Name: PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: למדו שיטת PCR כמותית לספירת T7 bacteriophage מניסויי biopanning. הפרוטוקול כולל הכנת DNA גנומי, הגדרת תגובות PCR וניתוח נתונים. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק ויעיל של מספר גדול של דגימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי חברת פארמה קרן מחקר Starter גרנט ולהעניק הלאומי ללב, ריאות, מכון דם של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס R01HL138251.

1. פריימר תכנון וניתוח של דנ א גנומי Phage T7
<ol><li>עיצוב צבעי יסוד הגברה של דנ א גנומי phage T7. הערה: F (קדימה) ו- R (הפוכה) תחל (ראה טבלה של חומרים) להגביר את רצף ה-DNA T7 ממוקם במעלה הזרם של האזור משתנה בספריה (איור 1).</li>
	<li>לבחור מנתח פריימר מתאים כדי להעריך את הפרמטרים של צבעי יסוד, כולל טמפרטורת ההיתוך (Tm) אחוז תוכן הקטלוגים הכללים (GC %), הדימרים פריימר, היווצרות סיכת ראש, PCR והתאמתם (איור 1).</li>
	<li>להזמין את oligonucleotides פריימר (oligos), עם ההגעה, resuspend את oligos lyophilized במים DNase, RNase חינם אולטרה טהורים 100 מיקרומטר ריכוזים מניות בשפופרת צנטרפוגה 1.5 mL ולאחר לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.</li>
	<li>להפוך מספר aliquots (בסביבות 50 µL כל צינור 1.5 מ ל) של המניה פריימר 100 מיקרומטר. הערה: שלב זה משמש כדי למנוע מחזורים ההקפאה בתדירות גבוהה-הפשרה.</li>
</ol>2. מכינים את הסטנדרטים על כימות של דנ א גנומי Phage T7
<ol><li>באופן סדרתי לדלל 0.1 µg/µL (1.0 x fg8 10/µL) הפניה T7 phage DNA (שנרכשו; ב ריכוז ידוע של 0.1 µg/µL, ראה חומרים) 10-fold מ- 1.0 x 106 1.0 x 100 fg/µL עם אולטרה טהור H2O ב- 0.2 מ"ל המבחנות. להכין את כל הריכוז של הנפח הכולל של 20 µL (איור 2).</li>
	<li>מערבולת PCR צינורות כדי להבטיח ערבוב יסודי בכל שלב של דילול. בנוסף, לשנות עצות בעת הוספת לדנ דילול הבאים. הערה: מומלץ להכין פתרון חדש של ה-DNA תקנים עבור עיקול רגיל על כל הניסוי qPCR.</li>
	<li>השתמש המשוואה 1 (למטה) כדי להמיר לעיון phage T7 ריכוזי ה-DNA מ fg/µL הגנום עותקים (gc) /µL (איור 2).</li>
	<li>ריכוז ה-DNA phage T7 ב- gc/µL = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq1.jpg">(1) הערה: bp: זוג בסיסים; הפניית T7 דנ א גנומי היא 37314 bp.</li>
</ol>3. טיפול קדם של דגימות Phage לפני qPCR התגובה הכנה
<ol><li>
(אפשרות 1) Pipet 20 µL של T7 אחד שיבוט (phage) שנבחר מתוך biopanning נגד במבחנה סיסטיק פיברוזיס (CF)-כמו מודל ריר לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 mL. הוספת יחידות 1.25 DNase I (0.5 µL) כל מדגם 20 µL. הערה: הספרייה heptapeptide המאולץ ציסטאין phage T7 (CX7C) היה biopanned נגד ריר כמו CF מצופה ב- 24-ובכן ממברנה מוסיף (ראה טבלה של חומרים) למשך 15 דקות. פרטים נוספים ניתנים במקטע תוצאות. אחד T7 שיבוט נבחרה עבור הכנת הדוגמא qPCR מ eluate.<ol>
<li>אפשרות 2: Pipet 200 µL של T7 לשבט לתוך צינורות 1.5 מ ל, ולהוסיף 5 יחידות לימוד DNase אני (2 µL) על כל דגימה. הערה: היקף המדגם phage שנבחרו בשלב זה תלוי באמצעי האחסון שנאספו מ- biopanning. בעוד שהמוקד של הפרוטוקול נמצא qPCR של biopanned phage, השלבים עבור biopanning מפורטת פרוטוקול המשתמש phage T7 קיט (ראה טבלה של חומרים)13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קאפ השפופרות מדגם phage T7 (שלב 3.1), דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמבט יבש מחוממת (קרי, גוש חום).</li>
