ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים
20 באוקטובר 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ייצור של הערוץ מתיחה, כפול, איברים שבב microfluidic תא תרבות מכשירי recapitulating איברים ברמת פונקציונליות בתוך חוץ גופית.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את ייצור של התקנים microfluidic סדוק איברים עבור recapitulating פונקציונליות רמת האיבר במבחנה. פרוטוקול זה מתאר דרך לפברק התקנים סדוקים איברים recapitulating פונקציית רמת האיבר במבחנה. פאנק, המכשירים, כגון אלה, הם למעשה מפוברק באמצעות תבניות מודפסות 3D מתוך גומי סיליקון רך.
הגומי הזה מאפשר לנו למעשה להחדים את המכשירים האלה ברמזים מכניים שמאפשרים לנו למתוח את הרקמה כפי שהיית נכנס, נניח ריאה או מעיים. אנו מוסיפים גם שפע, המחקה את זרימת הדם ואת זרימת נוזלי הגוף האחרים בתוך מערכות איברים. עכשיו נלקח יחד, מכשירים אלה מאפשרים לנו למעשה לשחזר ולנסות להבין את הפיזיולוגיה המורכבת שקורה vivo.
אבל תעשה את זה במבחנה. אז בעיקרון אנחנו מתנסים בבני אדם, אבל לא באנשים. ולכן זו דרך יעילה מאוד לגישור על הפער בין מחקרים בבעלי חיים, שתמיד נעשים בהתפתחות פרה-קלינית של טיפולים, ואז לפני מחקרים בבני אדם, הנקראים ניסויים קליניים, שבהם קיים סיכון גדול בהרבה לאדם, לבטיחות האדם.
וכך המכשירים האלה עוזרים לגשר על הפער ולמעשה מאפשרים לנו לפתח טיפולים חדשים ולהבין את הביולוגיה הבסיסית שבאמת מתרחשת במערכות מורכבות כמו בני אדם. הכנת ערוץ העליון. נגב את הצד המבריק של כל חתיכת פוליאוריתן עם אתנול ומגבונים לחדר נקי.
מניחים את הצד המבריק של הפוליאוריטן מעל הצד הפתוח של התבנית במקום עובש. מניחים את מכלי עובש ופוליאוריתן לתוך ג'יג, בצד מרקם נגד סוף הג'יג. המשך לעשות זאת עד שכל התבניות הונחו בתוך הג'יג.
הדק את ה- jig על-ידי סיבוב ידיתו באמצעות מפתח ברגים, עד שהמרווח בין הג'יג הוא ברוחב של 25 מילימטרים. הפוך סירה של רדיד אלומיניום המקיף את התבנית במקום jig. יוצקים PDMS לתוך באר של כל עובש עד מלא.
ברגע שכל הג'יג מתמלא, מניחים את הג'יג לתוך מעביד הוואקום. לאחר שעה, הסר מידש. ומניחים לתנור סנטיגרד ב-60 מעלות לפחות ארבע שעות.
לפרק את הג'יג באמצעות מפתח ברגים. הסר את רצועות הפוליאוריטן מכל עובש. ולהשליך.
בזהירות demold חלקי PDMS מן התבניות שלהם ולהניח אותם תכונה בצד למעלה. בשורה את הלהב של מגרד האריחים בחריץ הכרטיסיה 'סוף'. וחותכים כל קצה כדי לאכלס את הרכיבים העליונים.
אחסן חלקים מוגמרים במנות פטרי מרובעות. לאחסן חלקים בארונות לחץ חיוביים בטמפרטורת החדר. הכנת ערוץ תחתון.
יוצקים 10.5 גרם של PDMS לתוך התבנית. ניתן להשתמש באקדח האוויר בעדינות רבה כדי להזיז את ה- PDMS מעל החלל. מניחים תבניות לתוך יבש ואקום.
לאחר שעה, להעביר את התבניות לתנור צל כיפת 60 מעלות. מניחים עובש על השולחן במכסה המנוע לזרימת למינאר. שחררו את ה-PDMS מקצה התבנית.
אוחזים בפינה אחת ומקלפים בעדינות את ה-PDMS מפני השטח של התבנית. בעת הסרה מלאה, הפוך והשכב על משטח העבודה כך שתכונות הערוץ יתווצו כלפי מעלה. חותכים לאורך קצוות חיצוניים עם חותך אריחים.
עם מדפים שטוחים ההנעה, חלקים שכב תכונה בצד על קלטת כדי להסיר את כל הפסולת. הסר חלק מקלטת האריזה. גרור את הקצה הרופף של החלק לאורך השקופית.
