Name: דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: למד שיטת סינון יעילה לבידוד גלומרולים שלמים מכליות חולדות מבוגרים ללא פגיעה. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של מחלות כליות כרוניות ומנגנוני פגיעה בגלומרולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט FTF 16990086, NIH P30 DK079307, אמריקאי החברה של נפרולוגיה גוטשאלק, של אוניברסיטת פיטסבורג רפואי מרכז תחרותי רפואי מחקר קרן פרס, ובפרס של אוניברסיטת פיטסבורג רופאים האקדמי פרס. אנו מודים ג'רארד Apodaca על שלו הצעות טכניות לשימור glomerular עבור ניתוח היסטולוגית, מארה סאליבן, מינג סאן לקבלת סיוע עם מיקרוסקופ אלקטרונים, Yingjian Li, Youhua ליו לקלט הטכני שלהם ב פרוטוקול זה. אנו מודים גם סינתיה סנט הילר על הנוגדן CD31.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת פיטסבורג.
1. בידוד של עכברוש Glomeruli
<ol><li>כדי להכין מאגר בידוד סטרילי של 1%, להוסיף 5 g של אלבומין שור (BSA) גביע 600 מ.<ol>
<li>להוסיף 500 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) כשהספל ומערבבים עם מוט מגנטי מלהיב עד כל BSA היא התפרקה.</li>
		<li>מסנן סטרילי המאגר BSA/PBS 1% בשכונה התרבות תאים. הערה: המאגר BSA/PBS 1% סטרילי ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשיג חולדות ספראג-Dawley 2-4 במשקל 150-200 גרם כל אחד.<ol>
<li>המתת חסד חולדות באמצעות פחמן דו-חמצני שאיפת באמצעות חדר שבו 100% פחמן דו-חמצני הוא הציג בשיעור של 10-30% נפח החדר לדקה. לצפות בבעלי חיים עבור הפסקת נשימה ובניחוח צבע עיניים לפני ההסרה של פחמן דו-חמצני.</li>
		<li>להכין את העור מעל הבטן הקדמי עם 70% אתנול ולנצל קוצץ שיער להסרת שיער, אם רצונך בכך. עושים חתך קו האמצע של העור באמצעות מספריים כירורגיים או אזמל. לעשות חיתוך קו האמצע נוסף דרך השכבה שריר לחשוף איברים פנימיים. להרחיב את החתך עליונית דרך הסרעפת ואת עצם החזה או כלוב הצלעות כשיטה משנית של המתת חסד.</li>
		<li>לבודד ו להסיר שתי הכליות למקם את צינור פלסטיק 50 מל סטרילי חרוט עם 30 מ של הנקס במאגר תמיסת מלח (HBSS) על קרח. הערה: מספר עכברים יכולים המתה בבית הבליעה אותה, של הכליות יכול להציב בצינור חרוט אותו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשמור על הכליות על קרח, תחבורה ברדס תרבות תא סטרילי. להעביר את הכליות צלחת פטרי סטריליות המכיל 5 מ של HBSS, גם על קרח, להסיר, למחוק perirenal שומן עם מספריים, חדים מלקחיים. אם עדיין קיים, גם להסיר, למחוק את הקפסולה סביב הכליה על ידי הפיכת שטחי חתך קטן ולאחר מכן להשתמש מלקחיים חדה כדי משוך אותו בעדינות מן האיבר. הערה: תמיד לשמור כליות מבודד על הקרח ותרגול סטרילי טכניקה ברחבי. ניתן להציב פיסת גזה סטרילית בצלוחית הפטרי כמו משטח עם מרקם כדי להחזיק את הכליה במקום במהלך מניפולציה.<ol>
<li>הכליות לחצי לאורכו (סעיף midsagittal), להסיר ולמחוק את לשד (שהוא כהה בצבעו) עם איזמל בצלוחית השנייה עם 5 מ של HBSS.</li>
		<li>להעביר את חתיכות הנותרים, שהן בעיקר בקליפת הכליה, שליש צלחת פטרי עם 5 מ של HBSS, מינצ עם סכין גילוח סטרילי עד החלקים נמצאים פחות מ 1 מ"מ גודל או עד נוצרת עיסה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רטוב העליון והתחתון של מסננת 180 מיקרומטר עם 1% BSA/PBS מעל 500 מ"ל גביע פסולת. שלב זה הוא קריטי כמו זה ציפוי המסננת עם חלבון ומפחית הדבקות של glomeruli, אשר תשפר את התשואה.</li>
	<li>במקום קליפת טחון על יתרון קטן של המסננת ולהשתמש מקורבות הבוכנה עם מרקם (הצלע שממול חותמת גומי) של מזרק 10 מ"ל מוש הרקמה דרך המסננת לתוך מחבת התחתון יושב על קרח. לשטוף מעת לעת עם HBSS אך להשתמש כמה שפחות למנוע דילול הדגימה. הערה: לא יעלה על 30 מ של מאגר הכולל, כך שרק 25 מ ל יותר ניתן להשתמש כאן. הסיבה להנחה הרקמה טחון על קצה אחד של המסננת היא לצמצם את דבקותה של glomeruli על-ידי הגבלת החשיפה לחלק של המסננת ולא את המסננת כל פני השטח.<ol>
<li>כדי להקל על זה, שימוש חוזר הנוזל איסוף במחבת התחתון לשטוף המסננת. לאחר ניפוי תושלם, בזהירות לשטוף בתחתית המסננת פעם נוספת עם 1% מאגר BSA/PBS מתחתית המחבת כדי ללכוד כל glomeruli זה ייתכן שיש להקפיד באופן רופף.</li>
		<li>לאסוף את כל הנוזל במחבת למטה לתוך מזרקים 10 מ"ל במספר מצויד עם 20 גרם מחטים, להעביר את זה דרך המחט לפחות 2 פעמים נוספות. על האוסף האחרון, לשמור את הנוזלים המכילות glomeruli במזרק עד מוכן להעביר את זה דרך מסננת 90 מיקרומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעוד הנוזל מאוחסן במזרקים, לשטוף את המחבת התחתון על ידי שטיפה עם 1% BSA/PBS לתוך הספל פסולת רטובה העליון והתחתון של מסננת 90 מיקרומטר עם 1% BSA/PBS. מניחים המסננת מעל המחבת התחתון על קרח.<ol>
<li>להחיל את הדגימה במזרקים לקצה אחד של מסננת, דייסה דרך המסננת עם-והסתיר מזרק נוסף כמתואר לעיל. לשטוף עם פתרון מהמחבת התחתון כדי לאסוף את הכל על קצה אחד של המסננת.</li>
		<li>פעם ניפוי הושלם, לשטוף היטב בתחתית המסננת כמו שלב 1.5.1. לאסוף את כל הנוזל במחבת התחתון של צינור חרוטי פלסטיק 50 מל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את המחבת לתחתית עם 1% BSA/PBS לתוך הספל פסולת רטובה העליון והתחתון של מסננת מיקרומטר 75% 1 BSA/PBS. מניחים המסננת מעל המחבת התחתון על קרח.<ol>
<li>להחיל את הדגימה על קצה אחד של המסננת. הנוזל צריך לזרום דרך בקלות. לשטוף דרך הדף עם פחות 20 מ של 1% BSA/PBS לתוך הספל פסולת. לשטוף היטב בתחתית המסננת גם כן. Glomeruli יישאר בראש זו מסננת 75 מיקרומטר.</li>
		<li>השתמש HBSS כדי לאסוף glomeruli בצלחת פטרי בשטיפת דרך המסננת במהופך. השתמש כאן כמה שיותר HBSS לפי הצורך. לאסוף לתוך אחד או יותר 50 מ ל פלסטיק חרוט צינור על קרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1800 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע בזהירות עם פיפטה ו resuspend צנפה ב 10 מ"ל של HBSS קר. לשלב את הדגימות אם מספר צינורות חרוט נאספו ב 1.7.2. חזור על השלב צנטריפוגה.</li>
	<li>Resuspend glomeruli ב 5 מ של HBSS עד מוכן להמשיך לשלב הבא.</li>
	<li>אם רצונך בכך, לקחת ספירה של glomeruli הכולל. בשביל זה, לקחת דגימה µL 10 עם פיפטה ולמקם את המסירה על משטח זכוכית. הצג תחת מיקרוסקופ, לספור glomeruli בשדה, להכפיל ב- 500 כדי לקבל את התשואה הכוללת. הערה: טוהר יכול להיקבע על ידי ספירת מספר בקוריאנית ראיתי בשטח, חילוק המספר הכולל של glomeruli ואת צנורית מבנים. צריך להיות > 95% glomeruli בשדה הראייה.<ol>
<li>אם יש זיהום צינורי משמעותית, חזור על שלבים 1.6.1 ואילך, וודא כי מומלץ לשטוף ביסודיות כאשר השלמת שלב 1.7.1. זהו הצעד ב זיהום צינורי אשר קרוב לוודאי להתרחש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. פגיעה Glomeruli
<ol><li>לאסוף glomeruli צינור חרוטי פלסטיק 15 מ"ל ו ספין למטה ב- x 200 ג' Resuspend בסכום המתאים של HBSS בהתבסס על התשואה הכוללת, כך שישנם כ- 9,000 glomeruli לכל טוב. פיפטה µL 450 מדגם לתוך כל טוב של צלחת 24-ובכן, או כל פורמט צלחת שמתאים את מבחני במורד הזרם הנדרש. הערה: Pipetting למעלה ולמטה כדי לערבב glomeruli במאגר מבטיח פתרון הומוגני. Glomeruli הם דביקים מאוד כבד, לדבוק אחד בשני כמו גם להתישב בתחת של פתרון ובמהירות אל צידי הצינור.</li>
	<li>כדי להפוך את מה לעזאזל קרה 6 מ"ג/מ"ל חומצה גופרתית (PS) פתרון, להמיס קודם 1g של PS לתוך 10 מ"ל של dH2O מחומם ל 40 ° C 15 מ"ל פלסטיק צינור חרוטי ו מערבולת ביסודיות. לקחת 30 µL של התמיסה ולהוסיף 470 µL של dH2O. הערה: זה יהיה לייצר פתרון 6 מ"ג/מ"ל, כאשר 50 µL נוספים לבאר כפי שמתואר להלן, הריכוז הסופי הוא 0.6 מ"ג/מ"ל.<ol>
<li>ב כפולות, להוסיף 50 µL של סולפט? מה לעזאזל קרה (זה 1:10 דילול) כל אחד טוב של קבוצה אחת, תוך הספקת עוד קבוצה 50 µL של HBSS (בקרה שלילית).</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה את הצלחת במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ספין למטה התוכן של כל טוב צינור microcentrifuge (4000 x g, 4 ° C, s 10-15), לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS בכל.</li>
	<li>מחוק לגמרי מחוץ למכונה הסופי, resuspend ב µL 300 ל- PBS. פצל aliquots שלוש כדי להיות מוכנים לכל חלבון בידוד, הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) ויזואליזציה ופתוח immunofluorescence מכתים (אם).</li>
</ol>3. מכינים את Glomeruli לניתוח
<ol><li>ספין למטה התוכן של aliquots (4000 x גרם, 4 ° C, s 10-15), לשאוב את מאגר הנותרים שלושה והמשך ניתוח מדגם על ידי TEM, אם, או בידוד חלבון.</li>
	<li>עיבוד עבור TEM<ol>
<li>לתקן את כדורי glomerular µL 150 של גלוטראלדהיד 2.5% קר ב- PBS 0.01 M. הסרת מקבע את בקפידה בגדר באמצעות פיפטה של פסטר, מקפיד לא לשבש את צניפה, ולאחר מכן שטפה אותו עם PBS, שלאחר לתקן אותו בבית 1% אוסמיום ארבע-חמצני עם 1% אשלגן ferricyanide.</li>
		<li>מייבשים את הדגימה דרך סדרה מדורגת של אתנול (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%) ופרופילן אוקסיד ואז להטביע אפוקסי הטמעת החומר.</li>
		<li>לחתוך דק למחצה (300 ננומטר) מקטעים ultramicrotome. כתם עם 0.5% טולדין כחול ב 1% נתרן בוראט ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ אור.</li>
		<li>חותכים למקטעים זגוגית (65 ננומטר) תכתים אותם עם uranyl אצטט וחומצה ציטרית הראשי של וריינולד, לבחון על מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עיבוד אם<ol>
<li>להוסיף 150 µL של ג'לטין 12% ב- PBS פתרון ומניחים מיד על קרח יבש כדי ליצור גלולה. להשרות בגדר µL 500 של 2% paraformaldehyde/1 x PBS צינור microcentrifuge בין לילה ב 4 º C.</li>
		<li>הכנס בגדר תבנית בסיס, להטביע על-ידי הוספת חיתוך אופטימאליים טמפרטורה (אוקטובר) בינוני מעל קרח יבש. לחתוך 5-10 מיקרומטר מקטעים cryotome והמשך עם immunofluorescence/אימונוהיסטוכימיה או כתמים היסטולוגית סטנדרטי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בידוד חלבון<ol>
