Name: וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: למד מודולציה של קולטני NMDA בתאי HEK 293 באמצעות שיטת סידן השטף לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול במחלות נוירולוגיות. השיטה מאפשרת ניתוח רגישות לליגנדים ואנטגוניסטים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצה להודות סניף בגרות מלומדים תוכנית ומכונים נוברטיס למחקר ביורפואי בכללותה למימון מחקר זה.

1. הכנת תאים
הערה: פרוטוקול זה, לרבות נתונים הדור, משתמשת HEK293 תאים transduced עם baculovirus קידוד תאים NR1 ו- NR2A.
<ol><li>זרע מספר מתאים של תאים HEK293 ולהוסיף את הוירוס NR1 ו/או NR2A בריכוזים הסופית המתאימה (1.00 µL כל אחד). צלחת 384-ובכן, לשימוש 10,000 תאים/טוב באמצעי אחסון הסופי של 30 µL.</li>
	<li>לחלופין, זרע HEK293-NR1-NR2A תאים תאים מתאים המספר, נפח (עבור צלחת 384-ובכן, שימוש 10,000 תאים/באר נפח סופי של 30 µL). להוסיף טטרציקלין בכל ריכוז של µg/mL 2 כדי לגרום NR2A ביטוי ולהוסיף את ההגנה המורכב (100 מיקרומטר MDL105, 519 או 5 מיקרומטר CGP07066724).</li>
	<li>הערה: baculovirus קידוד NR1 ו NR2 צריך כייל נוגדנים משוער של בין 5 x 109 - 10 x 109 יחידה זיהומיות לכל מיליליטר24.</li>
</ol>2. מדידה של פעילות קולטן NMDA
<ol><li>להכין צלחת 384-טוב עם HEK293 תאים transduced עם תאים NR1/NR2 או HEK293-NR1-NR2A בנוכחות או מתחם הגנתי. השתמש התחתון ברור, מסגרת שחורה, לוח מצופה פולי-D-ליזין. הערה: הגנה עם 100 מיקרומטר MDL105, 519 משמש כדי להתייעץ רגישות גליצין, תוך 5 מיקרומטר CGP070667 משמש כדי להתייעץ רגישות גלוטמט.</li>
	<li>תקופת דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2 של 16 שעות (לילה).</li>
	<li>הסר את הלוחית של החממה וזורקים בעדינות את המדיה הנייד על ידי האטה של היפוך את הצלחת מיכל biowaste תואם. טפח בעדינות על הלוחית מגבת נייר נקי התקשורת את קצות של הצלחת ומסננים כל התקשורת הנותרים.</li>
	<li>הכן calcium6-לצבוע באמצעות solubilizing בקבוקון אחד של צבע calcium6 (בגודל צלחת 1) ב- 10 מ"ל הדגירה מאגר (HBSS pH 7.5, 20 מ מ. HEPES, מ מ 1 MgCl2, probenecid 1 מ"מ). תקופת דגירה לצלחת של 2 שעות-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>הסר את הלוחית של החממה ולתת את התאים להסתגל בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.</li>
	<li>שופכים בעדינות את calcium6-הצבע כפי שמתואר בשלב 2.3 ולהוסיף µL 30 מאגר assay (HBSS pH 7.5, 20 מ מ. HEPES, מ מ 1.8 CaCl2, probenecid 1 מ"מ).</li>
	<li>חזור על שלב 2.6 פעמיים עבור סכום כולל של 3 מנקי. השאירו 30 µL assay מאגר על התאים לאחר לשטוף את האחרון.</li>
	<li>תן את התאים לנוח 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכן את הצלחת ליגנד על ידי מלאי 4-fold של 400 מיקרומטר גליצין ו- 400 גלוטמט מיקרומטר (הריכוז הסופי של 100 מיקרומטר; ריכוז אופטימלי של ליגנדים נקבע כמפורט להלן). העברת מינימום של 25 µL של ליגנד מניות לתוך צלחת 384-ובכן V-התחתון.</li>
	<li>טען את צלחת ליגנד וצלחת תא FDSS (פונקציונלי סמים הקרנת מערכת).</li>
