קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביופיזיקלי, כגון עד כמה חזק חלבון בודד באינטראקציות חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לשתק מגוון רחב של ביומולקולות שונות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהטיפול בבדיקה שלוחה של מיקרוסקופ הכוח האטומי ותפעול מיקרוסקופ הכוח האטומי עצמו יכולים להיות מאתגרים.

כדי להתחיל, לבש כפפות עמידות בפני חומצה, משקפי מגן ומעיל מעבדה. מתחת למכסה אדים, השתמש באיזופרופנול במגבונים מדויקים נטולי מוך. הסר אבק גס וזיהומים מכמה שקופיות זכוכית.

העבירו את השקופיות הנקיות לצנצנת עומדת מלאה בחומצה הידרוכלורית מדוללת במים מזוקקים כפולים. אוטמים את הצנצנת במכסה מתאים ומניחים אותה באמבט קולי למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבר את בדיקות שלוחת הסיליקון ניטריד AFM למגלשת זכוכית נקייה כשהקצה פונה כלפי מעלה.

העבירו את השקופית לתא אטום לאור UV והקרינו את השקופית באור אולטרה סגול מלמעלה למשך 90 דקות לפחות. לאחר מכן, החליפו את החומצה ההידרוכלורית בצנצנת הצביעה במים מזוקקים כפולים, והקפידו לא לתת למשטח הזכוכית להתייבש. אטמו את הצנצנת עם המכסה והחזירו אותה לאמבט האולטראסוני למשך 10 דקות נוספות.

בינתיים, ממיסים חומצה אתוקסי סילאן פוליאתילן גליקול בתערובת של אתנול ומים מזוקקים כפולים לריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למיליליטר. אטום הרמטית תמיסה זו על מנת למנוע את אידוי האתנול. כשהוא מוכן, שפכו את תמיסת הסילאן לשתי צלחות פטרי נפרדות.

מניחים את מגלשות הזכוכית הנקיות לתוך צלחת פטרי אחת ואת השלוחה לשנייה. בעזרת פרפילם, אטמו הרמטית את שתי הלוחות כדי למנוע מהאתנול להתאדות. דגרו את הצלחות הנייחות למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השתמש בשלוש כוסות רצופות המכילות אתנול טהור כדי לשטוף גם את השלוחה וגם את מגלשות הזכוכית. הנח את השלוחה השטופה על מגלשת זכוכית נקייה. העבירו את שקופיות הזכוכית הפונקציונליות לצנצנת הצבע.

מרפאים את שניהם בתנור בחום של 110 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, אחסן את דגימות הזכוכית הסילנית והשלוחה במייבש ואקום עד שבוע. כאשר מוכנים להתחיל בקיבוע אקראי של חלבונים, הכינו תמיסה המכילה EDC ו-NHS בתמיסת מלח סטנדרטית עם פוספט כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מכסים את שקופיות הזכוכית המצופות סילאן בתמיסה זו. הנח את בדיקות השלוחה הסילניות לתוך טיפה של תמיסת ECD/NHS. דוגרים את שניהם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו גם את השלוחה וגם את השקופיות בשלוש כוסות רצופות על מנת לשטוף לחלוטין את כל עודפי ה-EDC/NHS. העבירו את שקופיות הזכוכית המופעלות לצלחת פטרי המצוידת ברקמה רטובה. הוסף טיפה של תמיסת החלבון הרצויה לאזור המופעל על ידי EDC / NHS של מגלשות הזכוכית ואטום את צלחת הפטרי באמצעות פרפילם ודגר את הבדיקות בטמפרטורת החדר.

הוסף טיפה של תמיסת החלבון הרצויה לקופסת השלוחה המצוידת ברקמה רטובה. לאחר מכן, שטפו היטב את בדיקות השלוחה עם PBS. הנח את הבדיקות לתוך הטיפה בקופסה וסגור את הקופסה.

דגרו את הבדיקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סמן את אזור טיפת החלבון בצד האחורי של שקופיות הזכוכית. שטפו היטב את שקופיות הזכוכית ואת בדיקות השלוחה באמצעות שלוש כוסות רצופות מלאות ב-PBS.

הנח את הבדיקות השטופות לתוך כלי המכיל תמיסת מלח עם Tris-buffered למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו היטב את שקופיות הזכוכית ואת בדיקות השלוחה עם PBS. אחסן אותם בצלחות פטרי נפרדות המכוסות ב-PBS עד שהם מוכנים לשימוש.

תקן שקופית זכוכית שזה עתה נוקתה על מחזיק הדגימה של AFM וכסה אותה במאגר PBS. לאחר מכן, תקן את בדיקת השלוחה המוכנה במחזיק השלוחה והנח אותה בראש ה-AFM. הרטיבו בזהירות את השלוחה עם טיפת מאגר PBS.

הזז לאט את השלוחה לכיוון משטח הכיול עד שהשלוחה שקועה לחלוטין במאגר ה-PBS, אך עדיין הרחק ממשטח הכיול. השתמש במיקרוסקופ האופטי העליון או במיקרוסקופ ההפוך של ה-AFM כדי למקם את הלייזר בצד האחורי של השלוחה מקם את נקודת הלייזר ליד קצה השלוחה קרוב למקום בו נמצא הקצה והתאם את המיקום בפוטודיודת הגלאי ארבעת הרבעים של ה-AFM כך שקרן הלייזר המוחזרת ממוקמת במרכז הפוטו-דיודה.