<li>להוסיף 150 µL ריפה מאגר centrifuged צנפה glomerular עם 1.5 µL של מעכב פרוטאז של דאונס עם רקמת לטקס.</li>
		<li>המשך כימות חלבון ו immunoblotting או חלבונים אחרים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+understanding+of+the+slit+diaphragm%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Molecular understanding of the slit diaphragm.</a> Pediatric Nephrology. 28 (10), 1957-1962 (2013).</li>
<li>Tan, R. J., Zhou, L., Zhou, D., Lin, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+receptor+a+blockade+is+an+ineffective+treatment+for+adriamycin+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelin receptor a blockade is an ineffective treatment for adriamycin nephropathy.</a> PLoS One. 8 (11), 79963(2013).</li>
<li>Wagner, N., Wagner, K. D., Xing, Y., Scholz, H., Schedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+podocyte+protein+nephrin+is+transcriptionally+activated+by+the+Wilms%27+tumor+suppressor+WT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The major podocyte protein nephrin is transcriptionally activated by the Wilms' tumor suppressor WT1.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (12), 3044-3051 (2004).</li>
<li>Rogacka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+increases+filtration+barrier+permeability+via+TRPC6-dependent+activation+of+PKGIalpha+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Insulin increases filtration barrier permeability via TRPC6-dependent activation of PKGIalpha signaling pathways.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1312-1325 (2017).</li>
<li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Moller, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+TRPC6+channel+in+acquired+forms+of+proteinuric+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 18 (1), 29-36 (2007).</li>
<li>Tian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+regulation+of+actin+dynamics+and+cell+motility+by+TRPC5+and+TRPC6+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Antagonistic regulation of actin dynamics and cell motility by TRPC5 and TRPC6 channels.</a> Science Signaling. 3 (145), 77(2010).</li>
<li>Shankland, S. J., Pippin, J. W., Reiser, J., Mundel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+in+culture%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Internationalernational%22%5BJournal%5D)">Podocytes in culture: past, present, and future.</a> Kidney Internationalernational. 72 (1), 26-36 (2007).</li>
<li>Cook, W. F., Pickering, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+separating+glomeruli+from+rabbit+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A rapid method for separating glomeruli from rabbit kidney.</a> Nature. 182 (4642), 1103-1104 (1958).</li>
<li>Misra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+glomeruli+from+mammalian+kidneys+by+graded+sieving%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving.</a> American Journal of Clinical Pathology. 58 (2), 135-139 (1972).</li>
<li>Burlington, H., Cronkite, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+cell+cultures+derived+from+renal+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characteristics of cell cultures derived from renal glomeruli.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 142 (1), 143-149 (1973).</li>
<li>Harper, P. A., Robinson, J. M., Hoover, R. L., Wright, T. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+culturing+rat+glomerular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Improved methods for culturing rat glomerular cells.</a> Kidney International. 26 (6), 875-880 (1984).</li>
<li>Kreisberg, J. I., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+rat+glomerular+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of rat glomerular epithelial cells in vitro.</a> Kidney International. 14 (1), 21-30 (1978).</li>
<li>Weinstein, T., Cameron, R., Katz, A., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+glomerular+epithelial+cells+in+culture+express+characteristics+of+parietal%2C+not+visceral%2C+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Rat glomerular epithelial cells in culture express characteristics of parietal, not visceral, epithelium.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 3 (6), 1279-1287 (1992).</li>
<li>Yaoita, E., Kurihara, H., Sakai, T., Ohshiro, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+modulation+of+parietal+epithelial+cells+of+Bowman%27s+capsule+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic modulation of parietal epithelial cells of Bowman's capsule in culture.</a> Cell and Tissue Research. 304 (3), 339-349 (2001).</li>
<li>Meezan, E., Brendel, K., Ulreich, J., Carlson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+pure+metabolically+active+glomerular+preparation+from+rat+kidneys.+I.+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Properties of a pure metabolically active glomerular preparation from rat kidneys. I. Isolation.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 187 (2), 332-341 (1973).</li>
<li>Piwkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+increases+glomerular+filtration+barrier+permeability+through+PKGIalpha-dependent+mobilization+of+BKCa+channels+in+cultured+rat+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Insulin increases glomerular filtration barrier permeability through PKGIalpha-dependent mobilization of BKCa channels in cultured rat podocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (8), 1599-1609 (2015).</li>
<li>Kotyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+glomerulus+diameter+and+Bowman%27s+space+width+of+renal+albino+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Methods+and+Programs+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Measurement of glomerulus diameter and Bowman's space width of renal albino rats.</a> Computer Methods and Programs in Biomedicine. 126, 143-153 (2016).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+glomeruli+from+mice%3A+A+practical+approach+for+beginners%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Exp Ther Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li>
<li>Leeuwis, J. W., Nguyen, T. Q., Dendooven, A., Kok, R. J., Goldschmeding, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20828590">Targeting podocyte-associated diseases.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (14), 1325-1336 (2010).</li>
<li>Subramanian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+mutant+Inf2+show+impaired+podocyte+and+slit+diaphragm+integrity+in+response+to+protamine-induced+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Mice with mutant Inf2 show impaired podocyte and slit diaphragm integrity in response to protamine-induced kidney injury.</a> Kidney International. 90 (2), 363-372 (2016).</li>
<li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li>
<li>Steinmetz, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pitfall+of+glomerular+sieving%3A+profibrotic+and+matrix+proteins+derive+from+the+Bowman%27s+capsule+and+not+the+glomerular+tuft+in+rats+with+renovascular+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">A pitfall of glomerular sieving: profibrotic and matrix proteins derive from the Bowman's capsule and not the glomerular tuft in rats with renovascular hypertension.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 22 (10), 3055-3060 (2007).</li>
<li>Ishikawa, Y., Kitamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+apoptosis+of+podocytes+in+explanted+glomeruli.+Technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Spontaneous apoptosis of podocytes in explanted glomeruli. Technical note.</a> Kidney International. 54 (6), 2008-2013 (1998).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17502717">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney and Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>McCarthy, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+increases+albumin+permeability+of+isolated+rat+glomeruli+through+the+generation+of+superoxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha increases albumin permeability of isolated rat glomeruli through the generation of superoxide.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 9 (3), 433-438 (1998).</li>
<li>Desideri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+provides+sensitive+measurement+of+physiologically+relevant+changes+in+albumin+permeability+in+isolated+human+and+rodent+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">A novel assay provides sensitive measurement of physiologically relevant changes in albumin permeability in isolated human and rodent glomeruli.</a> Kidney International. 93 (5), 1086-1097 (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