	<li>דגירה צינורות (מתוך שלב 3.2) ב 100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמבט יבש מחוממת (איור 3 א). התראה: מכיוון אידוי ועיבוי להתרחש במהלך השלב חימום, ודא כי הצינורות צנטריפוגה 1.5 mL הם כתרים לחלוטין.</li>
	<li>לסובב את phages שילדת מהשלב 3.3 ב 18,534 x g עבור שילוב ס' 10 phages על ידי הנחת הצינור על מערבל מערבולת להגדיר בכל מגע-הפעלת מצב עבור 10 s ו ספין-18,534 x g עבור 10 s שוב. הערה: מחזור ספין-לערבב-ספין היא כדי לוודא שהדגימות phage מחוממת מעורבבים היטב.</li>
	<li>לקרר את צינורות מדגם בטמפרטורת החדר (RT) על ידי השארת אותם על ספסל ניסוי או חנות ב 4 ° C במקרר למשך הלילה. הערה: ניתן להשהות הניסוי בשלב זה.</li>
</ol>4. מכינים qPCR תגובות
הערה: אחד התגובה PCR היא דוגמא אחת. כל תגובה PCR מכיל 5 µL של מאסטר qPCR מערבבים (ראה חומרים), µL 1 של 5 מיקרומטר פריימר זוג מיקס, µL 2 H2O ו- 2 µL שילדת מדגם phage T7. עבור תגובות PCR מרובים, כל ריאגנטים למעט דגימת phage הם premixed אחד צינור 1.5 מ. הנפח של כל ריאגנט של premix תלוי במספר הדגימות phage עבור qPCR.
<ol><li>להכין את premix qPCR 10 biopanned phage דוגמאות ריכוז לא ידוע ודוגמאות 7 של ריכוזים סטנדרטי שהפקידים. כתוצאה מכך, ישנן דוגמאות סה כ 51 ולכן, qPCR 51 תגובות (קרי, תגובה אחת לכל דגימה). עבור תגובות 51, להכין premix של 255 µL של qPCR מיקס מאסטר (51 x 5 µL), µL 51 של תחל (51 x 1 µL), µL 102 של H2O (51 x 2 µL). הערה: מומלץ להכין כמה תגובות PCR נוספת כדי לפצות על אבדן נפח במהלך aliquoting המיקס PCR לבאר כל צלחת qPCR 96-ובכן.</li>
	<li>µL 8 aliquot של ה-PCR premix לבאר כל צלחת qPCR 96-ובכן בסך 51 וולס (קרי: 51 תגובות qPCR). יש צורך לשנות טיפים במהלך aliquoting.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של דגימות phage T7 שילדת (שלב 3.4) או הפניה phage T7 DNA (שלב 2.1) כל טוב (איור 3B); לשנות עצות בעת הוספת דגימות דנ א שונה לבאר, כדי למנוע זיהום צולב. כמו כן, לוותר על דגימות ה-DNA µL 2 מתחת לפני השטח של premix "qPCR" (קרי, לתוך premix PCR 8 µL).</li>
	<li>חותם את הצלחת qPCR עם סרט דביק. הערה: שלב זה הוא קריטי, ללא קשר לסוג לוח qPCR. להשתמש בערכה מומלץ לאטום את הצלחת לחלוטין; אחרת, בכל אזור שאינו אטום בצלחת יגרום אובדן נפח במהלך ה-PCR רכיבה על אופניים.</li>
	<li>לעטוף את הצלחת qPCR ברדיד אלומיניום, כדי למזער את זריחה photobleaching והמשך להפעילה על הציוד qPCR.</li>
</ol>5. qPCR תנאי רכיבה על אופניים
הערה: תנאי הרכיבה qPCR הוקמו על הציוד הספציפי qPCR (ראה טבלה של חומרים).
<ol><li>הפעל את הצלחת 96-ובכן qPCR על הציוד qPCR. על הציוד, בחר הגדרות ' מתפריט ' כדי להגדיר את התנאים ניסיוני הבאים (איור 3C).</li>
	<li>לארגן רכיבה על אופניים התנאים כמפורט להלן עבור אמצעי אחסון מדגם של 10 µL: מחזור אחד ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, מחזור אחד ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורי (95 ° C 15 s, 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה). לאחר מכן, להפעיל את ההגדרות עקומת להמיס: מחזור אחד של 95 ° C עבור s, 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 15 ו- s 95 ° C 15.</li>
	<li>להמשיך לנתח את הנתונים כפי שמתואר בשלב 6.</li>
</ol>6. לנתח את qPCR הנתונים הגולמיים, להמיר מ qPCR Ct ערך ל- gc/µL עבור T7 Bacteriophages
