Name: ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למדו שיטה מהירה לייצור טריטרפנים בקנה מידה מפוח בעזרת ביטוי ארעי ב-Nicotiana benthamiana. הפרוטוקול מאפשר שימוש בשילובי אנזימים שונים ללא צורך בבניית וקטורים מורכבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי נוריץ מחקר פארק Studentship (הבן), הנדסת הג'וינט ואת המועצה מחקר מדעי/Biotechnological במימון מחקר מדעי ביולוגי, המועצה BBSRC OpenPlant סינתטי ביולוגיה המרכז לחקר הענק (BB / L014130/1) (M.J.S., ואחרות); ג'ון אינס מרכז הידע Exchange ומסחור הענק (BB/KEC1740/1) (בי); ואת המענק תוכנית אסטרטגית BBSRC מכון 'מולקולות מן הטבע' (BB/P012523/1) וקרן ג'ון אינס (ואחרות). ברצוננו להודות ג'ורג Lomonossoff למתן את הווקטורים pEAQ אנדרו דייוויס לצילום.

<ol><li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triterpene+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li>
<li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P450s+and+UGTs%3A+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li>
<li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limonoids%3A+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li>
<li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra02784a">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li>
<li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+oleanane+triterpenoids%3A+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li>
<li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li>
<li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenosides+chemistry%2C+biosynthesis%2C+analysis%2C+and+potential+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Food+and+Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li>
<li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li>
<li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pEAQ+vector+series%3A+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li>
<li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pEAQ%3A+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li>
<li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li>
<li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li>
<li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li>
<li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+extraction+techniques+for+natural+products%3A+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li>
<li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li>
<li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li>
<li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li>
<li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li>
<li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li>
<li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הסתננות ואקום גבוה-דרך-הניח מאפשרת פרוטוקול זה לשמש באופן שגרתי במעבדה שלנו לייצור מיכשור וציוד של תרכובות טריטרפן עניין ליישומים שונים במורד הזרם. מנגנון ואקום הסתננות המתוארים כאן בקלות משוכפלת. תוספת של המאגר ואקום, מומלץ להקטין את הזמן הנדרש כדי למשוך את הואקום הכרחי, אולם ניתן פשוט מחדש תנור ואקום יאומתו כמו תא הסתננות. הגנה על משאבת ואקום באמצעות תוספת של הקבל מתאימים תיאורטית הגיונית, אבל במעבדה שלנו אנחנו גילינו שזה יהיה מיותר.
כיסוי הסתננות בסכנה אם העלים לא שקועים לחלוטין ההשעיה הסתננות. בעיה זו ממוזער על-ידי הבטחת כי הרמה של המתלה מגיע לפני השטח העליון של בעל המפעל, כי בעל המפעל הוא צר על האמבטיה הסתננות. הערה מאיור 2 כי המשטח העליון של בעל המפעל שקוע לאמבטיה הסתננות כאשר במקום. זו מושגת על ידי פאנלים על הקצוות האמצעי של בעל אשר מהווים נקודת העיגון עם החלק העליון של האמבטיה הסתננות. המתלה הסתננות יחייב תוספות תקופתיים כדי לשמור על רמת ההשעיה. זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי תוספת של חדירת עודפי ההשעיה כדי למנוע צמצום הדרגתי של ה OD600 במהלך החדירה batch-wise גדול. עם זאת, בידיים שלנו, החלפת מים לא נראה יש השפעה ניכרת על התשואות הצפויה בקנה מידה מפוח, אמנם זה לא היה quantitively חקר. ועמדו להסתנן כמה צמחים של אצווה אחת של הסתננות ההשעיה היא עדיין שאלה פתוחה. אנחנו באופן שגרתי לחדור בין צמחים 100 ו-200 עם אצווה בודדת של הסתננות ההשעיה. בנוסף, זה נורמלי עבור אדמה תסנן לתוך ההשעיה חדירה במהלך תהליך הסתננות. זה לא נמצאה השפעה ניכרת על הסתננות היעילות.
