לכימות הצמח חלבון מסיס והתוכן לעיכול פחמימות, באמצעות תירס (זיה מייז) כמו שיוצרו

שיטה זו מאפשרת לחוקרים בתחום מדעי הצמח והאקולוגיה התזונתית למדוד במדויק ריכוזים של חלבונים מסיסים ופחמימות מתעכלות ברקמת הצמח. היתרון העיקרי של הטכניקות הללו הוא שהן מציעות שיטה מהירה וקלה לכימות שני אבות המזון החשובים להפליא הללו בדיוק רב. לטכניקות אלה יש השלכות חזקות על תחום האקולוגיה מכיוון שחלבונים צמחיים ופחמימות מהווים את הבסיס לשרשרת המזון היבשתית.

בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להיאבק מכיוון שישנם מספר שלבים וכמה טכניקות שאינן מבוצעות בדרך כלל במעבדה לשימוש כללי. כדי להתחיל, שקלו דגימות משוכפלות של כל רקמה לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, רשום את המסה המדויקת של כל דגימה.

בעזרת מיקרו-פיפטר, הוסף 500 מיקרו-ליטר של 0.1 נתרן הידרוקסיד מולרי לכל צינור. סוגרים היטב את המכסים ומחממים את הצינורות למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את הצינורות באמבט מים חמים שחומם מראש למשך 15 דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות בחום של 15, 000 גרם למשך 10 דקות. פיפטה את הסופרנטנט לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים ומסומנים, תוך שימוש בקצה פיפטה חדש לכל דגימה. הוסף לגלולה 300 מיקרוליטר של 0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי, וחזור על הצנטריפוגה למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הסירו את הסופרנטנט והעבירו אותו לצינורות המכילים את הסופרנטנט מהצנטריפוגה הראשונה. כדי לנטרל את ה- pH של הסופרנטנט, הוסף 11 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית 5.8 מולארית. השתמש בנייר לקמוס כדי לאשר שה-pH הוא בערך שבע.

לאחר מכן, הוסף 90 מיקרוליטר של 100% חומצה טריכלורואצטית לכל צינור. לאחר מכן דגרו את הצינורות על קרח למשך 30 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב-13,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השתמש בזהירות בקו ואקום ובקצה מיקרופיפטה מזכוכית כדי להסיר את החומצה הטריכלורואצטית. היזהר מאוד לא להפריע לגלולה עם קצה היניקה. לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם 100 מיקרוליטר אצטון שהתקרר ל -20 מעלות צלזיוס, ואז אפשרו לאצטון להתאדות במכסה אדים.

ממיסים את כדור החלבון עם מיליליטר אחד של נתרן הידרוקסיד. ייתכן שיידרשו סבבים נוספים של חימום, מערבולת וחימום קולי. הוסף 160 מיקרוליטר מכל תמיסה סטנדרטית של IGG לצלחת של 96 בארות במשולש, החל ממצב A1 לאחר מכן, בשפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר הוסף 50 מיקרוליטר מכל תמיסת דגימה ל-950 מיקרוליטר מים מזוקקים.

לאחר מכן הוסף 60 מיקרוליטר מכל דגימה מדוללת לצלחת הבאר בשלוש עותקים, החל ממצב H1. הוסף 100 מיקרוליטר מים מזוקקים לכל בארות הדגימה הריקות והלא ידועות. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 40 מיקרוליטר של צבע חלבון Coomassie Brilliant Blue G-250 לכל באר בצלחת.

בעזרת מחט, פוצץ את כל הבועות הקיימות בבארות. לאחר מכן, אפשר לצלחת לדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-פלייט כדי לרשום את ערכי הספיגה עבור כל באר ב-595 ננומטר.

ראשית, שקלו שכפולים מכל דגימת רקמה לצינורות זכוכית של 15 מיליליטר. סמן את הצינורות ורשום את המסה המדויקת של כל דגימה. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 0.1 חומצה גופרתית טוחנת לכל צינור וסגור היטב את המכסים.

לאחר מכן הניחו את הצינורות באמבט מים רותחים למשך שעה. מעבירים את הצינורות לאמבט מים פושר להתקררות. לאחר מכן שפכו את תכולת הצינורות לצינורות מיקרו-צנטריפוגה מסומנים בנפח 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן צינורות צנטריפוגה ב -15, 000 גרם למשך 10 דקות. השתמש במיקרו פיפטה כדי להעביר את הסופרנטנט לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר. באמצעות פיפטה העבירו 15 מיקרוליטר מכל דגימה לא ידועה למבחנה משלה.

לאחר מכן הוסף 385 מיקרוליטר מים מזוקקים לכל צינור. במכסה אדים הוסף 400 מיקרוליטר של 5% פנול לכל מבחנה דגימה סטנדרטית ולא ידועה. מיד לאחר מכן הוסף שני מיליליטר חומצה גופרתית לכל צינור.

הקפידו להוסיף את החומצה הגופרתית על פני התמיסה. לאחר דגירה של הצינורות למשך 10 דקות, מערבל את הצינורות. לאחר מכן דגרו את הצינור למשך 30 דקות נוספות.

מעבירים 800 מיקרוליטר מכל צינור דגימה לשלושה מיקרו-קובטות פוליסטירן 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הגדר את הספקטרופוטומטר לקריאה ב-490 ננומטר וכיול עם קובטה ריקה. לבסוף, העבירו כל קובטה דרך הספקטרופוטומטר ורשמו את הספיגה.

באמצעות פרוטוקול זה, נותחו תכולת החלבון המסיס והפחמימות הניתנות לעיכול של ארבע רקמות שדה ותירס מתוק שונות משלושה אזורים גיאוגרפיים. נצפו הבדלים משמעותיים בתכולת החלבון המסיס בין האזורים, ולכן הצריכו ניתוחים נפרדים לכל אזור. בין אזורים היו מספר הבדלים בחלבון מסיס ובתכולת הפחמימות הניתנות לעיכול בין הרקמות.

במינסוטה, הרקמות השתנו רק בתכולת החלבון המסיס בעוד שהרקמות בצפון קרוליינה השתנו הן בחלבון מסיס והן בפחמימות הניתנות לעיכול. השונות בתכולת המאקרו-נוטריינטים ברקמות בטקסס הייתה תלויה במגוון. טכניקה זו תאפשר לחוקרים בתחום מדעי הצמח והאקולוגיה התזונתית למדוד במדויק חלבון צמחי מסיס ופחמימות ניתנות לעיכול, במקום להסיק ממדדים יסודיים.

אל תשכח שעבודה עם חנקן נוזלי, חומצות מרוכזות ובסיסים, עלולה להיות מסוכנת ביותר. לכן השתמש תמיד באמצעי זהירות כגון כפפות, משקפי מגן, סינרים ונעליים סגורות בכל פעם שאתה עובד עם כימיקלים אלה.