	<li>למדוד את הבסיס קרינה פלואורסצנטית (Fo) של צלחת תא למשך 30 שניות. העברת µL 10 של המניה ליגנד לתוך הלוח התא באמצעות הפונקציה שחולק FDSS ולמדוד את שטף סידן על ידי הקלטה calcium6 צבעי זריחה במשך 5 דקות.</li>
	<li>לחשב את יחס פלורסצנטיות מקסימלי על ידי חלוקת של זריחה מקסימלי מתקבל על ידי ידי קרינה פלואורסצנטית בסיסית (Fמקסימום/Fo).</li>
</ol>3. אופטימיזציה של רמות הביטוי NMDAR
<ol><li>כדי לקבוע את כמות אופטימלית baculovirus להשתמש, בצע טיטור של וירוסים הן NR1 והן NR2A. להכין צלחת 384-ובכן עם תאים HEK293 (המלצה של 10,000 תאים/טוב, 30 µL של המדיה), כוללים את תרכובות הגנה כפי שמתואר בשלב 2.1.</li>
	<li>להוסיף כמויות משתנות של הנגיף NR1 בשורות שונות של הצלחת (לדוגמה: להוסיף 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0.5 µL, 0.25 µL בשורות A-E בהתאמה). הוסף פריטים כפולים על דיוק הנתונים.</li>
	<li>להוסיף כמויות משתנות של הנגיף NR2A בעמודות שונות של הצלחת (לדוגמה: להוסיף 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0.5 µL, 0.25 µL בשורות A-E בהתאמה). הוסף פריטים כפולים על דיוק הנתונים.</li>
	<li>תקופת דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2 של 16 שעות (לילה).</li>
	<li>לקבוע את יחס אופטימלי והכמות של וירוסים NR1 ו- NR2A על ידי ביצוע מדידה השטף סידן FDSS (ראה לעיל).</li>
</ol>4. ליגנד טיטור
<ol><li>הכינו את התאים כפי שמתואר בשלב 2.3.</li>
	<li>להכין דילולים של כל ליגנד בנוכחות קולח ריכוזי (100 מיקרומטר) של ליגנד אחרים כמו פתרון מניות 4-fold. לדוגמה: עבור ריכוז המבחן האחרון 10 מיקרומטר של גליצין, להכין פתרון מיקרומטר 40 מניות של גליצין כולל 400 גלוטמט מיקרומטר.</li>
	<li>להמשיך עם מדידה FDSS כפי שמתואר בשלב 2.11.</li>
</ol>5. מתחם בדיקות
<ol><li>הכינו את התאים כפי שמתואר בשלב 1.</li>
	<li>הכינו את הצלחת ליגנד עם מלאי 5-fold של ליגנד הסופי ריכוז במאגר וזמינותו.</li>
	<li>הכינו את הצלחת תרכובות עם התבואה 4-fold ריכוז הסופי הרצוי של תרכובות במאגר וזמינותו. עבור ריכוז במתחם הסופי של 10 מיקרומטר במאגר assay, להכין פתרון מניות 40 מיקרומטר.<ol>
<li>לשמור את הריכוז של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) קבוע בכל הדוגמאות על-ידי הכנת לדילול מראש מתחם דימתיל סולפוקסיד לפני דילול נוסף למאגר וזמינותו.</li>
		<li>לתגובה במינון של המתחם ב הסופית assay הנעים בין 3 ל 30 מיקרומטר, להכין מראש לדילול של המתחם ב דימתיל סולפוקסיד בין 1 ל 10 מ מ. לדלל אותם במאגר assay לריכוז מניות 4-fold. ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי לא יעלה על 0.5%. הערה: מומלץ לבדוק כל מדגם triplicates.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטעון של ליגנד, מתחם ו תא צלחת לתוך FDSS.</li>
	<li>למדוד את פלורסצנטיות בסיסית למשך 30 שניות.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של מניות מתחם ולמדוד את זריחה במשך 5 דקות.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של ליגנד מניות ולמדוד את זריחה במשך 5 דקות.</li>
	<li>לקבוע האינטגרל של היחס בין זריחה על-ידי חישוב השטח מתחת העקומה של היחסים פלורסנט במהלך 5 הדקות האחרונות של המדידה. הערה: לחלופין, היחס מקסימלי של קרינה פלואורסצנטית לאחר תוספת ליגנד יכול לשמש לניתוח.</li>
</ol>