במשך הקציר. זה רצוי (אך לא קריטית) כדי לקצור רק העלים היו שחדרו (כמה עלים תהיה גדול שלאחר חדירה). בציר סלקטיבי מונע דילול עם רקמת יצרנית, אשר אחרת להגביר את היחס של זיהומים אנדוגניים יחסית למתחם של ריבית. זה יש השפעה הנומינלית על הקלות של טיהור במורד הזרם ומגביר את קנה המידה של תהליכים אלה. בעת שימוש tHMGR כדי להגביר את אספקת קודמן, הפנוטיפ necrosed נצפית לעיתים קרובות לפתח על התקופה שלאחר הסתננות צמיחה. זה נורמלי, למעשה מסייע בציר סלקטיבי, תהליך הייבוש במורד הזרם. ניתן לאחסן את האבקה עלים יבשים בדרך כלל במיכל אטום במקום קריר, יבש, חשוך, אבל באופן אידיאלי desiccator תחת ואקום. זה תלוי היציבות של המתחם של עניין. לנקוט זהירות אם בוחר לאחסן במקפיא-80 ° C. להבטיח את יבשים העלים הם במיכל עמיד למים, על הסרה של אחסון, לאפשר את המכל כדי לחמם לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. כך תגרום rewetting של העלים, הפרעה עיבוד מטה-stream.
השלבים שלאחר הקציר של פרוטוקול זה ניתנים להמחשה, וניסיון כדי לסייע החוקרים האלה תהיה מוגבלת כימיה מעשית. הם הרבה מכדי רבים טכניקות החילוץ/טיהור אחרות מוצר טבעי. כמפורט במבוא, פסי יתרונות רבים, אולם הבירה עלות המנגנון PSE זמינים מסחרית ייתכן שהעלות ולאחר זה לא חיוני. טיפול בסיסי חילוף יונים-שרף היא שיטה מאוד נוח להחליף המסורתי סיבון ואחריו נוזלי/נוזל למחיצות. עם זאת, היא לא מתאימה עבור מוצרים המכילים חומצה קרבוקסילית קבוצות או קבוצות פונקציונליות זה הידרוליזה בתנאים בסיסיים, כגון אסטרים. מוצרים אלה יהיה צפוי יישמרו על שרף חילוף יונים בסיסיים. עם זאת, יש פוטנציאל לנצל את זה עבור לכידה, לשחרר את ההליך (לא מתועדים כאן). איפה סיבון מסורתי יהיה הולם, טיפול בסיסי חילוף יונים-שרף מגישה כתחליף נוח. כבר מצאו את שיטת כרומטוגרפיה שמתואר בשלב 9, ניתן להכליל עבור תרכובות המתואר באיור3. עם זאת, תרכובות של קוטביות מוגברת עשוי לדרוש 100% אתיל אצטט • תנאי תקופה ארוכה. התייחסות צעד 9.2, טיהור בסדר במורד הזרם הוא ספציפי מורכבים לחלוטין, הוא גם תלוי בקנה מידה. סיבובים חוזרים ונשנים של כרומטוגרפיה פלאש מידה קטן יותר עם מעברי צבע ממוטב, מספיקה בדרך כלל להשגת טוהר המתאים לניתוח NMR. על קשקשים גדולים, התגבשות לעתים קרובות חלופה נוחה. במקרים קשים, מפוח או מפוח למחצה ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) יכול להיות מועסק בהתאם לכמות הרצויה של המתחם מבודד. דוגמאות של תהליכי טיהור במורד הזרם עבור מגוון של תרכובות נציג ניתן למצוא במקום8.