זוהי שיטה יעילה להתאוששות glomeruli מן החולדה הכליה באמצעות ציוד זול, לשימוש חוזר עם פרוטוקול פשוט. כמו עם כל ההליכים, קיימות מגבלות על תועלתו. ראשית, למרות אנו משיגים > 95% טוהר, בשל מהות sieving את הפרוטוקול ואת חומר המוצא שזה בלתי אפשרי לא לכלול כל מזהמים, ואת מספר כדוריות דם אדומות על קטע צינורי ומדי פעם להיות נוכחים בתרבות אנו מצפים האלה מזהמים קטנים כדי להיות בעיה עבור הרוב המכריע של יישומים. שנית, פרוטוקול sieving מסתמך על השימוש של עכברוש כליות, שבה glomeruli הם הרבה יותר גדול מאשר בעכברים. אם העכבר glomeruli נדרשים, טכניקה שימוש מסחרי beads מגנטי (למשל, Dynabeads) כבר פורסם22. שלישית, הוכח mRNAs הספציפי הזה (plasminogen activator מעכב-1 וקולגן אני) ב glomeruli מבודד שואבים כמעט לחלוטין כמוסה של באומן ולא intraglomerular תאים23. זה עלול להוביל למסקנות לא הולם אם mRNA בידוד מתבצע ניסיון של אלה glomeruli. יצוין כי בידיים שלנו רוב glomeruli הם decapsulated ולא צריך ולכן חוסר תרומה משמעותית מן קפסולות של באומן. רביעית, מוות של תאים מתחיל להתרחש במהירות יחסית בתנאים תרבות.
מצאנו כי התוכנית מוות, כפי שמעידים המראה של קספאז cleaved-3, הופעלה החל מ- 2 h של תרבות. . זה בדרך-כלל הסכם עם דוחות קודמים מציג שאת אפופטוזיס, כפי מוערך על ידי ה-DNA פיצול TUNEL, ניתוח היסטולוגית, מתחילה להתרחש בתוך 1-2 h לאחר בידוד24... עם זאת, גם יצוין כי מוקדם תצפיות הראו כי פעילות חילוף החומרים יכול להתגלות מ glomeruli sieved מבודד כאשר תרבותי לפחות 3 h, רומז ניכר הכדאיות הסלולר בגיל הזה timepoint16. למרות זאת, בהתבסס על התוצאות, אנו מאמינים שזה יהיה שקול לנצל glomeruli מבודד מיד בניסויים המיועד לקבלת התוצאות הטובות ביותר. אנו ממליצים כי כל ניסויים להתבצע לפני 72 h כפי שצפינו בה כל המבנה glomerular מתחיל להתדרדר מעבר timepoint הזה.
. זה הרבה יותר קל להשיג תשואות גבוהות כאשר החל מ 4-8 הכליות ולא רק 2 כי מספר מסוים של glomeruli הם איבדו בשל ההקפדה הנפות השונות, אבל ברגע הנפות הן מצופה מקסימאלית יש אין הפסד נוסף. מאותה סיבה, חשוב לטבול את הנפות המנזר מאגר BSA/PBS להשתמש glomeruli נוטים יותר לדבוק מסננת יבש, וכדי להגביל את החשיפה רקמות לקצה אחד של המסננת. אנו מציעים החל הכליות לא פחות מ 6 (3 חולדות) להשיג תשואה סבירה.
כמה חוקרים שללו podocyte העיקרי של glomeruli מבודד אשר נוטים לצמוח מתוך glomeruli במהלך תרבות17תרבויות. אנו ציינו כי כמה glomeruli מבודד דוגלים תרבות צלחת פלסטיק, כי התאים יתחיל להגר המבנה glomerular בשעה מאוחרת timepoints (72 h לאחר בידוד). המחקר של תאים אלה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה בידוד, ויש מחלוקת באשר אם תאים אלה הם podocytes, הקודקוד תאי אפיתל או בני15,25. ראוי לציין, Mundel. et al., דיווחו כי תאים המרוצף שנקטפו sieved glomeruli עשוי להיגרם כדי להתמיין podocytes בוגרים תחת ספציפיים culturing תנאים26. חלק מן הבלבול לגבי זהות תא תלויים אם glomeruli מבודד כמוסות (כולל הקפסולה של באומן אשר מאוכלס על ידי תאים אפיתל הקודקוד) או decapsulated בהליך sieving. בידיים שלנו, באמצעות מסננת רציפים בגדלים של 180, 90, ו- 75 מיקרומטר הובילו רוב glomeruli להיות decapsulated.
רוב צורות של מחלת כליות כרונית proteinuric הן בשל עליות glomerular חדירות. מספר סופרים נעזרו glomeruli מבודד בניסויים חדירות ' ex-vivo . בשיטה אחת, שינוי נפח glomerular לאחר שינוי תוכן osmotic התקשורת שמסביב שימש להערכת חדירות27. לאחרונה, נקבע כי דליפה של בדיקה פלורסנט מ glomeruli מבודדים ניתן לכמת למדוד פרמאביליות, היה יכול. להתבצע בחולדות חשופים למחלות glomerular ניסיוניות28.
אנו ציינו כי בתהליך הכנה TEM, אנחנו לפעמים לראות את podocyte ברגל תהליכי הרמה את קרום המרתף. אנחנו לא מרגישים זה קורה בתרבות, סביר יותר להניח חפץ במהלך הכנת הדוגמא TEM. ראוי לציין, גם כאשר מצב זה מתרחש, ברור אם התהליכים הרגל נראה "נורמלי" או הם התרחבות.
בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה שבה אחד יכול להעריך שינויים מורפולוגיות, הסלולר, בתגובה לפציעה. אנו צופים כי זה עשוי לשמש. טכניקה לוויה לתרבויות podocyte מבודדים, במיוחד כאשר שוקלים את האינטראקציות עם מטריצה חוץ-תאית או סוגי תאים מקומיים אחרים. זה טומן בחובו הבטחה להגברת ההבנה של CKD proteinuric, אשר לשפר את היכולת לפתח בעתיד הרפוי במחלה הזו מתישה.