<ol><li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li>
<li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional%2C+lifespan+and+systems+vulnerability+view%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li>
<li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li>
<li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channels%3A+structure%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li>
<li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li>
<li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li>
<li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li>
<li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunit+diversity%3A+impact+on+receptor+properties%2C+synaptic+plasticity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383(2013).</li>
<li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+NMDA+receptor+composition%3A+many+regulators%2C+many+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li>
<li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition%3A+limitations+of+the+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li>
<li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li>
<li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+block+by+Mg2%2B+of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li>
<li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li>
<li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li>
<li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases%3A+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li>
<li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li>
<li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li>
<li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A%2C+R1-2B%2C+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li>
<li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine%2FD-serine%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608(2017).</li>
<li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li>
<li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li>
<li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A%2F2A%2C+rather+than+1A%2F2B+receptor+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li>
<li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors%3A+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li>
<li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים ולא לחשוף.

הצלחת assay זו תלויה במידה רבה על בריאות התאים HEK בשימוש. תאים שעברו הצמיחה המעריכית, עם מספר נמוך המעבר אמור לשמש. Assay הזה כרוך העברות רבות, תוספות של פתרונות, זאת באמצעות התראה יבטיחו דיוק גבוה יותר בתוצאות שלה. ריכוזים של תרכובות וחומרים כל אחרים צריך להיות גם הצלבת למזער שגיאות. בעת החלפת המדיה הנייד עם המאגר assay וזמינותו השטף סידן, הלוח צריך להיות מוטה בעדינות כך התאים אל תנתק כעת. בסופו של דבר, השימוש של פולי-D-ליזין צלחות מצופה ב פרוטוקול זה מגדילה את קובץ מצורף של התאים לצלחת.
יית...