הקצה הרופף יהיה למינציה עם הזכוכית. תכונות כיסוי עם קלטת ויסקי. לאחסן חלקים בארונות לחץ חיוביים בטמפרטורת החדר.
הכנת קרום PDMS. ודאו שהופלים נקיים מ-PDMS מאחור. מניחים כל רקיק קרום בחריצים המיועדים.
השתמש מזרק mL אחד למקם 09 מ"ל של PDMS על המרכז של כל מערך פוסט רקיק קרום. תן PDMS לשבת לפחות חמש דקות. אפשר ל- PDMS להתפשט לאורך כל הפוסט של רקיק הממברנה.
אל תמשיך לשלב הבא עד שלפחות 75% ממערך הדואר יכסה ב- PDMS. פלזמה לטפל ברצועת פוליקרבונט באמצעות התנאים המתוארים בפרוטוקול. הסר גיליון פוליקרבונט ממכונת הפלזמה ולהשתמש מספריים לחתוך את יריעות פוליקרבונט לתוך 45 מילימטר על ידי ריבועים 45 מילימטר.
הניחו את הצד המטופל בפלזמה של ריבועי הפוליקרבונט על ה- PDMS, שבמרכזו רקיק הממברנה. מניחים רווח PDMS במרכז ריבוע פוליקרבונט. לאחר מכן מניחים פוליקרבונט בעל מרקם מקדים.
הוסף מגשים כך שמגש 3 יהיה מאחור, מגש 2 נמצא באמצע ומגש אחד נמצא מלפנים. למגש אחד יש חץ ליישור. פתח את שסתום לחץ הפלט, ולאט לאט לפתוח את שסתום לחץ הקלט.
זאת כדי שארבעת קילוגרמים של כוח יוחלו בהדרגה על כל רקיק קרום, בניגוד מיידי אשר עלול לשבור את הוופלים. לחץ על מתג AMF כדי להתחיל את מחזור הריפוי. לאחר מכן סגור את שסתום לחץ הקלט ולפתוח את שסתומי לחץ הפלט כדי לשחרר את הלחץ מן הצילינדרים האוויר.
מוציאים את המגשים ומביאים אותם למכסה המנוע של הזרימה למינארית. בזהירות לקלף את פוליקרבונט מרקם. הסר בזהירות את רווח ה- PDMS.
בדוק את קרום PDMS עבור אזורים עם חורים דרך. השתמשו בסמן כדי לעקוב אחר קווי המתאר של אזור חורי הדרך. כמו כן, סמן חורים או פגמים על הממברנות.
זוהי דוגמה של קרום לא מסומן המסומן. באמצעות פינצטה לטיפול בוופלים, שחררו וופלים מהמגש. מוציאים כל קרום מהופל ומ מניחים על צלחת פטרי.
קרום PDMS יהיה demold מן הוופל יהיה מלוכדות לגיבוי פוליקרבונט. לאחסן חלקים בארונות לחץ חיוביים בטמפרטורת החדר. הרכבה והכנה עליונות.
באמצעות סרט סקוטי מוגמר מט, לנקות את קרום PDMS, כמו גם את החלק הפנימי של צלחת פטרי כדי להסיר פסולת. ביסודיות להקליט את הצד תכונה של כל ערוץ גבוה העליון כדי להסיר פסולת. מניחים צמרות בצלחת פטרי עם קרום PDMS.
שים לב כי ממברנות מסוימות עשויות לקחת חלק עליון אחד או שניים. הערוצים העיקריים של כל חלק עליון צריכים להתאים בתוך האזור המסומן בתוך הממברנה. טען את צלחות פטרי לתוך הפלזמה.
פלזמה לטפל קרום העליון על פי הפרוטוקול בכתב. לאחר מחזור מליטה סיים, להסיר את הכלים ולהניח את החלקים העליונים מופעל על הממברנה. מניחים בתנור 60 מעלות צל כיריים למשך שעתיים לפחות.
באמצעות אזמל, עקבות סביב ההיקף של החלק העליון מלוכדות להפריד אותו מנשא פוליקרבונט. לאחר החלק הוא איתר, לקלף את החלק העליון מן פוליקרבונט. קרום PDMS כי יש מלוכדים לפסגה צריך לקלף מן המוביל גם כן.
באמצעות פינצטה להסיר את הממברנה מן היציאות לגשת לערוץ התחתון. אין להשאיר חלקים מהממברנה המכסים את יציאת הגישה. בנוסף להסיר כל פסולת או אבק עם פינצטה.