<ol><li>לנתח את הנתונים הגולמיים qPCR והערכת איכות הנתונים על-ידי ניתוח החלקות האופיינית של הנתונים הגולמיים (איור 4). הערה: הגברה מגרש, מגרש ל להמיס עקומת העלילה הם שמאפיין מפתח מתווה לאמת את איכות הנתונים qPCR.</li>
	<li>
לחשב את ערכי מחזור (Ct) הסף רשע בין דגימות triplicate-כל ריכוז של העקומה סטנדרטי (שלב 2.1).
	<ol>
<li>מגרש אומר Ct (Y) נגד יומן (gc/µL) (X) כדי לקבל את עקומת ליניארי Y = kX + b (k הוא השיפוע של העקומה ליניארי, b הוא נקודת החיתוך).</li>
		<li>חשב את מקדם ליניארי14 R2 (R2 בטח &gt; 0.99).</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש העקומה תקן Y = kX + b כדי לחשב את מספר T7 phages הדגימות biopanning (קרי, phages נבחר נגד ריר כמו CF) ב- gc/µL (איור 5). הערה: k הוא השיפוע של העקומה סטנדרטי.</li>
	<li>לחשב את היעילות הגברה באמצעות המשוואה הבאה <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58165/58165eq2.jpg">(2) הערה: k הוא השיפוע של העקומה תקן שנוצר מתוך התייחסות דנ א qPCR. הטווח האידיאלי של הגברה יעילות הוא 90-110%.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11848876">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li>
<li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+technologies%3A+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li>
<li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20020040">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li>
<li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li>
<li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li>
<li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li>
<li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li>
<li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li>
<li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li>
<li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li>
<li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li>
<li>T7Select Biopanning Kit. , Millipore Sigma. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP ">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP </a> (2018).</li>
<li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21116397">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemitry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li>
<li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29180282">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li>
<li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro%2C+Oropouche%2C+and+oropouche-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li>
<li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li>
<li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure%3A+A+Kinetic+Study%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פיתחנו שיטות qPCR לכמת phage דנ א גנומי5, כאן אנו המתואר ומותאמים שיטה qPCR למנות T7 phages שנבחרו נגד מחסום CF דמוי ריר. מידע מינימלי עבור הפרסום של כמותיים בזמן אמת PCR ניסויים (MIQE) הנחיות הוסבו לפתח, לאמת את שיטת qPCR עבור ספירה של T7 phages15. פרוטוקול פיתחנו לכמת phages של ניסויים biopanning היא גישה היעילה, אמין, וחסכוני. פרוטוקול שלנו עבור הכנת הדוגמא qPCR רק בשימוש טיפול בטמפרטורות גבוהות (100 ° C, 15 דקות) של הפתרון phage, לא מחייבים phage DNA מיצוי וטיהור צעדים ...