פקעית הוא ציצה מאוד מיוחדים של נימים אחראי על הסינון של מחזורי פלזמה. היא יוצרת את תחילת נפרון, אשר היא היחידה הפונקציונלית הבסיסית של הכליה. Glomerular פונקציה מוגדרת על-ידי אנדותל נימי fenestrated ייחודי של הסרעפת שסע של podocytes, של קרום המרתף להתערב. שכבות אלה ליצור מחסום semipermeable כדי לאפשר הפרשה סלקטיבית של חומרים לתוך פילטרט. מים, יונים, מולקולות קטנות אחרות בדרך כלל עוברים דרך, ואילו מולקולות גדולות יותר נשמרים ב הפלזמה. Podocytes הן מיוחדות לתאי האפיתל שהתפשט על פני קרום המרתף, סביב הנימים עם תחזיות cytoplasmic המכונה רגל תהליכים. כף הרגל מעבד של interdigitate הסמוכה podocytes, נרשמו על ידי חריץ דיאפרגמות מורכב של חלבונים כגון nephrin, podocin, P-קדהרין זואי-11. במקטע קרוס, רגל אלה תהליכים באופן שווה מסודרים על קרום המרתף. התהליכים רגל glomeruli נגועים, הופכים בגסות חריג או "התרחבות", שמוביל חריג לדליפת פלזמה תוכן לתוך פילטרט. ככזה, נזק glomerular מאופיין בדרך כלל על ידי הנוכחות של כמות גדולה באופן חריג של חלבון (למשל, פרוטאינוריה) ו/או תאי דם אדומים (למשל, המטוריה) בשתן. בנוסף, podocytes הפצוע מאבד הביטוי של nephrin, כמו גם את הרגולטור 1 גידול Wilms (WT1), חלבון מפתח אחראי על תחזוקה של בידול2,3. Glomeruli מהווה מטרה עיקרית של נזק ב סוכרת כלייתית הינם glomerulonephritides אחרים כגון שינויים מזעריים מחלה כלייתית עלי הלוואי קרומיים, glomerulosclerosis סגמנטלי מוקד. מחלות אלו הם הגורמים העיקריים אי ספיקת כליות מתקדמת, ההתפתחות של מחלת כליות סופנית, מצב שבו הישרדות נשענת על דיאליזה או השתלת כליות. לכן, חשוב ללמוד glomeruli להבין טוב יותר את כליות כרונית (CKD) המחלה פתולוגיה.
מערכת התרבות התא חיוני ללמוד ביולוגיה glomerular. בשל תפקידה מרכזי ביצירת הסרעפת שסע, כמו גם על קיום מחלות ספציפיות proteinuric עקב מוטציות חלבון הסרעפת שסע, מחקרים רבים בצורה מובנת ניצל את podocyte בבידוד. זה הוביל הדור של שורות תאים podocyte העיקרית לנצל במבחנה. תאים אלה יכולים להיות בתרבית תחת מגוון תנאים, ניתן לגדל אפילו על תמיכה חדיר כדי להעריך את חדירות4. עם זאת, הבידוד של תאים מתרבים לעיתים קרובות בוחר תאים dedifferentiated שאיבדת חלק סמנים podocyte שלהם. זה הוביל הדור של podocytes מותנית מונצחים נגזר זן העכבר הטרנסגניים נושא מוטציה רגיש לטמפרטורה של SV40 גדול T הגן (למשל immortomouse), אשר יכול להיות גדלו בתרבות אלא גם להיות הבדיל לבטא מערך מלא של סמנים podocyte5. שיטות אלה של התרבות העיקרי היה מרכזי ההבנה podocyte ביולוגיה4,6,7.
למרות זאת, תרבויות המכילה סוגי תאים יחיד חוסר המערכת היחסים המתרחשות ויוו וכן את מבנה התמיכה של מטריצות, monolayers של תאים אלה לא בהכרח לסכם את תלת מימדי הארכיטקטורה של glomeruli. Podocytes immortalized ניתן גם מסורבל ומאתגרים תרבות8, והם ידרשו אחזקת או immortomouse או aliquot ההתחלתי של תאים מ הוקמה חוקרים כדי להתחיל. עוד יותר, פקעית מורכבת לא רק podocytes, אבל גם תאי אנדותל נימי קרום המרתף, וכן תאים mesangial אשר מספקים תמיכה עבור המבנה. לכן זה שימושי לפתח שמחוץ גישה זמינה כל החוקרים לחקר glomeruli שלם לשמור את הארכיטקטורה הטבעית שלהם, כמו גם כל התאים המהווים את פקעית נורמלי.
בשנת 1958, קוק, פיקרינג תיאר את הבידוד הראשון של glomeruli מן הכליה ארנב. לאחר תצפיות תסחיף שומני הפך תקוע glomeruli, הם הניחו כי חלקיקים בגודל זהה יכול לשמש לבודד במיוחד מבנים אלה. אכן, העירוי של חלקיקי תחמוצת ברזל לתוך הכליה הובילו ההשמנה של החלקיקים ב glomeruli. לאחר דיסוציאציה מכני, ניפוי של הכליה, glomeruli יכול להיות מבודדת ללא פגע עם טוהר באמצעות הפרדה מגנטית9. ב-1971 Misra הראה כי את תחמוצת ברזל יכול להיות מושמט חליטות, ובידוד glomerular מושגת עם ניפוי של האדם טחון, כלב, ארנבת או עכבר כליות רקמות10. טכניקה זו שונתה מאז ואז בהתאם למטרה של החוקרים, אבל בעיקרו של דבר הביא מטוהרים ההכנות זה. יכול להיות עוד יותר למד או שממנו תרבויות התא הראשי יכול להיות הוקמה11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17.
כאן נתאר פרוטוקול עבור בידודו של glomeruli קיימא ללא פגע מן הכליה חולדה. פרוטוקול כולה אורכת שעות ספורות. למרות שהם לא להתרבות, תוכניות ניסיוני בכל גודל ייתמכו על-ידי פשוט להגדיל את מספר הכליות כמתחילה חומר. אמנם ישנם פרוטוקולים שפורסמו עבור הפרדת חרוז מגנטי glomeruli, הם דורשים זריקה תוך ורידי של חרוזים יקרים יותר, עשוי לשנות ביולוגיה מאז החרוזים נשמרות גם על-ידי glomeruli בתרבות או לדרוש glomerular" lysing"והסרה על ידי צנטריפוגה19. לעומת עכבר glomeruli, גודל גדול יותר של עכברוש glomeruli (קרוב ל-100 מיקרומטר חולדות בת שני חודשים18) מקלה בהרבה להפריד אותם מבנים אחרים הכליה באמצעות טכניקה פשוטה sieving.
כראיה של התועלת שלהם, אנחנו שאפיינו glomeruli להפגין את סוגי תאים שונים. הם יכולים גם להיות חשופים סוכנים ידוע לפצוע glomeruli ויוו, נדגים את ההשפעות השליליות של? מה לעזאזל קרה סולפט (PS) על תרבויות אלה. נ. ב הוא polycation זה מנטרל את האתרים anionic לאורך הקיר נימי glomerular20. סתירה זו השפעה דרמטית על המכשול סינון glomerular ומגביר לכן הצטנעות תהליך פרוטאינוריה ו כף הרגל. יכול להיות מוערך glomeruli אלה עם immunoblots חלבונים מפתח כגון nephrin ו- WT1 כדי להעריך את הבריאות הכללית. יתר על כן, ניתן להעריך את המבנה שלהם עם אור, immunofluorescence של מיקרוסקופ אלקטרונים.
פרוטוקול זה נגיש באופן כללי, רוב החוקרים (ורק צריך גישה החיות, ציוד פשוט). עם תכונות מורפולוגיות נשאר ניזוק, החוקר לנתח glomeruli ולראות סוגי תאים חשוב איך אחרים, שימור מטריקס glomeruli להשפיע על תפקוד ומחלות התקדמות, חסרונה תרבויות podocyte.

