים ובדיקת מסלולי סיגנלינג במחקרי אימונולוגיה ואונקולוגיה בשלבי הגילוי. גישה זו של סימון כפול מאפשרת הבחנה מדויקת בין חומר אפוप्टוטי שנבלע לבין חומר הקשור לפני השטח, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף של מטרות. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בנקודות מפתח בשלבי הגילוי המוקדמים ובפיתוח מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה קפדנית של היפותזות טיפוליות המערבות מסלולי אפרבציטוזה (efferocytosis).
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות המווסתות את פינוי תאים אפופטוטיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכנית על ידי כימות אירועי אפרבציטוזה חלקיים ומלאים.
- משפר את רמת הביטחון החזוית לצורך מיון תיקי מוצרים בהקשרי תאי מערכת החיסון ותאי סרטן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות תאיים עשויות ומאומתות לסריקה המשכית של מודולטורים של אפר ציטוזיס (efferocytosis).
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, המבדילות בין מטרות שהופנמו למטרות שאינן מופנמות.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת הרחבה (scalability) לצורך הערכת תרכובות.
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני סוגי תאי אפר ציטוזיס ומטרות מגוונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות לכימות של אפרציטוזה (efferocytosis) בתאי מערכת החיסון, בתאים אפיתליאליים ובתאי סרטן.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני של חומרים מווסתים של אפרציטוזה.
- תומך בקבלת החלטות מותאמות סיכון לגבי קידום הפיתוח, באמצעות קישור מדדי תאיים לסופי קצה תרגומיים.
- מציע הפחתת סיכונים חזויה עבור אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לפינוי תאים אפוטיים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם סימון כפול משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכת בבדיקת היפותזות, בפיתוח בדיקות (assays) ובמחקר תרגומי על אפרוציטוזה (efferocytosis).
- ביולוגיה של גילוי: מכמת את הפעילות האפרוציטית ואת האיתות, ומבהיר את תפקידי המסלולים ואת המנגנונים הביולוגיים.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות חסונות לבדיקת מוכנות ושחזוריות של המערך.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של חומר אפופטוטי קשור לעומת חומר שהופנם לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי הגילוי למודלים פרה-קליניים על ידי תמיכה במחקרים בסוגי תאים מרובים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה גמישה וניתנת להתאמה לכימות אפרוציטוזיס בתוכניות מו"פ שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר על אפרוציטוזה (efferocytosis).
- ערך תפעולי: מסטנדרט את הכמות, משפר את השחזוריות ותומך בתהליכי עבודה ניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון באמצעות אספקת נתונים ביולוגיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון וקידום של נכסים המכוונים לאפרוציטוזה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובניתוח תמונות.
- דורש גישה למכשור דימות באיכות גבוהה ולתוכנה אנליטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרמטרי רכישה וכמותיות.
- ניתן להתאמה לסוגים שונים של תאים אפופטוטיים ותאי אפרקטוזיס באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- אופטימיזציה של יחסי התאים והגדרות הדימות היא קריטית לשחזור התוצאות.