עם ההתקדמות הנוכחית ברפואה, אמנם תוחלת החיים עלתה באופן משמעותי; עם זאת, אז יש השכיחות של מחלות הקשורות לגיל. מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כגון סכיזופרניה, נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, בין היתר, ללא יוצא מן הכלל, ההקרנות להגדיל מעל הבא העשור1, 2 , 3. לתפקודו של רצפטורים גלוטמט ionotropic המכונה קולטנים N-מתיל-D-אספרטט (NMDAR) נקשר מחלת אלצהיימר סכיזופרניה, פגיעה מוחית טראומטית, שבץ מוחי, סוכרת, גלאוקומה בין היתר, אשר מצדיק צריך ללמוד את הביולוגיה שלהם לפיתוח טיפולים יעילים, מחלות שינוי4,5,6,7.
NMDARs מורכבים ארבע מונומרים או subunits4,8,9. ההרכב מבנית של NMDAR מראה השתנות התפתחותית ואזוריים בתוך המוח ה-7,10. NMDARs מעורבים פלסטיות סינפטית, קוגניציה, הדור של מקצבים נשימה, גפיים11,12,13. כערוץ ממותגת מתח, זה בעיקר הלא-ניצוח ב נח קרומית אפשרית (-70 mV), חסומה על-ידי מגנזיום כדי למנוע הסתננות של יונים. הערוץ מופעל על-ידי האיגוד של ליגנדים שני, גלוטמט, גליצין/D-סרין, דפולריזציה בו זמנית ב קרום סינפטית מתווך על ידי אמפא רצפטורים, מחלקת נוספת של רצפטורים גלוטמט ionotropic. דפולריזציה הסרת חסימה מגנזיום של NMDAR, הפעלת זרם של קטיונים, בעיקר סידן14,15,16. למרות הפעלת NMDAR חיוני להישרדות תא, הפעלת יתר יכול לגרום לתא המוות17,18,19 דרך excitotoxicity. זה, בנוסף האופי המורכב של הקולטן, הופך מאתגרת כדי לבצע מחקרים הדרושים לפיתוח טיפולים יעילים.
שיטות שונות פותחו כדי ללמוד את NMDAR. עם זאת, לכל אחד יש ליווי אזהרות. לדוגמה, טכניקה אחת נפוץ הוא מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד בתיווך NMDAR שינויים תאיים הסידן קו תא יציב תחת השליטה של טטרציקלין-inducible מקדם מכירות (ט-על)20. עם זאת, במערכת זו, supramaximal את ריכוזי ליגנדים הנדרשים הדרישה כי מעכבי NMDAR הן נוכח בזמן המדידה מקל כמעט בלתי אפשרי. לאתר הפעילות של אנטגוניסט תחרותי. במערכות דומות אחרות, הביטוי של הקולטן פונקציונלי גורמת רעילות, הדורשים חוסמי ערוצים כגון קטמין21,,22 , כדי לשמר על תרביות תאים. חוסמי ערוצים אלה לשבת בליבה של הקולטן, קשה לשטוף, במיוחד בתבנית המבוססת על צלחת, אז הם מפריעים מחקרים פונקציונלי של הקולטן. לבסוף, ב מדידות אלקטרופיזיולוגיות כגון תיקון מחבר חובק למעקה, יש תפוקה מוגבלת, מחקרים בקנה מידה גדול הם יקרים מאוד23. על אף האמור, המערכות הנ ל הן רגישות לגירוי גליצין; לפיכך, לומד גליצין תלוית פעילות של NMDAR הופך להיות אתגר.
כאן, אנו מתארים גישה מוזרה ללמוד NMDAR מתגבר על המגבלות שנדונו. הטכניקה שלנו הופך לרישית במערכת הביטוי baculovirus להביע את הקולטן ברמות פונקציונלי עם יחס מיטבי של subunits מעט ככל 16 שעות. יתר על כן, השימוש baculovirus מאפשר גישה קומבינטורית ופשוט, אשר מספק אפיון רחבה של סוגי NMDAR רקומביננטי המשנה ברורה. שלא כמו שאר מבחני, פרוטוקול זה אינו דורש חוסמי ערוצים בשל השימוש היריבים חלש. היתרון החזק ביותר של השיטה הזו שטיפה אחרי של אנטגוניסט חלש, הקולטן הוא רגיש אפנון של האתרים הבודדים גליצין ו גלוטמט-מחייב בנוסף אפנון כפול של גליצין/D-סרין והן גלוטמט ליגנד מחייב אתרים. וזמינותו recapitulates ידוע פרמקולוגיה של הקולטן NMDAR ואת ההשפעות של מאפננים הידוע שלה חיוביים ושליליים. לבסוף, מהדור הזה במבחנה הסלולר assay מתגבר על הסלולר רעילות הנגרמת על ידי זרם סידן מופרזת ומאפשר ללימודי פונקציונלי של הקולטן באופן תפוקה גבוהה, אשר יכולים להאיץ את התגליות של NMDAR מאפננים במצבי מחלה.

<table><tbody><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>קולטן NMDA (NR1/NR2A) קולטן קו תאים</td><td>ChanTest Corporation</td><td>CT6120</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac וקטור ביטוי כפול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10712-024</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 384 באר שקוף שטוח תחתון מיקרופלייט</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>3844</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR סידן 6-QF ערכת בדיקה</td><td>מולקולרית מכשירים</td><td>R8192</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>D-סרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S4250</td><td></td></tr><tr><td>L701,324</td><td>טוקריס</td><td>907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES מאגר</td><td>בוסטון ביו מוצר</td><td>BB-103</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX מדיה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>MDL105,519</td><td>NIBR</td><td>מסונתז בבית</td><td></td></tr><tr><td>NVP-AAM077</td><td>NIBR</td><td>מסונתז בבית</td><td></td></tr><tr><td>CGP070667</td><td>NIBR</td><td>מסונתז בבית</td><td></td></tr></tbody></table>