<table><tbody><tr><td>תמיסות, כימיקלים ובעלי חיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Rats</td><td>Envigo</td><td>207M</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>פישר</td><td>BP1605100</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק עם Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Thermo</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>1x פוספט חוצץ מלח</td><td>VWR</td><td>97063-660</td><td></td></tr><tr><td>פרוטמין סולפט</td><td>MP Bio</td><td>ICN15197105</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> מקבע, <tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>EMD EMD</td><td>EM-PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Scigen</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>להפסיק מעכבי פרוטאז</td><td>תרמו</td><td>PI78442</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נפרין</td><td>פיצג'רלד</td><td>2OR-NP002</td><td></td></tr><tr><td>WT-1 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab89901-10ul</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR-&beta; איתות</td><td>תאי</td> <td>נוגדנים#3169S</td><td></td></tr><tr><td>CD31 נוגדן</td><td>LSBio</td><td>LS-C348736</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן קספאז-3 שסוע</td><td>איתות תאים</td><td>9661S</td><td></td></tr><tr><td>פולי / מיטה 812 (לופט) אפוקסי</td><td>Polysciences</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td><td></td>פחמן דו חמצני</tr><tr><td>צינורות חרוטיים, 15 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים, 50 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים כירורגיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גזה</td><td></td><td></td><td></td>סטרילית</tr><tr><td>צלחות פטרי, 100 מ"מ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סכיני</td><td></td><td></td><td></td> גילוח</tr><tr><td>מנגנון</td><td></td><td></td><td></td>סינון סטרילי</tr><tr><td>מסננת פאן</td><td>אלפא Aesar</td><td>AA39999ON</td><td></td></tr><tr><td>180um מסננת</td><td>אלפא Aesar</td><td>AA39996ON</td><td></td></tr><tr><td>מסננת 90um מסננת</td><td>אלפא Aesar</td><td>AA39990ON</td><td></td></tr><tr><td>מסננת 75um מסננת</td><td>אלפא Aesar</td><td>AA39991ON</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרקים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>600 מ"ל כוסות</td> <td>600 מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr>חממת <td></td><td></td><td></td><td>תרביות תאים</td></tr><tr><td>פיקופוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רקמות הומוגנייזרים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50550226</td><td></td></tr><tr><td>20 גרם מחטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Reichart Ultracut</td><td></td><td></td><td>ultramicrotome</td></tr></tbody></table>