טכנולוגיית התצוגה bacteriophage (phage), שפותחה על ידי ג'ורג סמית בשנת 1985, היא גישה חזקה, תפוקה גבוהה לזיהוי ליגנדים פפטיד או חלבון נגד מטרות או קולטני קרום התא, מחלת אנטיגנים, organelles הסלולר או ספציפי איברים ורקמות1,שני העשורים האחרונים2. כאן, ספריות אקראי של polypeptides או שרשרת אחת נוגדנים יוצגו על החלבונים המעיל של phages (בדרך כלל M13 או T7), ניתן לזהות ליגנדים מסוים ואתה מוריד נגד חלבונים קיבוע במבחנה או vivo בתוך מערכות ביולוגיות באמצעות תהליך הבחירה איטרטיבי. לאחר מכן, ליגנדים יכול להיות יחד עם סוכני דימות או טיפולית באבחון וטיפול של מחלות3,4. זה קריטי לספור במדויק phages במהלך מספר השלבים של biopanning: (1) לכמת phages זה לאגד המצע, (2) לכמת phages כדי לקבוע אם קיים העשרה עם כל סיבוב של בחירה (העשרה phage מציין biopanned phage אהדה עבור היעד). תקן הזהב הנוכחי על כימות, שכבה כפולה פלאק assay, מציג אתגרים מרובים; זה מייגע, מסורבלת, שעשוי להיות לא מדויק עבור מספר גדול של דוגמאות. לכן, הקבוצה שלנו פיתחה שיטה תגובת שרשרת (qPCR) פולימראז כמותיים רגיש, מדויק הדירים היעילה לספור חלקיקים phage M13 ו- T7 biopanning5.
qPCR היא שיטה אפשרית ומושכת לכמת במדויק T7 ו- M13 phages. מאז כל חלקיק phage בודדים יכולים להכיל רק עותק אחד של DNA גנומי (dsDNA או ssDNA), גנום phage אחד שווה ל מחלקיק אחד phage; על ידי לכימות מספר phage הגנום, זה ריאלי כדי לכמת את מספר phages. במהלך qPCR, כתב פלורסנט צבעי לאגד דנ א גנומי phage הלא ספציפית או במפורש דרך רצף ספציפי תחל במהלך ה-PCR-הגברה, זריחה את האות עולה עם כל סיבוב של הגברה. כאשר האות פלורסצנטיות מגיע לפתח עגול/מעגל ההגברה יצויין בתור מחזור הסף (Ct). ריכוז ידוע הפניה phage DNA מותוות נגד הערכים Ct שלהם להקים עיקול רגיל. באמצעות עקומת סטנדרטי עם הערכים Ct של דגימות די אן איי, ריכוזי phages יכול להיות עם אינטרפולציה.
בעוד אסטרטגיות רבות שפותחו בעבר, נעשה שימוש נרחב לכמת phages מן biopanning, לכל אחד מהם יש אתגרים ספציפיים. השיטה המקובלת ביותר היא שכבה כפולה פלאק וזמינותו. . הנה, המארח חיידקים נגועים phages מוכן במלון דילולים טורי, הם מצופים על מצע אגר מוצק, הערוכים בשכבות עם אגר; phages ממוספרים עם המספר של הפלאק נוצר (קרי, יחידות ויוצרים רובד או pfu) צלחת אגר. פלאק assay הוא רגיש אבל מייגע, זמן רב ולא מדויקות, במיוחד עבור דוגמאות רבות, עם ריכוזים גבוהים5. בנוסף, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) הותאמו למנות M13 ו T7 phage חלקיקים6,7,8. . הנה, phages-דילולים שונים מאוגדים, שנתפסו על מצע מוצק (קרי, microplate), שנבדק עם נוגדנים ספציפיים phage ולאחר שאותרו על-ידי שימוש כתבים (לדוגמה, אנזים רגיש סובסטרטים הדפסות כסף, fluorophores) לקבוע את מספר החלקיקים phage הנוכחי. הקריאות (למשל, זריחה, ספיגת) של דגימות ניתן לכמת ריכוזים לא ידוע נגד phage סטנדרטים בריכוזים ידועים. ELISAs מבוססי phage שונים פותחו אבל יש להם מגבלות אפשריות. קבוצה אחת פיתחה המבוסס על נייר כריך אליסה עם מגוון כימות שהשתרעו שבע סדרי גודל (102-109 pfu/mL); עם זאת, שיטה זו נדרש מספר השלבים של נוגדן ציפוי ולקח ליום שלם עבור assay8. הקבוצה שלנו גם פיתח שיטה אליסה לכמת M13 phage חלקיקים אך היה פחות רגיש זיהוי טווח של 106 כדי 11 10 pfu/mL5. לנתניד להחלפה פלורסצנטיות הגששים פותחו כדי למנות M13, כימות הנתונים יכולה להיות מושגת תוך 20 דקות; עם זאת, זו assay יש טווח דינמי צר של 109 ל-12 10 pfu/mL9. קבוצה אחת בשימוש מיקרוסקופ כוח אטומי למנות M13 phage חלקיקים בתמיסה, אך זה דורש מיקרוסקופ אלקטרונים מתקדמים, עבד רק בטווח צר של ריכוזים10. מחקר נוסף המשמש monodisperse אמולסיות השמנה phages כתב פלורסנט M13 ו- 4t ולספור phages לפי מספר טיפות פלורסנט; עם זאת, גישה זו גם הציג מגוון כימות צר מ-102 ל-6 10 pfu/mL11. בזמן droplet ש-PCR דיגיטלית נעשה שימוש כדי לכמת M13 phages, גישה זו אין אפשרות להבחין בין מספר חלקיקים phage זיהומיות וזיהומיות הלא12.
הקבוצה שלנו לאחרונה פיתחה שיטות qPCR למנות phages T7 ו- M13 מזוהה של biopanning נגד מודל תא מחסום הדם - מוח באמצעות הכתב שונה פלורסנט שני צבעי5. בהשוואה לשיטות כימות הנ ל, השיטות qPCR פיתחנו היו תפוקה גבוהה, היעילה לכמת מדגמים רבים מסוגלים להבדיל בין phages זיהומית, שאינן זיהומיות עם DNase שאני קדם בטיפול ו phage דגימות. חשוב לציין, גישה זו יכולים reproducibly ובדייקנות לכמת bacteriophages M13 ו- T7 מדגימות biopanning. כדי להדריך המתחיל חוקרים בתחום phage qPCR, כאן אנו מתארים שיטה qPCR מפורט לספור חלקיקים phage T7 מספריית מוגבל-ציסטאין (CX7C) הזזה נגד מכשול ריר סיסטיק פיברוזיס (CF) במבחנה . מהעבודה הזאת, ניתן להרחיב qPCR שיטת לכמת חלקיקים phage מסוגים אחרים של biopanning, ממקורות אחרים, כולל מים, קרקע של נוזלי הגוף.