לאחר מכן, פתח את מנהל הכיול בתוכנת AFM. כדי להתחיל לכייל את רגישות השלוחה ואת קבוע הקפיץ, התקרב בזהירות למשטח המצע ורשום עקומת מרחק כוח. התאם קו ישר לחלק התלול ביותר של עקומת כוח הנסיגה שבו הקצה נמצא במגע עם משטח המצע כדי לקבוע את רגישות המנוף האופטי.

החזר את השלוחה ממשטח הדגימה והקלט מספר ספקטרום רעש תרמי עם השלוחה לפחות 100 מיקרון מפני השטח והתאם מתנד הרמוני, המסופק על ידי תוכנת AFM, לספקטרום הרעש התרמי כדי לקבוע את קבוע הקפיץ של השלוחה . לאחר מכן, משוך לאט את השלוחה ומשוך אותה מהתמיסה. הסר את משטח הזכוכית המשמש לכיול השלוחה והחלף אותו במשטח הדגימה המכיל את החלבונים המשותקים.

הזיזו לאט את השלוחה הלחה לכיוון משטח הדגימה עד שהשלוחה מכוסה לחלוטין על ידי מאגר PBS, אך עדיין הרחק משטח המצע. התקרב אל פני השטח ורשום עקומות מרחק כוח מרובות במיקומים שונים על פני הדגימה עם כוח מגע של 250 פיקונוטון, זמן מגע של שנייה אחת, אורך נסיגה של שני מיקרומטר ומהירות נסיגה של מיקרומטר אחד לשנייה. בתוכנת עיבוד הנתונים, בחירת האצווה הפתוחה של סמל Force Scan's כדי לפתוח את עקומת הכוח הנמדדת files.

בחר את כייל מחדש את סטיית ה-V על ידי התאמת רגישות בסמל קבוע הקפיץ כדי להמיר את סטיית השלוחה לכוח הפרופורציונלי ישיר. לאחר מכן, בחר בסמל Baseline Subtraction'כדי להפחית את קו הבסיס של ערוץ הנסיגה באזור של עקומת הכוח הרחק מהמשטח, שגם קובע את רמת הכוח האפס. בחר בסמל 'קביעת נקודת מגע' כדי להגדיר את הנקודה שבה הקצה יוצר מגע עם הדגימה.

בחר בסמל Tip Sample Separation' כדי להמיר את אות הגובה להפרדת דגימת קצה. בנוסף להפחתת מיקום נקודת המגע, זה מפחית את כיפוף השלוחה כדי לחשב את המרחק בין משטח המצע לקצה ה-AFM. בחר בסמל Fit a Polymer Chain Model' ובחר במודל Extensible Worm-like Chain' כדי לסנן את עקבות מרחק הכוח עבור שיאי כוח המתרחשים באורכי קרע מעל 70 ננומטר.

מיין אינטראקציות לא ספציפיות והחל את מודל השרשרת דמוי התולעת הניתן להרחבה על הפסגות שנבחרו. במחקר זה, חלבונים משותקים קוולנטית עם אוריינטציה אקראית באמצעות האמינים הראשוניים הנגישים שלהם. תמונת AFM של שכבת הפולימר הסילנית מציגה רק גלי שטח קטנים בגבהים הנעים בין שניים לחמישה ננומטרים.

עם זאת, נראה כי למשטח המתפקדים עם פיברונקטין יש מולקולות פיברונקטין בגובה של כ-10 ננומטר. בחינה מדוקדקת יותר מגלה כי ניתן לזהות את המבנה הדימרי של המולקולות. נראה כי מולקולות אלו קומפקטיות, עם גובה של ארבעה עד חמישה ננומטר מעל ציפוי פני השטח של PEG ואורך של כ-120 ננומטר.

לאחר מכן נחקרים כוחות האינטראקציה של RRGA עם פיברונקטין. עקומות הפרדת מדגם קצה מייצגות שנרשמו במהירות של מיקרון אחד לשנייה הראו אינטראקציה נמוכה ברקע ואירועי אינטראקציה מעוצבים היטב, אשר מותאמים לאחר מכן, באמצעות מודל שרשרת דמוי תולעת הניתן להרחבה. שרטוט התוצאות של התאמה זו מראה כי לאחר התגברות על אינטראקציות משטח לא ספציפיות במתיחת מקשירי ה-PEG, לעד 19% מעקומות הכוח יש אירועי קרע עם כוח קרע ממוצע של 52 פיקונוטון עבור אינטראקציית הפיברונקטין RRGA ובמרחק דגימת קצה של כ-100 ננומטר.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שבהתאם להגדרות כמו זמן המגע או מהירות הנסיגה, נתוני ספקטרוסקופיית כוח המולקולה הבודדת מכילים מידע מרובה וכי פרוטוקול זה יכול להיות רק צעד ראשון לקראת ניתוח נתונים מלא. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אינטראקציות של מולקולה בודדת, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור אינטראקציות ברמת התא הבודד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ספקטרוסקופיה של כוח תא בודד על מנת לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד תאים שלמים מתקשרים עם משטחים מצופים חלבון.

אל תשכח שעבודה עם חומצות ואור UV עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו כפפות עמידות לחומצה ותא אטום לאור UV בעת ביצוע הליך זה.