דרך יעילה sieving כדי לבודד glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

שימור מבנה glomerular ותפקוד הוא מכריע למניעת דלקת פקעיות הכליה, קטגוריה של מחלת כליות מאופיין פרוטאינוריה אשר יכול להוביל בסופו של דבר את כרונית, מחלת כליות סופנית. פקעית הוא מנגנון מורכב אחראי על הסינון של פלסמה מן הגוף. במחלה, שלמות מבנית אובד ומאפשר חריג לדליפת פלזמה תוכן לתוך השתן. שיטה לבודד ולבחון glomeruli בתרבות חיוני לחקר מחלות אלו. ב פרוטוקול זה, מתוארת שיטה יעילה לאחזור glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות תוך שימור מאפיינים מורפולוגיים מבניים. תהליך זה הוא מסוגל לייצר תפוקה גבוהה של glomeruli לכל כליה עם זיהום מזערי של מקטעים אחרים נפרון. עם אלה glomeruli, ופציעות ספורט יכול להיות חיקה מאת המקננת אותם עם מגוון של רעלנים כימיים, כולל מה לעזאזל קרה סולפט, הגורמת רגל תהליך הצטנעות, פרוטאינוריה במודלים של בעלי חיים. חומרת הפגיעה יכול להיות מוערך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, immunofluorescence מכתים סופג המערבי. Nephrin ורמות 1 גידול Wilms (WT1) יכול גם להיות מוערך מהתרביות האלה. בשל נוחות וגמישות של פרוטוקול זה, glomeruli מבודד יכול להיות מנוצל כמתואר או בצורה המתאימה ביותר לצרכים של החוקר כדי לסייע טוב יותר בריאות glomerular המחקר ומבנה במדינות נגועים.

הפרוטוקול מימי המתת חסד בידוד של glomeruli בעיר קטנה כמו 2 h, כולל תפוקה גבוהה, יעילות. עם ניצול נכון של הטכניקה, התשואה של glomeruli לכל כליה עכברוש נע בין 6,000-10,000 glomeruli כאשר החל 8 הכליות. המתלה הסופי הוא ארוז בצפיפות עם glomeruli ויש של הכללית טוהר &gt; 95%, מציג זיהום מזערי צינורי מקטעים או סוגי תאים אחרים (איור 1א', ב'). בנוסף, יכול להיות מוכתם glomeruli OCT-מוטבע עם כתמים (H &amp; E) Hematoxylin ואאוזין לראות המורפולוגיה (איור 1C). אלה glomeruli לשמור על המבנה שלהם לאורך כל פרוטוקול שלם, אפילו לאחר העיבוד. נדגים glomeruli מבודד מחזיקים podocytes ללא שינוי בר -קיימא (איור 2א), תאים mesangial (איור 2B), תאי אנדותל (איור 2C).
מבודדת בעבר, ניתן לחשוף glomeruli ידועים פציעות כימי כדי לדמות ויוו פתולוגיה. במקרה זה, מה לעזאזל קרה סולפט (PS) נבחר בשל יכולתו לשבש את המטען של המכשול glomerular סינון, אשר בסופו של דבר מוביל רגל תהליך הצטנעות. Glomeruli שטופלו PS יש ירידה מרשימה nephrin (אדום), מספר גרעינים חיובי עבור WT1 (ירוק) באמצעות immunofluorescence (איור 3A, B). גם יכול להיות מוכנים glomeruli במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 3ג'). דגימות הבקרה יש מורפולוגיה podocyte נורמלי, רגל תהליכים ואילו glomeruli שטופלו PS יש הצטנעות תהליך רגל (איור 3ד'), אשר הוא סימן של חוסר תפקוד podocyte נתפסת ויוו דגמים בעזרת PS21. גם התאים כדי ירידה nephrin שזוהה על-ידי immunoblotting (איור 3E, F).
כדי לקבוע את הכדאיות, קספאז cleaved-3 הוערכה כסמן של אפופטוזיס. שימוש immunofluorescence, קספאז cleaved-3 מופיע לראשונה כמה תאים מתחיל שעתיים לאחר בידוד (איור 4). מספר התאים לבטא פרוטאז הזה הפך בשפע רב יותר לאורך זמן, עם הרמות הגבוהות ביותר לראותם 24 ו 48 שעות. הדבר מצביע על זה אפופטוזיס מתרחשים יחסית מוקדם בתרבות, יישומים במורד הזרם, יש לבצעו לאחר בידוד לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig1.jpg"> איור 1 . מראה אופייני של תרבויות glomerular עכברוש לאחר הבידוד. (א) Brightfield תמונה של תרבות glomerular. למרות בחרנו שדה שבו יש צנורית כליות יחיד הזה micrograph (חץ), התרבויות שהושג בדרך כלל &gt; 95% טהור. סרגל קנה מידה שווה 100 מיקרומטר (B) מוגדל תמונת פקעית יחיד. Hematoxylin (C) ו eosin כתם של פקעית יחיד. ברים בקנה מידה B ו- C שווה 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig2.jpg"> איור 2 . סוגי תאים המרכיבים אותה נשמרים ב- glomeruli מבודד. מיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence בוצעה עבור nephrin (אדום, podocytes) וסמנים תא ספציפי כדי לזהות podocytes, mesangial תאי אנדותל. (א) Costain nephrin, WT1 (ירוק, podocytes). Costain (B) עבור nephrin ו- PDGFR-β (ירוק, תאים mesangial, חץ). (ג) Costain nephrin, CD31 (תאים ירוקים, אנדותל, כלי חתך מסומן על ידי חץ). סרגל קנה מידה = מיקרומטר 25 על כל לוחות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig3.jpg"> איור 3 . פגיעה Podocyte יכולה להיות המושרה במבחנה באמצעות glomeruli עכברוש מבודד. (א) immunofluorescence קונאפוקלית מיקרוסקופ עבור nephrin ו- WT1 ב תרבות glomerular ללא טיפול. שימו לב ליניארי nephrin מכתים (אדום), נוכחות של גרעינים WT1-חיוביות (ירוק) אשר ראו בדרך כלל כאשר יש podocytes בריאים. (B) אחרי? מה לעזאזל קרה חומצה גופרתית טיפול, ביטוי nephrin ירד ולא לינארי, WT1 נעדר, המציינת פגיעה podocyte. (ג) העברת אלקטרונים microscpy (TEM) התמונה מראה הרגל תהליכים קרום המרתף, של אנדותל fenestrated אופייני של מבנה glomerular נורמלי. בר שווה 500 ננומטר. (ד) לאחר? מה לעזאזל קרה סולפט, הרגל תהליכים מוארכת או התרחבות (חץ), אשר מצביע על פגיעה podocyte. תספיג חלבון (E) עבור nephrin מציג ירד nephrin לאחר הטיפול סולפט? מה לעזאזל קרה. (F) אקטין טעינת פקד עבור תספיג מוצג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58162/58162fig4.jpg"> איור 4 . הערכת הכדאיות תא ב glomeruli מבודד. מיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence קספאז cleaved-3 (ירוק) בוצעה. כתם שיתוף nephrin בוצעה לאתר בקלות את glomeruli. למרות שלא היתה שום חיוביות cleaved קספאז-3-0 ו- 1 h לאחר ניתוקה של glomeruli, קרינה פלואורסצנטית אותות בתאים כמה צוין ב ה 2 למחמיר שיותר תאים הפך חיובית ככל לאחר בידוד שהם נבחנו. המספר הגדול ביותר של קספאז-3 תאים חיוביים נרשמו ב ה 24 ו 48 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58162/58162fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא לבודד ביעילות glomeruli העיקרי קיימא תרבויות עם מזהמים מינימלית לשימוש במגוון רחב של יישומים במורד הזרם. Glomeruli מבודד שומרים על קשרים מבניים בין סוגי תאים רכיב וניתן בתרבית שמחוץ לזמן קצר.

דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלת הכליות. במיוחד בהבנת הגלומרולוס במצבים נורמליים וחלים. ביולוגיה גלומרולרית יכולה להיות קשה ללמוד בשל מגוון סוגי התאים הקיימים והמבנה הייחודי שלהם.היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לספק מקור זמין של גלומרולי שלם באמצעות שיטות וציוד פשוטים. לטכניקה זו יש השלכות על הבנתנו את מחסום הסינון בכליה הרגילה והמחלה. בפרט, זה יכול לשפוך אור על ההבנה שלנו של מחלת כליות כרונית פרוטאינורית שבה פגיעה גלומרולרית מובילה הפרשה גבוהה באופן חריג של חלבונים בסרום לתוך השתן.בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו להשיג תשואה נאותה וטוהר המדגם הסופי. הפגנת ההליך תהיה בריטני ראש, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להשתמש קוצץ שיער כדי להסיר שיער מהבטן לפנים של חולדה המתת לחץ.השתמש 70% אתנול כדי לנקות את העור החשוף. לאחר מכן, באמצעות מספריים כירורגיים, לעשות חתך קו האמצע בעור. כדי לחשוף איברים פנימיים, לבצע חתך קו האמצע דרך שכבת השריר.אתר ובודד את הכליות והנח לתוך צינור חרוט פלסטיק סטרילי 50 מיליליטר עם 30 מיליליטר של תסכולת המלח של האנק או HBSS להציב על קרח. מעבירים את הצינור על הקרח למכסה המנוע של תרבות התאים הסטריליים. מעבירים את הכליות לצלחת פטרי סטרילית המכילה חמישה מיליליטר של HBSS המונחים על קרח.השתמש מספריים מטלפים חדים כדי להסיר ולהשליך שומן perirenal. כדי להסיר ולהשליך את הכמוסות המקיפות את הכליה, לעשות חתך שטחי קטן ולאחר מכן להשתמש במטחים חדים כדי למשוך אותו בעדינות מן הכליה. מניחים את הכליות על גזה סטרילית בצלחת פטרי שנייה עם חמישה מיליליטר של HBSS ומחלקים כל כליה לשניים דרך קטע באמצע קשת.השתמש אזמל כדי להסיר ולהשליך את medulla אשר ניתן לזהות על ידי צבע כהה יותר שלה מיקום מרכזי. מעבירים את החלקים הנותרים המכילים בעיקר את קליפת הכליות, לתוך צלחת פטרי שלישית עם חמישה מיליליטר של HBSS. השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לטחון אותם עד שהחתיכות יהיה בגודל של פחות ממילימטר אחד או עד להיווצרות הדבק.השתמשו ב-1%BSA PBS כדי להרטיב את החלק העליון והתחתון של מסמר 180 מיקרומטר מעל מקור פסולת של 500 מיליליטר. צעד זה הוא קריטי כפי שהוא מצופה את מסמר עם חלבון ומפחית את הדבקות של glomeruli אשר לאחר מכן לשפר את התשואה. מניחים את קליפת המוח המעורבת על קצה קטן של המסמור.השתמש אוגן הבוכנה מרקם של מזרק חד פעמי 10 מיליליטר כדי דייסה את הרקמה דרך המסמרן לתוך מחבת התחתונה להציב על קרח. יש לשטוף מעת לעת ב-HBSS תוך שימוש במעט ככל האפשר כדי למנוע דילול דגימה ולהשתמש שוב באיסוף הנוזלים במחבת התחתונה כדי לשטוף את המסיר. לאחר המסירה הושלמה, בזהירות לשטוף את החלק התחתון של המסמר עם HBSS מתחתית המחבת כדי ללכוד כל glomeruli דבק רופף.מחלקים את כל הנוזלים מהמחבת התחתונה ל-10 מזרקים מיליליטר המצוידים ב-20 מחטי מד. מעבירים את הנוזל דרך המחט לפחות שלוש פעמים לתוך המחבת התחתונה. עבור האוסף האחרון, לשמור את glomeruli המכיל נוזל במזרק עד מוכן להעביר אותו דרך 90 מיקרומטר מסמר.בינתיים, לשטוף את המחבת התחתונה על ידי שטיפה אותו עם 1%BSA PBS לתוך מקור פסולת. השתמש ב- 1%BSA PBS כדי להרטיב את החלק העליון והתחתון של מסמר של 90 מיקרומטר ולאחר מכן מקם אותו בחלק העליון של המחבת התחתונה. החל את הדגימה במזרקים על קצה אחד של המזרק.השתמש אוגן בוכנה מרקם כדי דייסה את הרקמה דרך המסמרן כפי שנעשה בעבר. השתמש בתסגם מהמחבת התחתונה כדי לשטוף את הרקמה ולאסוף הכל מקצה אחד של המסורה. לאחר המסירה הושלמה, בזהירות לשטוף את החלק התחתון של המסמר עם חיץ HBSS מתחתית המחבת כדי ללכוד כל glomeruli כי ניתן לדבוק באופן רופף.לאסוף את כל הנוזל מהמחבת התחתונה לתוך צינור חרוט פלסטיק 50 מיליליטר. השתמשו ב-1%BSA PBS כדי לשטוף את המחבת התחתונה לתוך מקור פסולת. לאחר מכן השתמש ב- 1%BSA PBS כדי להרטיב את החלק העליון והתחתון של מסמר של 75 מיקרומטר.מניחים את המסרנב על גבי המחבת התחתונה המונחת על קרח. החל את המדגם על קצה אחד של המסמן עם נוזל זורם דרך בקלות. שוטפים את החלק העליון של המסננים עם מינימום של 20 מיליליטר של 1%BSA PBS לתוך מקור פסולת בזהירות לשטוף את החלק התחתון של המסננים.כדי לאסוף את glomeruli שנשאר על החלק העליון של מסמר 75 מיקרומטר, לשטוף דרך מסמר הפוך עם HBSS ככל הדרוש כדי לאסוף glomeruli בצלחת פטרי. לאסוף את glomeruli sieved לתוך צינור חרוט פלסטיק 50 מיליליטר על קרח. לאחר צנטריפוגה ב 1800 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, להסיר את supernatant בזהירות באמצעות פיפטה.להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של HBSS קר. מערבבים את הדגימות וחוזרים על הצנטריפוגה. להשעות מחדש את glomeruli בחמישה מיליליטר של HBSS.כדי לספור את glomeruli הכולל, למקם טיפה 10 microliter של המדגם על מגלשת זכוכית, לספור תחת מיקרוסקופ מרובים על ידי 500 כדי לקבל את התשואה הכוללת. מבנים מבודדים צריכים להיות מורכבים כמעט מכל גלומרולי ללא מבנים צינוריים. אם צינוריות קיימות וישפיעו על היישום במורד הזרם, ניתן להסיר אותן על-ידי החלת הדגימה כולה על המסמר של 90 מיקרומטר וחזרה על הפרוטוקול מנקודה זו ואילך.הפרוטוקול המתואר כאן יעיל בהיבודדות גלומרולי וההשעיה הסופית עמוסה בצפיפות בגלומרולי עם טוהר גדול מ-95% וזיהום מינימלי ממקטעים צינוריים או מסוגי תאים אחרים. גלומרולי אלה יכולים להיות מוכתמים בכתמי המטוקסילין ואוזין כדי להציג את המורפולוגיה שלהם. יתר על כן, הם שומרים על המבנה שלהם לאורך כל הפרוטוקול גם לאחר העיבוד.הם שומרים על פודוציטים שלמים ובת קיימא, תאים מסאנגיאליים ותאי אנדותל. הגלומרולי המבודד נחשף לפציעות כימיות כדי לדמות בפתולוגיה של ויוו. במיוחד פרוטמין גופרתי אשר משבש את המטען של מחסום סינון גלומרולרי.בניגוד גלומרולי בריא, פרוטמין סולפט מטופלים glomeruli, יש ירידה בולטת נפרונים ומספר גרעינים חיובי עבור WT1. כאשר אנו נצפים עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, גלומרולי בריא להראות תהליכים ברגל טיפוסי. לאחר טיפול פרוטמין גופרתי, תהליכי כף הרגל מוארכים או effaced המציין פגיעה podocyte.כדי לקבוע את הכדאיות התא glomeruli מבודד, caspase מחשוף שלוש נצפתה כסמן אפופטוזיס. לא היה קפסה מחשוף שלוש באפס ושעה לאחר בידוד של גלומרולי. כמה תאים הראו סימנים של אפופטוזיס בשעה וארבע שעות עם עלייה הדרגתית לאורך זמן.המספר הגדול ביותר של תאים אפופוטוטיים נרשמו ב 24 ו 48 שעות. בהתבסס על תוצאות אלה, אנו ממליצים כי glomeruli מבודד לשמש מיד לאחר הבידוד עבור רוב הניסויים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעבוד במהירות וביעילות.מרגע שהכליה מבודדת, גלומרולי מתחיל להתדרדר. ככל שתבודד מהר יותר את הגלומרולי, כך תצטרך יותר זמן לדגמן, בידוד, מניפולציה. לאחר הבידוד, גלומרולי מבודד יכול להיחשף לחומרים כימיים או ביולוגיים כדי לעורר תנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים.ודגימות יכולות להיות תהליך לבידוד חלבון או רנ"א, היסטולוגיה או כשל חיסוני ומיקרוסקופ אלקטרונים. מאז התפתחותה בשנות החמישים, טכניקה זו סייעה לחוקרים בחקר הביולוגיה גלומרולרית. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה להערכת המאפיינים המורפולוגיים והתאים של גלומרולי שלם במצבים נורמליים וחלים.שיטה זו יכולה לעזור להבנתנו של מחלת כליות כרונית פרוטאינורית ולסייע בפיתוח טיפולים עתידיים.