<table><tbody><tr><td><חזקים>חומרים וריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימרים ל-T7 DNA גנומי</td><td>IDT</td><td></td><td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td></tr><tr><td>T7 בחר בקרת אריזה DNA</td><td>EMD Millipore</td><td>69679-1UG</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp אופטי 96 בארות צלחת תגובה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>qPCR מאסטר מיקס - הפעל את SYBR Green master mix</td><td>יישומי ביו-מערכות</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp ערכת סרט דבק אופטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4313663</td><td></td></tr><tr><td>T7Select 415-1 ערכת שיבוט</td><td>EMD Millipore</td><td>70015</td><td>פרוטוקולי משתמש: http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td></tr><tr><td>פתרון DNase I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>צלחת טרנסוול 24 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3472</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free מזוקק H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מאגר מלח (1x)</td><td>קורנינג</td><td>21040CV</td><td></td></tr><<tr><td>strong>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 מערכת PCR בזמן אמת עם מהיר 96-Well Block</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Pico 21 מיקרוצנטריפוגה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002415</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand מערבולת דיגיטלית מיקסר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>דגם: 2001</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio תוכנת PCR בזמן אמת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>v1.2</td></tr><tr><td>עיצוב פריימר qPCR בזמן אמת</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pcr כמותי של t7 bacteriophage מ- biopanning