בפרוטוקול הנוכחי, כפי שהוצג כאן, משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו, הוכיח את השירות. עם זאת, ישנו טווח עדיין משמעותיים נוספים מיטוב של פלטפורמת הביטוי. עבודה מתמשכת במעבדה שלנו לחקור איך נוסף מסלול הנדסה, שליטה דיפרנציאלית על רמות ביטוי החלבון יכול לשפר טריטרפן הפקה נוספת, תוך תיווכה רעילות לתאים המארח. יש גם פוטנציאל לחקור המניפולציה של20,של מערכות תחבורה תאיים21, הכיוון של אנזימים תאים סלולריים שונים22,23, השדרות אשר יכול לשפר היעילות של אירועי חמצון מרובים. גם ניתן לסייר היתרונות הפוטנציאליים לפעילות שינוי המבנה הבסיסי של organelles מפתח. לדוגמה, ביטוי של התחום ממברנה של תודרנית לבנה HMGR נצפתה לזירוז היפרטרופיה של רשתית תוך-פלזמית צמחים24; אתר המפתח לפעילות CYP450. פרוטוקול זה הוא אידיאלי עבור הייצור של מיליגרם ל בקנה מידה גרם כמויות של מוצרים טריטרפן, יכול להיות מועסק במסגרת מחקר כדי לגשת תרכובות למחקר במורד הזרם (למשל, חקר מבנה-פעילות שיטתית קשרי הגומלין ולאחר חקירות ראשוני למאפיינים pharmacodynamic ו פרמוקוקינטיים של אחרים-ריאקטיבים עניין קליניים). עם זאת, הפלטפורמה היא לינארית, באופן אמין ומדרגי פשוט על-ידי הגדלת מספר צמחים בשימוש, ומעשיות של ביטוי חולף דרך agroinfiltration הוכח בקנה מידה תעשייתי לייצור של חלבונים התרופות 14, לפיכך יש פוטנציאל עבור הפלטפורמה שיורחבו לייצור מסחרי של triterpenes בעלי ערך גבוה. לחלופין, זה גם אפשרי לדמיין את הייצור של transformants יציב נושאת את המעבר biosynthetic הוחלף נגזר multigene הגדול יצורים עילאיים הרצון גיבוש, המאפשר גידול המוני והמשיך "חקלאות" של הטרנסגניים benthamiana ש זנים ייצור תרכובות שונות של ערך מסחרי.

Triterpenes הם אחד מהגדולים רוב המשפחות מגוונות מבחינה מבנית של מוצרים טבעיים מהצומח. למרות המגוון העצום שלהם, כל המוצרים הטבעיים טריטרפן הסברה להיגזר את אותו קודמן לינארית 2, 3-oxidosqualene, תוצר של השביל mevalonate בצמחים. Cyclization של 2, 3-oxidosqualene יזם, נשלט על-ידי משפחה של אנזימים כינה oxidosqualene cyclases (OSCs). שלב זה cyclization מייצג את הרמה הראשונה של גיוון, עם מאות פיגומים טריטרפן שונים שיש דווחו טבע1. פיגומים אלו מגוונים נוספים על-ידי התאמת אנזימים כולל אך לא מוגבל, ציטוכרום p450s1,(CYP450s)2. מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר כזה יכול להוביל מורכבות עצומה, לפעמים וכתוצאה מכך המוצרים הסופיים אשר בקושי לזיהוי מ טריטרפן האב. לדוגמה, מבנה מורכב אזדרכטין limonoid חזק של חרקים, antifeedant הוא האמין שואבים טריטרפן tetracyclic של tirucallane סוג3.
רבים נגזר טריטרפן מוצרי טבע, אפילו אלה עם האב יחסית שלא שונתה פיגומים, הוכחו בעלי פעילות ביולוגית רלוונטית מסיבות בריאותיות4,5,6,7. עם זאת, עד כה פוטנציאל זה לא תורגמה שפע של סמים נגזר טריטרפן במרפאה. . זה ניתן לטעון (לפחות חלקית) תוצאה של גישה מוגבלת סינתטי מעשי ברמה זו של המתחם, בעיה אשר יכולים להחניק חקר מבנה-פעילות הגומלין ופיתוח של עופרת מועמדים על ידי מסורתי מרפא כימיה זרימות עבודה.
הביטוי ארעית של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר טריטרפן ממינים אחרים צמח benthamiana ש העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים חדשים בעלי ערך גבוה טריטרפן (איור 1). תהליך זה יכול לשמש באופן פונקציונלי לאפיין את המועמד אנזימים, בנייה מחדש של מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר של מטבוליטים חשובים המתרחשים באופן טבעי. באותה מידה, אפשר גם לנצל את זה ב biosynthetic הוחלף נגזר גישות קומבינטורית. לייצר מוצרים חדשניים טריטרפן, אסטרטגיה שיכול לגרום ספריות של תחליפי הקשורות מבנית, המאפשר חקר הקשרים מבנה-פעילות שיטתית מעופרת פעילים ביולוגית תרכובות8,9.