an-efficient-sieving-method-to-isolate-intact-glomeruli-from-adult

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

השתלה של איים מבודדים הוצע להיות טיפול פוטנציאלי עבור סוכרת מסוג 1. כאן אנו מתארים שיטה לבודד איים מהעכבר pancreata ואת השתלת אותם למרחב subcapsular של הכליה.

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

בסרטון זה, אנו מתארים את הליך מיצוי הכליה מהחלל הרטרופריטוניאלי של העכבר. ניתן לנתח את הכליה המופקת במיקרודיסקציה נוספת כדי לקבל כליה שלמה ללא כמוסת הכליה ושכבת השומן שמסביב.

חילוץ כליה שלמה מעכבר: טכניקה להשגת כליה ללא כמוסת כליות מדגמי מורין

סרטון זה מתאר את השיטה לבידוד גלומרולי שלם מכליות עכבר. הגלומרולי העטוף והמכוסה המתקבל כך יכול לשמש גם לטיפוח גידולי תאי אפיתל קודקודיים מהכליה המורין.

בידוד גלומרולי: טכניקה להשגת גלומרולי שלם מכליה מורין

טכניקת ניצול הרזולוציה הגבוהה intavital מיקרוסקופיה 2 פוטונים ישירות לדמיין ולכמת סינון gloemrular במשטח glomeruli. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של מאפייני חדירות של מולקולות במצבים נורמלים ובחולים.

כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

שינויים ברמות הסידן התוך-תאיות בפודוציטים הם אחד האמצעים החשובים ביותר לשליטה בתפקוד הסינון של גלומרולים. כאן אנו מסבירים גישה בעלת תפוקה גבוהה המאפשרת זיהוי של טיפול בסידן בזמן אמת ופעילות תעלות יונים בודדות בפודוציטים של הגלומרולים הטריים שבודדו.

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

מאמר זה מתאר שיטה עבור culturing וניתוח החוצה הקודקוד הקודקודית תא האפיתל של פקולי כדורית מבודדים מכליה העכבר. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מסלולים המעורבים התפשטות התא הקודקודית והגירה.

בלתי מימדית כמו לשעבר שיטת Vivo לנתח מסלולים מעורב הקודקוד הקודקודית התא ההפעלה

המאמר מתאר את השיטה לבידוד תאי אנדותל גלומרולריים מותנים מכליות של עכברים מהונדסים המבטאים את נגיף סימיאן התרמולבילי 40 ואת המיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית, PhAMנכרת. אנו מתארים את ההליך לבידוד גלומרולי מכליות שלמות באמצעות חרוזים, שלבי עיכול, זריעה וגידול של GECs-CD31 חיובי.

בידוד של תאי אנדותל גלומרולריים של עכברים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית

מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.

שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

מחקר זה פיתח פרוטוקול אופטימלי לבידוד תאים מזנגיאלים של עכברים (MCs) ותרבית תאי ex vivo שלהם. ניתן להעביר תאים אלה מספר פעמים, להקפיא, להחיות ולתרבית מבלי לפגוע בצמיחת התאים או בביטוי החלבון.

אופטימיזציה של בידוד וטיהור של תאים מזנגיים גלומרולרים של עכברים

למד שיטת סינון יעילה לבידוד גלומרולים שלמים מכליות חולדות מבוגרים ללא פגיעה. שיטה זו מאפשרת מחקר מדויק של מחלות כליות כרוניות ומנגנוני פגיעה בגלומרולים.

דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

גלה סרטונים נוספים