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

פרוטוקול זה מתאר את השימוש PCR כמותי (qPCR) למנות T7 phages מ phage מבחר ניסויים (קרי, "biopanning"). qPCR היא גישה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית לכמת את הדנ א, הנה, זה מותאם לכמת phage הגנום כמדד עבור phage חלקיקים. ב פרוטוקול זה, שיטת הכנה phage נתיישב דנ א מתוארת באמצעות חימום בטמפרטורה גבוהה ללא טיהור DNA נוספים. השיטה צריכה רק כמויות קטנות של phages שילדת כרכים קטנים של התגובה qPCR. qPCR תפוקה גבוהה ומהיר, מסוגל לעבד ולקבל נתונים גישות אחרות ספירה phage צלחת 96-ובכן של תגובות ב- 2-4 ה Compared, qPCR יעיל יותר זמן. כאן, qPCR משמש לציון T7 phages מזוהה של biopanning נגד במבחנה , כמו סיסטיק פיברוזיס ריר מודל. בשיטת qPCR ניתן להרחיב לכמת T7 phages של ניסויים אחרים, כולל סוגים אחרים של biopanning (למשל., מרותק למיטה חלבון מחייב, אין ויוו ההקרנה phage) ומקורות אחרים (למשל, מערכות מים או נוזלי גוף). לסיכום, פרוטוקול זה יכול להיות שונה לכמת וירוסים אנקפסולציה ל- DNA.

כלי עיצוב פריימר שונים ניתן לעצב תחל qPCR. בדרך כלל, פריימר עיצוב תוכניות יש אלגוריתמים מוכללים משלהם כדי לחשב ולאמת את הפרמטרים מפתח של צבעי יסוד, למשל, GC %, Tm, פריימר דיימר או היווצרות סיכת ראש, וכו ' בדרך כלל, הקריטריונים המרכזיים דומים שונה כלי עיצוב פריימר, תחל יכול להיות מתוכנן ההוראות שלהם. פריימר הפיצוץ יכול לשמש כדי לאשר יחודיות של צבעי יסוד. פריימר אחד לשייך את מטרות במעלה הזרם של אזור משתנה T7 דנ א גנומי מוצג באיור1. כדי לקבוע א...

לשחזור מדויק, זמן יעיל כמותיים PCR (qPCR) שיטה לספור T7 bacteriophage מתואר כאן. הפרוטוקול מתאר בבירור phage הכנה דנ א גנומי, PCR התגובה הכנה, תנאי הרכיבה qPCR, ניתוח נתונים qPCR.

