דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלת הכליות. במיוחד בהבנת הגלומרולוס במצבים נורמליים וחלים. ביולוגיה גלומרולרית יכולה להיות קשה ללמוד בשל מגוון סוגי התאים הקיימים והמבנה הייחודי שלהם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לספק מקור זמין של גלומרולי שלם באמצעות שיטות וציוד פשוטים. לטכניקה זו יש השלכות על הבנתנו את מחסום הסינון בכליה הרגילה והמחלה. בפרט, זה יכול לשפוך אור על ההבנה שלנו של מחלת כליות כרונית פרוטאינורית שבה פגיעה גלומרולרית מובילה הפרשה גבוהה באופן חריג של חלבונים בסרום לתוך השתן.

בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו להשיג תשואה נאותה וטוהר המדגם הסופי. הפגנת ההליך תהיה בריטני ראש, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להשתמש קוצץ שיער כדי להסיר שיער מהבטן לפנים של חולדה המתת לחץ.

השתמש 70% אתנול כדי לנקות את העור החשוף. לאחר מכן, באמצעות מספריים כירורגיים, לעשות חתך קו האמצע בעור. כדי לחשוף איברים פנימיים, לבצע חתך קו האמצע דרך שכבת השריר.

אתר ובודד את הכליות והנח לתוך צינור חרוט פלסטיק סטרילי 50 מיליליטר עם 30 מיליליטר של תסכולת המלח של האנק או HBSS להציב על קרח. מעבירים את הצינור על הקרח למכסה המנוע של תרבות התאים הסטריליים. מעבירים את הכליות לצלחת פטרי סטרילית המכילה חמישה מיליליטר של HBSS המונחים על קרח.

השתמש מספריים מטלפים חדים כדי להסיר ולהשליך שומן perirenal. כדי להסיר ולהשליך את הכמוסות המקיפות את הכליה, לעשות חתך שטחי קטן ולאחר מכן להשתמש במטחים חדים כדי למשוך אותו בעדינות מן הכליה. מניחים את הכליות על גזה סטרילית בצלחת פטרי שנייה עם חמישה מיליליטר של HBSS ומחלקים כל כליה לשניים דרך קטע באמצע קשת.

השתמש אזמל כדי להסיר ולהשליך את medulla אשר ניתן לזהות על ידי צבע כהה יותר שלה מיקום מרכזי. מעבירים את החלקים הנותרים המכילים בעיקר את קליפת הכליות, לתוך צלחת פטרי שלישית עם חמישה מיליליטר של HBSS. השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לטחון אותם עד שהחתיכות יהיה בגודל של פחות ממילימטר אחד או עד להיווצרות הדבק.

השתמשו ב-1%BSA PBS כדי להרטיב את החלק העליון והתחתון של מסמר 180 מיקרומטר מעל מקור פסולת של 500 מיליליטר. צעד זה הוא קריטי כפי שהוא מצופה את מסמר עם חלבון ומפחית את הדבקות של glomeruli אשר לאחר מכן לשפר את התשואה. מניחים את קליפת המוח המעורבת על קצה קטן של המסמור.

השתמש אוגן הבוכנה מרקם של מזרק חד פעמי 10 מיליליטר כדי דייסה את הרקמה דרך המסמרן לתוך מחבת התחתונה להציב על קרח. יש לשטוף מעת לעת ב-HBSS תוך שימוש במעט ככל האפשר כדי למנוע דילול דגימה ולהשתמש שוב באיסוף הנוזלים במחבת התחתונה כדי לשטוף את המסיר. לאחר המסירה הושלמה, בזהירות לשטוף את החלק התחתון של המסמר עם HBSS מתחתית המחבת כדי ללכוד כל glomeruli דבק רופף.

מחלקים את כל הנוזלים מהמחבת התחתונה ל-10 מזרקים מיליליטר המצוידים ב-20 מחטי מד. מעבירים את הנוזל דרך המחט לפחות שלוש פעמים לתוך המחבת התחתונה. עבור האוסף האחרון, לשמור את glomeruli המכיל נוזל במזרק עד מוכן להעביר אותו דרך 90 מיקרומטר מסמר.

בינתיים, לשטוף את המחבת התחתונה על ידי שטיפה אותו עם 1%BSA PBS לתוך מקור פסולת. השתמש ב- 1%BSA PBS כדי להרטיב את החלק העליון והתחתון של מסמר של 90 מיקרומטר ולאחר מכן מקם אותו בחלק העליון של המחבת התחתונה. החל את הדגימה במזרקים על קצה אחד של המזרק.

השתמש אוגן בוכנה מרקם כדי דייסה את הרקמה דרך המסמרן כפי שנעשה בעבר. השתמש בתסגם מהמחבת התחתונה כדי לשטוף את הרקמה ולאסוף הכל מקצה אחד של המסורה. לאחר המסירה הושלמה, בזהירות לשטוף את החלק התחתון של המסמר עם חיץ HBSS מתחתית המחבת כדי ללכוד כל glomeruli כי ניתן לדבוק באופן רופף.