הרכבת שבבים. תכונה בצד למעלה, פלזמה לטפל הרכבות העליון עם תחתית. תחת מיקרוסקופ הפוך, יישר את ההרכבה העליונה עם החצי התחתון.
מניחים בתנור 60 מעלות צל כיריים למשך שעתיים לפחות. תוצאות. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההמצאה המדרגית של שבבי איברים PDMS. התקנים אלה מאפשרים תרבות של שני סוגי רקמות רבים על קרום נקבובי אלסטי.
ערוצי PDMS יצוקים באמצעות תבניות מודפסות בתלת-ממד, המאיצות את בנייתן של עיצובים חדשים. הערוצים המובילים יצוקים בתבניות תחת דחיסה כנגד אטם פוליאוריתן תואם לייצור רכיבים עם יציאות מעוצבות. בעוד רכיבי הערוץ התחתון יצוקים במגשים ומטופלים בגיבוי שקופיות מיקרוסקופ.
גישת ייצור זו משלבת תבניות מרובות קנה מידה של החלקים לשלב אחד, החוסך זמן, משפר את הרבייה ואת עקוות, ומפחית פסולת שנוצרת על ידי ניקוב יציאות וצעדי חיתוך מרובים. הממברנות הנקבוביות חיוניות לתפקוד שבב האיבר, וגישת ההמצאה המבוססת על יציקה נגד פרוסות סיליקון בדוגמת גורמת לקרומים בעובי עקבי ובגימור פני השטח. טיפול באמצעות נשאי פוליקרבונט מאפשר ייצור ואחסון גדולים יותר של אצווה.
שבב האיברים המורכב מורכב משני ערוצי שפע בחבילה שקופה אופטית. באזור החופף, קרום PDMS נקבובי מאפשר אינטראקציה רקמה-רקמה של מטבוליטים, חלבונים, טיפולית, פתוגנים ותאים כדי לסכם את תפקוד שבב האיבר בעוד שני ערוצים מקבילים משני הצדדים משמשים כדי לספק זן מכני, באמצעות הפעלה ואקום מחזורי. נקבוביות קרום PDMS ביו-רפואי תומך שטף של מטבוליטים, גורמי גדילה, ואפילו תאים בין כלי הדם ופרנצ'ימה איברים.
חדירה לכאורה של הממברנה נקבע באמצעות די ריכוז בתחלות שקע עם ובלי תאי המעי Caco-2. שכבות תאי שבב המעיים מספקות מחסום מוגבר באופן משמעותי לחלחלות. ניתן להפעיל את שבב האיבר באמצעות תעלות ואקום מקבילות כדי להחיל כמותית ומשכפלת עומס זן מחזורי על הממברנה, ולכן הרקמות המתורבתות.
זן מחזורי זה בשילוב עם שפע מדיה תומך בידול הסלולר כדי לחקות טוב יותר בפיזיולוגיה של איברים vivo, כגון היווצרות של villi בשבב הבטן. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, עכשיו אתה אמור להיות מסוגל לפברק שבב איברים PDMS למתוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של התקני תרבית תאים מיקרופלואידיים בעלי ערוצים כפולים, נמתחים, מסוג "איבר על שבב" (organ chip). התקנים אלה תוכננו לשחזר תפקוד ברמת האיבר in vitro, תוך חיקוי של תנאים פיזיולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרופלואידיקה
- תרבית תאים
- טכנולוגיית איבר-על-שבב
רקע
- שבבי איברים משמשים לסימולציה של תפקודי איברים in vitro.
- רמזים מכניים חשובים להתפתחות רקמות.
- הדפסה בתלת-ממד מאפשרת ייצור מדויק של תבניות.
- התקנים אלו יכולים לחקות את זרימת הדם ודינמיקה של נוזלי גוף אחרים.
מטרת המחקר
- ליצור התקני איברים על שבב (organ-on-a-chip) המדמים תפקודי איברים.
- להבין תהליכים פיזיולוגיים מורכבים in vivo.
- לספק פלטפורמה לחקר תגובות ספציפיות לאיברים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדפסת תלת-ממד של תבניות באמצעות גומי סיליקון רך.
- שילוב יכולות מתיחה מכנית.
- הטמעה של מערכות פרפוזיה לחיקוי זרימת דם.
- בדיקת התפקוד של ההתקנים המיוצרים.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של התקמי "איבר על שבב" (organ chip) נמתחים.
- ההתקנים הדגימו יכולת לחקות תפקודי איברים.
- רמזים מכניים השפיעו באופן חיובי על התנהגות הרקמה.