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על בעיות מפתח בתחומי הווירולוגיה והמיקרוביולוגיה הקשורים לרישום בקטריופאג'ים מדגימות מורכבות ואבחון וטיפולים מבוססי בקטריופאג'. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות יעיל ומדויק של זמן של מספר רב של דגימות מניסויי ביופאנינג של תצוגת פאג', שלא ניתנים לתיקון מסורתי. להדגים את ההליך יהיו רשמי מוהנטי ויסמים ליאל, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי.לאחר תכנון פריימרים ויצירת ריכוז מלאי, לקבל התייחסות T7 פאג DNA בריכוז של 0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר. באמצעות מים אולטרה-חמים, מדללים באופן סדרתי את הדנ"א הזה פי עשרה, ממיליון פמטוגרמות למיקרוליטר למיקרו-ליטר אחד בצינורות PCR של 0.2 מיליליטר. הכינו 20 מיקרוליטרים של כל ריכוז, הקפדו להחליף טיפים של פיפטה ומערבולת את הצינורות בין כל שלב בדילול.לאחר מכן להמיר את T7 פאג התייחסות ריכוז DNA מ femtograms לכל microliter לעותקים הגנום לכל microliter. ראשית, פיפטה 200 microliters של מדגם T7 פאג שיבוט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עבור כל אחד 10 הדגימות הרצויות. הוסף שני מיקרוליטרים של DNase אחד לכל צינור.מכסים את הצינורות ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות באמבטיה יבשה מחוממת. ואז דגירה ב 100 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות באמבטיה יבשה מחוממת. צנטריפוגה הצינורות המכילים את החום שטופלו פאג'ים ב 18, 534 פעמים גרם במשך 10 שניות.מניחים את הצינורות הצנטריפוגיים על מערבל מערבולת במצב הפעלת מגע למשך 10 שניות כדי לערבב את הפאג'ים. לסובב שוב ב 18, 534 פעמים g במשך 10 שניות. לאחר מכן, להשאיר את הדגימות על ספסל המעבדה כשעה כדי לקרר אותם לטמפרטורת החדר.הכינו את הקדם-מימיקס של qPCR ל-10 דגימות פאג' ביופאן של ריכוז לא ידוע ושבע דגימות של ריכוזים סטנדרטיים ב-triplicate. וכתוצאה מכך premix עבור 51 דגימות המכילות 255 microliters של תערובת אב qPCR, 51 microliters של פריימרים ו 102 microliters של מים. Aliquot שמונה microliters של PCR מוכן לערבב לתוך 51 בארות של צלחת qPCR 96-well.הבא להוסיף שני microliters של דגימות Phage T7 שטופלו חום לכל בארות אלה, מחלק אותו מתחת לפני השטח של premix qPCR. באמצעות סרט דבק, לאטום את הצלחת. לעטוף את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למזער הלבנת צילום פלואורסצנטי ולאחר מכן להמשיך להפעיל את הצלחת על ציוד qPCR.הגדר את תנאי הרכיבה ואת הגדרות עקומת ההמסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הפעלת ה- qPCR, עלילת ההגברה, חלקת עקומת ההמסה וההתוויה מרובת התוויה מנותחות מהנתונים הגולמיים. עלילת ההגברה מציינת אם הגברת PCR של כל דגימה מצליחה או לא.העלילה הרב-תכליתית מייצגת את ההגברה והריקבון של האות הפלואורסצנטי לאורך מחזורי ההגברה. בעוד שתווית עקומת ההמסה משמשת לאימות הספציפיות של פריימרים, מכיוון שלכל מוצר PCR יש טמפרטורת התכה ייחודית אחת. העקומה הסטנדרטית נוצרת לאחר מכן מהדנ"א של הייחוס.כאן יעילות ההגברה מחושבת להיות 92.4% נתונים מייצגים ממחקר qPCR מושווה לאחר מכן לאותו פאג', כי כימתו על ידי מבחנה פלאק שכבה כפולה בטווח נבדק של 10 עד 10 מיליון עותקי גנום לכל microliter. כפי שניתן לראות כאן, מספר הפאג'ים ב quantitation qPCR הוא גבוה יותר מאשר בהסטת פלאק. החוזרות של שיטת qPCR כפי שהיא מיוצגת על ידי מקדם השונות נתפסת כערכים הנעים בין 2.85% ל -27.2% בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי ישנם שיקולים רבים בפיתוח ושימוש ב- qPCR לכימות מדויק של פאג'ים, כולל טיפול והכנת דגימות וכיול של ציוד רלוונטי.בעקבות שיטה זו, ניתן לבצע טכניקות אחרות על מנת למנות חלקיקי פאג' במגוון יישומים הכלולים בביופאנינג vivo, הכנת DNA של ספריית פאג' וזיהוי רצף ופאג'ים מהדור הבא בדגימות סביבתיות מורכבות. אל תשכחו כי פאג'ים נחשבים מפגעים ביולוגיים במעבדה ואמצעי זהירות כגון ציוד מגן אישי, כולל כפפות ומעילי מעבדה, תמיד צריך להיות משוחק בעת ביצוע ההליך.

quantitative-pcr-of-t7-bacteriophage-from-biopanning

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה אנו דנים בתגובת השרשרת הכמותית של פולימראז, qPCR, כדי למנות בקטריופאג'ים מסוג T7 באמצעות כימות DNA. הצבע הפלואורסצנטי בתערובת ה-PCR נקשר לגדילים החדשים של הדנ"א המסונתז ופולט פלואורסצנטיות, הנמדדת.