לאסוף את כל הנוזל מהמחבת התחתונה לתוך צינור חרוט פלסטיק 50 מיליליטר. השתמשו ב-1%BSA PBS כדי לשטוף את המחבת התחתונה לתוך מקור פסולת. לאחר מכן השתמש ב- 1%BSA PBS כדי להרטיב את החלק העליון והתחתון של מסמר של 75 מיקרומטר.

מניחים את המסרנב על גבי המחבת התחתונה המונחת על קרח. החל את המדגם על קצה אחד של המסמן עם נוזל זורם דרך בקלות. שוטפים את החלק העליון של המסננים עם מינימום של 20 מיליליטר של 1%BSA PBS לתוך מקור פסולת בזהירות לשטוף את החלק התחתון של המסננים.

כדי לאסוף את glomeruli שנשאר על החלק העליון של מסמר 75 מיקרומטר, לשטוף דרך מסמר הפוך עם HBSS ככל הדרוש כדי לאסוף glomeruli בצלחת פטרי. לאסוף את glomeruli sieved לתוך צינור חרוט פלסטיק 50 מיליליטר על קרח. לאחר צנטריפוגה ב 1800 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, להסיר את supernatant בזהירות באמצעות פיפטה.

להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של HBSS קר. מערבבים את הדגימות וחוזרים על הצנטריפוגה. להשעות מחדש את glomeruli בחמישה מיליליטר של HBSS.

כדי לספור את glomeruli הכולל, למקם טיפה 10 microliter של המדגם על מגלשת זכוכית, לספור תחת מיקרוסקופ מרובים על ידי 500 כדי לקבל את התשואה הכוללת. מבנים מבודדים צריכים להיות מורכבים כמעט מכל גלומרולי ללא מבנים צינוריים. אם צינוריות קיימות וישפיעו על היישום במורד הזרם, ניתן להסיר אותן על-ידי החלת הדגימה כולה על המסמר של 90 מיקרומטר וחזרה על הפרוטוקול מנקודה זו ואילך.

הפרוטוקול המתואר כאן יעיל בהיבודדות גלומרולי וההשעיה הסופית עמוסה בצפיפות בגלומרולי עם טוהר גדול מ-95% וזיהום מינימלי ממקטעים צינוריים או מסוגי תאים אחרים. גלומרולי אלה יכולים להיות מוכתמים בכתמי המטוקסילין ואוזין כדי להציג את המורפולוגיה שלהם. יתר על כן, הם שומרים על המבנה שלהם לאורך כל הפרוטוקול גם לאחר העיבוד.

הם שומרים על פודוציטים שלמים ובת קיימא, תאים מסאנגיאליים ותאי אנדותל. הגלומרולי המבודד נחשף לפציעות כימיות כדי לדמות בפתולוגיה של ויוו. במיוחד פרוטמין גופרתי אשר משבש את המטען של מחסום סינון גלומרולרי.

בניגוד גלומרולי בריא, פרוטמין סולפט מטופלים glomeruli, יש ירידה בולטת נפרונים ומספר גרעינים חיובי עבור WT1. כאשר אנו נצפים עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, גלומרולי בריא להראות תהליכים ברגל טיפוסי. לאחר טיפול פרוטמין גופרתי, תהליכי כף הרגל מוארכים או effaced המציין פגיעה podocyte.

כדי לקבוע את הכדאיות התא glomeruli מבודד, caspase מחשוף שלוש נצפתה כסמן אפופטוזיס. לא היה קפסה מחשוף שלוש באפס ושעה לאחר בידוד של גלומרולי. כמה תאים הראו סימנים של אפופטוזיס בשעה וארבע שעות עם עלייה הדרגתית לאורך זמן.

המספר הגדול ביותר של תאים אפופוטוטיים נרשמו ב 24 ו 48 שעות. בהתבסס על תוצאות אלה, אנו ממליצים כי glomeruli מבודד לשמש מיד לאחר הבידוד עבור רוב הניסויים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעבוד במהירות וביעילות.

מרגע שהכליה מבודדת, גלומרולי מתחיל להתדרדר. ככל שתבודד מהר יותר את הגלומרולי, כך תצטרך יותר זמן לדגמן, בידוד, מניפולציה. לאחר הבידוד, גלומרולי מבודד יכול להיחשף לחומרים כימיים או ביולוגיים כדי לעורר תנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים.

ודגימות יכולות להיות תהליך לבידוד חלבון או רנ"א, היסטולוגיה או כשל חיסוני ומיקרוסקופ אלקטרונים. מאז התפתחותה בשנות החמישים, טכניקה זו סייעה לחוקרים בחקר הביולוגיה גלומרולרית. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה להערכת המאפיינים המורפולוגיים והתאים של גלומרולי שלם במצבים נורמליים וחלים.

שיטה זו יכולה לעזור להבנתנו של מחלת כליות כרונית פרוטאינורית ולסייע בפיתוח טיפולים עתידיים.