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני nmda עם רגישות גליצין/d-סרין, גלוטמט

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) קולטנים (NMDAR) מסווגים רצפטורים גלוטמט ionotropic ויש תפקידים חיוניים בלמידה ובזיכרון. תקלה NMDAR, מבוטא כמו גם נגמר - או תחת - activity נגרמת על ידי מוטציות, ביטוי שונה, סחר או לוקליזציה, יכול לתרום מחלות רבות, במיוחד במערכת העצבים המרכזית. לכן, הבנה ביולוגיה של הקולטן וכן הקלת הגילוי של תרכובות מולקולות קטנות הוא מכריע המאמצים המתמשכים כדי להתמודד עם מחלות נוירולוגיות. לגישות ללמוד את הקולטן יש מגבלות כולל תפוקה נמוכה, עלות גבוהה של חוסר היכולת ללמוד יכולותיו פונקציונלי בשל נוכחותם הכרחי של חוסמי ערוצים כדי למנוע excitotoxicity בתיווך NMDAR. בנוסף, המערכות assay קיימים רגישים לגירוי על ידי גלוטמט בלבד, חסרי רגישות גירוי על-ידי גליצין, ליגנד שיתוף אחרים של NMDAR. כאן, אנו מציגים וזמינותו הראשון המבוסס על צלחת עם תפוקה גבוהה כוח ללמוד על קולטן NMDA עם רגישות ליגנדים שיתוף, גלוטמט, D-סרין/גליצין. גישה זו מאפשרת לימוד יצירות שונות של יחידת משנה NMDAR ומאפשר לימודי פונקציונלי של הקולטן במצבי גליצין - ו/או רגישים גלוטמט. בנוסף, השיטה אינה דורשת הנוכחות של מעכבי במהלך המדידות. ניתן להבחין את השפעות חיוביות ושליליות מאפננים allosteric עם זה וזמינותו, פרמקולוגיה הידוע של NMDAR כוכבנו במערכת שלנו. טכניקה זו גוברת על המגבלות של שיטות קיימות והיא חסכונית. אנו מאמינים טכניקה חדשנית זו. נאיץ את הגילוי של טיפולים בתיווך NMDAR פתולוגיות.

לפני בחינת השפעת מולקולות קטנות, אחד חייב לקבוע את רמות ביטוי אופטימלית של NMDARs, כמו גם ריכוז אופטימלי ליגנד. כפי שתואר, HEK293 התאים היו נזרע ב 10,000 תאים לכל טוב בצלחת 384-ובכן, בנוכחות 5 מיקרומטר CGP060667, ואז transduced עם כמויות משתנות של NR1 ו- NR2A וירוסים. לאחר דגירה לילה, הנוצרות על-ידי ליגנד סידן נמדדה השטף (איור 1). התוצאות של ניסויים אלה חושפים את כמות הטוב ביותר ואת יחס של וירוס לשימוש עבור כל יחידה משנית (איור 1...

המטרה של פרוטוקול זה נועד להקל על המחקר של קולטני NMDA (NMDAR) בקנה מידה גדול יותר, לאפשר הבחינה של תופעות modulatory של מולקולות קטנות ושימושיהם טיפולית.

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

שיטה זו יכולה לסייע בגילוי מאפנני NMDA לטיפול במחלות נוירולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מחקר פיסום של פעילות קולטני NMDA, בתגובה לריכוזי הגנה או שילובים של ליגנדים בתרכובות. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי היכולת הכללית של קולטן NMDA.ניתן ליישם אותו גם לחקר תת-סוגים ספציפיים בביולוגיה ורגישות לקולטן NMDA, בתגובה לליגנדים או תרכובות. כדי למדוד את הפעילות של קולטן NMDA, הכינו צלחת באר 384, עם תאי HEK 293, שהומרו עם תאי NR1, NR2 או HEK 293, NR1, NR2A בנוכחות תרכובת מגן. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני למשך 16 שעות.למחרת, הוציאו את הצלחת מהחממה, והשליכו בעדינות את המדיה התאית, על ידי הפיכת הצלחת באיטיות על מיכל פסולת ביולוגית תואם. הקש בעדינות על הצלחת על מגבת נייר, כדי לנקות את המדיה מקצוות הצלחת, ולנקז את כל המדיה שנותרה. לאחר מכן, הכינו את צבע הסידן 6, על ידי המסה של בקבוקון אחד של צבע סידן 6, ב-10 מיליליטר של מאגר דגירה.הוסף 30 מיקרוליטר מהצבע לתאים בצלחת 384 הבאר. דגרו את הצלחת למשך שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס, וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. לאחר שעתיים, הוציאו את הצלחת מהחממה, ותנו לתאים להסתגל לטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.לאחר מכן, שפכו בעדינות את צבע הסידן 6, והוסיפו 30 מיקרוליטר של מאגר בדיקה. חזור על