תגובת שרשרת כמותית של פולימראז לספירת בקטריופאג'ים

סרטון וידאו זה מדגים שיטה לחקר אינטראקציות חלבון-תרופה באמצעות ביו-פנינג מבוסס ביו-סנסור QCM של ספריית הפפטידים-פאגים T7. הביו-פנינג של פאגים המציג פפטיד ספציפי על הביו-חיישן QCM מאפשר בידוד ספציפי של פפטידים בעלי זיקה גבוהה, ולאחר מכן ריצוף חומצות אמינו, המסייע לזהות אתרי אינטראקציה ספציפיים על חלבון המטרה.

קוורץ-קריסטל מיקרו-איזון ביו-פנינג מבוסס ביוסנסור לחקר אינטראקציות חלבון-תרופה

תצוגת הפאג היא טכניקה רבת עוצמה כדי ללכוד חלבונים או moieties חלבון הפועלים באינטראקציה עם מולקולה משותקת של עניין. ברגע שהחלטה מהסוג של ספריית cDNA הפאג ליצור והמסך נעשתה, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בחירת זיקה יעילה שמוביל לזיהוי של interactors.

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

אנו מתארים מבחנים לא רציפים רגישים מבוססי ג'ל כדי לבחון את הקינטיקה של התחלת גדיל מפגר באמצעות חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

דור חדש של פלטפורמות תרגום תמלול חופשי תא תוכנן לבנות מערכות ביוכימיות במבחנה באמצעות הביצוע של ג'ין מעגלים. במאמר זה, אנו מתארים איך הם bacteriophages, כגון MS2, ΦΧ174 ו- T7, מסונתז מן הגנום שלהם באמצעות e. coli כל ללא תא TXTL המערכת.

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

פרוטוקול זה מאפשר לחשוף את ההשפעה של פרופג'ים על המארחים שלהם. תרביות חיידקים מסונכרנות באמצעות תנאים התומכים בצורה הטובה ביותר במצב הליזוגני, ומגבילים את ההשראה הספונטנית. RT-qPCR מבדיל באופן חד-משמעי בין גנים מוגבלים לפאגים לבין אלה שאינם מצומדים מבקרת פאגים לבין אלה המתבטאים במהלך מחזור השכפול הליטי.

הבנת ההשפעה של בקטריופאג'ים ממוזגים על הליזוגנים שלהם באמצעות שעתוק

בקטריופאג'ים (פאגים), נגיפים שמדביקים חיידקים, הם מרכיב אינטגרלי של מיקרוביום המעי. אף על פי שהתושבים הסימביוטיים האלה מניעים את הכושר החיידקי ואת דינמיקת האוכלוסייה, מעט מאוד מובן על האופן שבו הם משפיעים על הומאוסטזיס מעיים ומחלות. פרוטוקול זה חוקר פאגים T4 מבודדים בתוך מודל עכברי, הניתן להתאמה לזוגות פאגים-חיידקים אחרים.

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

כימות מדויק של עותקים גנומיים וקטוריים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) הוא קריטי, אך פרוטוקול סטנדרטי טרם נקבע. פרוטוקול זה מתאר שיטה מתוקפת להכנת דגימות AAV מטוהרות וביצוע תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית (dd_PCR) כדי לכמת באופן אמין את טיטר הגנום הנגיפי.

כימות גנומים נגיפיים הקשורים באדנו בדגימות וקטוריות מטוהרות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז טיפתי דיגיטלי

כאן, אנו מתארים שיטות דגימה מהאזורים האופוטיים של מערכות אקולוגיות ימיות ומים מתוקים כדי לבודד ציאנופגים (והמארחים שלהם) ותהליכים שלאחר הדגימה המעשירים גנוטיפים בודדים ומאפיינים את דינמיקת האינטראקציה בין וירוס למארח.

דגימה סביבתית של מיקרובים פוטוסינתטיים ווירוסיהם: מהשדה למעבדה

למדו שיטת PCR כמותית לספירת T7 bacteriophage מניסויי biopanning. הפרוטוקול כולל הכנת DNA גנומי, הגדרת תגובות PCR וניתוח נתונים. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק ויעיל של מספר גדול של דגימות.

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

גלה סרטונים נוספים