Agroinfiltration הוא אמצעי יעיל ופשוט של השגת ביטוי ארעי העלים benthamiana ש . התהליך כרוך החדירה של עלים עם השעיה של tumefaciens א נושאת את construct(s) בינארי ביטוי של עניין. זו מושגת באמצעות הפעלת לחץ שכופה את הנוזל דרך הפיוניות, האוויר במרחב המערכת, והחלפתו המתלה tumefaciens א . החיידק להעביר את T-DNAs בהתאמה הפנים של תאי הצמח, והתוצאה היא ביטוי חלבון מקומי ולא ארעית בתוך רקמת העלה הסתנן.
תוך כדי כל וקטור בינארי מתאימים עבור יצירת הצמחים הטרנסגניים עשוי להיות מועסק לביטוי ארעי, אנו מנצלים לוביה פסיפס וירוס CPMV, נגזר Hypertranslational (HT) חלבון ביטוי מערכת10, 11. במערכת זו הגן עניין משני צדדיה אזורים לא מתורגם (UTR) מ CPMV RNA-2. 5' UTR מכיל שינויים וכתוצאה מכך רמות גבוהות מאוד של חלבון תרגום עם אין הסתמכות על שכפול ויראלי12. שיטה זו פותחה לתוך הסדרה וקטור בינארי קל ומהירה (pEAQ) הכוללת רקומבינציה בייעודי לאתר שיבוט תואם פרוטוקול בונה (pEAQ -HT- DEST)10,11. רוב pEAQ וקטורים מכילים גם עם עגבניות פעלולים בושי נגזר וירוס P19 שתיקה משתיק קול ג'ין13 בתוך החלק T-DNA בקלטת ביטוי, אשר עוקף את הצורך coinfiltrate זן P19 נושא נפרד, ונותנת לו מאוד ביטוי חלבון ברמה גבוהה במארח הצמח תא10,11.
שימוש benthamiana (ש ע) כמו מארח ביטוי יש יתרונות מסוימים בעת עבודה עם מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר הצמח. הארכיטקטורה תא תומך מיסודו mRNA המתאים לעיבוד חלבון, ואת מידור תקין, בנוסף פו-טי של אנזימים הדרושים לעבודה, reductases (עבור CYP450s) ו מבשרי מטבולית. מקור הפחמן הוא הפוטוסינתזה; לפיכך, ניתן פשוט לגדל צמחים קומפוסט איכותי, המחייב רק מים, CO2 (מן האוויר), ואור שמש כקלט. הפלטפורמה היא גם מאוד נוח עבור ביטוי משותף של צירופים שונים של חלבונים, כמו זה ניתן להשיג facilely באמצעות חדירה שיתוף של זנים שונים של tumefaciens א, שלילת הצורך לבנות ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים גדול קלטות. יתר על כן, התהליך וניתן באופן ליניארי ובאמינות לשנותם פשוט על-ידי הגדלת מספר צמחים המשמשים את הניסוי.
העבודות הקודמות במעבדה שלנו הוכיחה את התועלת של הפלטפורמה עבור ניסויים בקנה מידה מפוח. זה כלל את הכנת triterpenes הרומן לשימוש אתריים מבחני בקנה מידה למעלה כדי להשיג גרם כמויות של מוצר בודד. יתר על כן, ניתן להגדיל הצטברות של מוצרים טריטרפן heterogenous כמה לקפל על ידי ביטוי משותף של טופס N-מסוף-קטום, משוב-רגישות של הידרוקסי 3, 3-methyglutary-קואנזים רדוקטאז (tHMGR), הגבלת קצב נגד הזרם אנזים מסלול mevalonate8.