a-high-throughput-calcium-flux-assay-to-study-nmda-receptors-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

כאן אנו מתארים עיבוד של פרוטוקולים המשמשים כדי לגרום פלסטיות homeostatic בנוירונים לחקר הפלסטיות של קולטני G-חלבון בשילוב astrocytic. לאחרונה משמש כדי לבחון שינויים בקבוצת astrocytic אני mGluRs בעכברים לנוער, ניתן ליישם השיטה למדידת קנה מידה של GPCRs astrocytic השונות, ברקמות של עכברים בוגרים באתרו וin vivo, ולקבל הערכה טובה יותר של הרגישות של קולטני astrocytic לשינויים בפעילות עצבית.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

אנו מתארים את השילוב של תמונה-הפעלה מושרה UV מוקד של תרכובות נוירו פעיל עם כל תא תיקון מהדק והדמיה רב פוטון של עוברי נתרן תאיים בדנדריטים ועמוד שדרה של תאי עצב בהיפוקמפוס בחתכי רקמה חריפים של מוח העכבר.

רב פוטון תאית נתרן הדמיה בשילוב עם משחרר רפרוף מיקוד בתיווך UV של גלוטמט בCA1 פירמידת נוירונים

כאן, אנו מתארים את ההתקנה, תוכנת ניווט, וניתוח נתונים עבור שיטה מרחבית מדויקת ובזמן של מדידת טוניק ושינויי גלוטמט תאי פאזית in vivo באמצעות מערכי microelectrode enzyme-linked (MEA).

באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר

יכול להיות מאופנן דעתנית עצביים באמצעות תהליך דינאמי של אנדו - אקסוציטוזה של רצפטורים גלוטמט ionotropic סינאפסות. המתוארים כאן הוא assay הנגיש, תיכון-תוכן לכימות תנועת משטח ופנימיים קולטן האוכלוסייה בריכות.

וזמינותו גבוהים-תוכן עבור ניטור אמפא קולטן סחר

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את האיזון בין שחרור גלוטמט לבין הסיווג ב corticostriatal glutamatergic בודד בפרוסות חריפה מעכברים למבוגרים. פרוטוקול זה משתמש חיישן פלורסנט iGluu עבור זיהוי גלוטמט, מצלמה scmos עבור רכישת אותות והתקן עבור תאורה לייזר מוקד.

בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במבחנה Ca2+ שטף בנוירונים המוח האמצעי ואת ההשפעות שלהם במורד הזרם על caspase-3 באמצעות תרביות המוח האמצעי של העכבר הראשי. מודל זה יכול להיות מועסק כדי ללמוד שינויים פתופיזיולוגיים הקשורים פעילות Ca2+ חריגה בנוירונים המוח האמצעי, ולסנן טיפולים רומן עבור תכונות אנטי אפופטוטיות.

כימות ספונטני Ca2+ שטף ואת ההשפעות במורד הזרם שלהם בעכבר ראשי נוירונים המוח האמצעי

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

למד מודולציה של קולטני NMDA בתאי HEK 293 באמצעות שיטת סידן השטף לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול במחלות נוירולוגיות. השיטה מאפשרת ניתוח רגישות לליגנדים ואנטגוניסטים שונים.

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט

גלה סרטונים נוספים