- מערכות פרפוזיה שחזרו ביעילות את הדינמיקה של הנוזלים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לייצור שבבי איברים (organ chips).
- התקנים אלו יכולים לשפר את ההבנה של פיזיולוגיית האיברים.
- יישומים פוטנציאליים בבדיקת תרופות ובמידול מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכנולוגיית "איבר על שבב" (Organ-on-a-Chip) אנושית נותנת מענה למחסום קריטי בפיתוח תרופות, על ידי אספקת מודלים in vitro רלוונטיים לבני אדם המנבאים תוצאות קליניות טוב יותר ממחקרים בבעלי חיים. פרוטוקול ייצור בר-הרחבה זה מאפשר ייצור הדיר של התקני מיקרופלואידיקה בעלי שני תעלים ובעלי יכולת מתיחה, לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של מועמדים לטיפול תרופתי. באמצעות שחזור פיזיולוגיה ברמת האיבר ורמזים מכניים, הטכנולוגיה תומכת בתיקוף מטרות ובביטחון ניבוי בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות אינטראקציות רקמה-רקמה אנושיות על גבי ממברנות נקבוביות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי מידול רמזים מכניים ופרפוזיה הספציפיים לאיבר.
- ערך ניבואי: מגביר את הביטחון במעורבות המטרה על ידי שחזור תפקודי מחסום והובלה דמויי in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספקת פלטפורמות מיקרופלואידיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור לסריקת תרכובות עם זרימה ומתיחה פיזיולוגיות.
- ערך תפעולי: מאפשרת מוכנות של הבדיקה באמצעות ייצור בר-הרחבה המשתמש בתבניות בהדפסת תלת-ממד ונשאי פוליקרבונט.
- ערך של תפוקה: מאפשרת בדיקה מקבילה של שני סוגי רקמות תחת תנאי פירפוז ומכניקה מבוקרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מגשר בין שלב הגילוי לשלב הפרה-קלמיניโดย מידול תגובות של איברים אנושיים לטיפולים תרופתיים ופתוגנים.
- ערך תפעולי: תומך בקבלת החלטות לגבי קידום הפיתוח בהתאם לסיכונים, באמצעות מדידות כמותיות של חדירות ושלם המחסום.
- המשכיות תרגומית: מתואם עם מחקרי סממנים ביולוגיים על ידי אפשור ניתוח זרימה של חלבונים ומטבוליטים דרך ממשקי רקמות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת הייצור משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אפשור אב-טיפוס מהיר של שבבים ספציפיים לאיברים לצורך בדיקת היפותזות והערכה של תרכובות מובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי מידול אינטראקציות בין רקמות תחת מאמץ פיזיולוגי וזרימה.
- סינון (Screening): מספקת סטנדרטיזציה של בדיקות ושחזור באמצעות תעלות יצוקות ונקבוביות ממברנה עקביות.
- אנליטיקה: מאפשרת קריאות כמותיות כגון חדירות גלויה ותפקודי מחסום להשוואת תרכובות.
- מחקר טרנסלציוני: מקשרה לתיקוף פרה-קליני באמצעות פיזיולוגיה ברמת איבר רלוונטית לבני אדם והפעלה מכנית מחזורית.
- שימוש חוזר ארגוני: ממצבת את פלטפורמת הייצור כיכולת הניתנת לשימוש חוזר ליצירה ואחסון של שבבי רב-איברים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי באמצעות שבבי-איברים (organ-chips) רלוונטיים לבני אדם, המפחיתים עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה (סקילביליות) באמצעות תבניות בהדפסת תלת-ממד וטיפול מבוסס נשאי פוליקרבונט.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים, הודות לאפיון מוקדם של יעילות ורעילות רלוונטיות לבני אדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מובילים (leads) מותאם סיכונים, בהתבסס על נתוני חדירות ומחסומי הפרדה שהופקו משבבי-איברים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבת התקני מיקרופלואידיקה, קישור בפלזמה (plasma bonding), ותרביות רקמה תחת גירוי מכני.
- תלוי בגישה למייבשי ואקום (vacuum desiccators), תנורים, מabilis זרימה למינרית, והדפסה בתלת-ממד ליצירת תבניות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ספי thresholds של נקביות הממברנה ופרמטרי פרפוזיה להשגת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הפלטפורמה לסוגי איברים שונים בעלי רמזים מכניים וביוכימיים משתנים.
- מגבלות מעשיות כוללות שלבי טיפול ידני במהלך בדיקת הממברנה ויישור המכסה לממברנה תחת מיקרוסקופ.