המפתח ניסויים מפוח בקנה מידה כזה הוא היכולת בנוחות עד בקנה מידה תהליך הסתננות. בניסוי טיפוסי, עשרות עד מאות צמחים עשוי להידרש כדי להשיג את המטרה כמות המוצר מבודד. הסתננות עלים בודדים באופן ידני (באמצעות מזרק מיותר) היא מבצעית תובעניים, וצורך לעתים קרובות מדי, עיבוד בשיטה זו מעשי עבור הסולם שגרתית. הסתננות ואקום מציעה יתרונות חדירה יד, הוא אינו תלוי רמת המיומנות של המפעיל ומאפשר החדירה של אזור רחב יותר של פני העלים. הליך זה משמש מסחרית לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים התרופות14. פרוטוקול זה מנצל מכשירים חדירה ואקום בקלות ניתן לשכפול, אשר יכול להיות בנוי חלקים זמינים מסחרית. דבר זה מאפשר חדירה בו זמנית של עד 4 צמחים, מנקר מהירה ומעשית batch-wise חדירה של מאות צמחים בתקופה קצרה של זמן (איור 2 א -2b). מנגנון ואקום הסתננות מורכב תנור ואקום המהווה תא חדירה (2f איור). התנור מחובר משאבה באמצעות מאגר ואקום. זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להשיג את הואקום הרצויה בבית הבליעה הסתננות. צמחים מאובטח ב בעל העידו והפכתי לתוך אמבט מים מפלדת 10 L מלא עם הבולם tumefaciens א (איור 2 א -2 c). טבילה מלאה חלקים אווירי של הצמחים חשוב חדירה יעיל. המים הרותחים הוכנסה בתוך תא חדירה (איור דו-ממדי -2e), את ואקום להחיל כדי לצייר את האוויר מתוך הרווחים interstitial עלה. ברגע הלחץ הופחת 880 mbar (תהליך אשר לוקח כ 1 דקות) תא הסתננות הוא החזיר במהירות הלחץ האטמוספרי 20-30 s על-ידי פתיחת שסתום כניסת את התנור, ואז חדירה הושלם.
חמישה ימים לאחר חדירה חומר צמחי מוכן עבור חילוץ האיסוף ובעקבות ובידוד של המוצר הרצוי. מנקודה זו התהליך הוא פשוט אחד מוצר טבעי מיצוי וטיהור מחומר עלה, זרימת עבודה המוכרת כל כימאי מוצר טבעי. שיטות שונות רבות הראשונית מיצוי וטיהור הבאים קיימים15. הבחירה המתאימה ביותר של שיטות בדיוק את אותם התנאים בשימוש תלויה מאוד התכונות הכימיות מסוים של המתחם של עניין, בנוסף זמינותו של מיומנויות ו/או ציוד. . זה לא ניתן לכלול בפרוטוקול זה שיטה להכליל באופן מלא, שלב אחר שלב העיבוד במורד הזרם של חומר צמחי שנקטפו עלה על מוצר בודד יכול להיות אחריו באופן עיוור על כל מוצר טריטרפן עניין, וגם זה יהיה מתאים כדי לנסות לעשות זאת. עם זאת, פרוטוקול זה יספק סקירה כללית של העבודה הבסיסי בשימוש המעבדה שלנו כמה שיטות בשלבים המוקדמים של התהליך, אשר מניסיוננו הוכיחו להכליל למוצרים טריטרפן אגליקון ביותר מחומצן. זה כולל שתי טכניקות נדיר יחסית, כלומר, חילוץ הממס בלחץ (פסי), ו שיטה נוחה שלב heterogenous להסרת כלורופיל באמצעות שרף יונים בסיסיים מאוד.
פסי היא טכניקה יעילה במיוחד לצורך הוצאת מולקולות אורגניות קטן ממטריצות מוצק. עקירות נעשות תחת לחץ (ca. 100-200 bar), היתרון העיקרי להיות היכולת להשתמש להקלה טמפרטורות אשר חורגים הרתיחה הצבע של הממס החילוץ. זה יכול להפחית באופן משמעותי את הזמן ואת כמות הממס הדרוש להשגת הוצאה ממצה, לעומת טכניקות אחרות ממס חם כגון refluxing פשוטה או עקירות Soxhlet16. מסחרי ספסל-העליון PSE כלים זמינים, אשר לנצל את תאי החילוץ להחלפה, הממס אוטומטיות טיפול חימום, ניטור. זה הופך את הטכניקה הזו מאוד נוח. . זה גם ניתן לטעון מסוכנים פחות, במיוחד עבור אופרטורים בעלי ניסיון בכימיה המעשית מוגבלת.
סיבון של תמציות עלה גולמי תחת ריפלוקס ואחריו נוזלי/נוזל למחיצות היא טכניקה נפוצה להסרת בצובר chlorophylls לפני טיהור עוקבות או ניתוח. עם זאת, זה לעיתים קרובות מבצעית דורשת הרבה על סולמות גדול יותר. יתר על כן, זיהוי של ממשק או אובדן המוצר עקב היווצרות של אמולסיות יכול להיות בעייתי. השימוש בחום בסיסי חילוף יונים-שרפים לבצע הידרוליזה heterogenous שלב יכול לשמש כתחליף נוח. החלק פיגמנט של כלורופיל הידרוליזה נשאר מודבקת שרף, ו ניתן להסיר רק באמצעות סינון. פרוטוקול זה מנצל עיבוד מפוח בקנה מידה של ההליך האנליטי שדווחה בעבר17 מעסיקה שרף יונים בסיסיים זמינים מסחרית.
להלן נתאר פרוטוקול מפורט, מהיר ומדויק לייצור בקנה מידה מפוח triterpenes ניצול פלטפורמה זו מבוססת על צמחים. פרוטוקול זה משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להכין עשרות למאות מיליגרם של המוצר טריטרפן מבודדים עבור יישומים כגון אפיון מבניים על-ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה ו / או המשך מחקר בפונקציונלי מבחני.

<table><tbody><tr><td>מכשיר GC-MS</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler המתאים לביצוע תגובות PCR</td><td>כל</td> מכשיר אלקטרופורזה ג'ל <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופיפטות תזוזה אוויר מתכווננות (גדלים: 1000 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L, 20 ומיקרו; L, 10 ומיקרו; L, ו-2 ומיקרו; L)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>נושא חנקן נוזלי רחב עליון (גודל: 2 ליטר)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה ספסלית (קיבולת: 24 x 1.5 / 2 מ"ל, מקסימום מהירות: =/> 15000 סל"ד)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסל (קיבולת: 20 x 50 מ"ל, מקסימום מהירות: =/> 4000 סל"ד)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה רצפתית גדולה (קיבולת: 4 x 1 ליטר, מהירות מקסימלית: =/> 4000 סל"ד)</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>חממה עומדת</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור רועד (בקבוק clamp גדלים: 10 מ"ל, 50 מ"ל, 2 ליטר)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי צנטריפוגה (1 ליטר)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר חדירת ואקום</td><td>בהתאמה אישית</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 ס"מ עציצים</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מנגנון ייבוש בהקפאה (=/> קיבולת מעבה של 8 ליטר)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 עם תאי מיצוי של 120 מ"ל (מכשיר PSE)</td> <td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר מאייד סיבובי</td><td>כל</td><td>צלוחיות</td><td></td></tr><tr><td>אידוי (גדלים: 100 מ"ל, 500 מ"ל, 1 ליטר, 2 ליטר)</td> <td>כל</td><td>בקבוקי</td><td></td></tr><tr><td>דוראן (גדלים: 1 ליטר, 10 ליטר)</td> <td>כל</td><td>n/ a</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות חרוטיות (גדלים 100 מ"ל, 2 ליטר)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מרית (גדלים שונים)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי (5 ספרות)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>איזון (2 דמויות)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>גלילי מדידה (10 מ"ל, 100 מ"ל, 1 ליטר)</td> <td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>-80 מקפיא</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר Biotage Isolera עם מתלה איסוף של 250 מ"ל ובקבוקים (מכשיר כרומטוגרפיה פלאש אוטומטי</td> משקפי בטיחות <td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td></td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מעיל מעבדה</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>חיטוי</td><td>כל</td><td>n/<a</td><td></td></tr> <tr><td>חזק>חומרים מתכלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצות מיקרופיפטה (גדלים: 1000 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L, 20 ומיקרו; L, 10 ומיקרו; L, ו-2 ומיקרו; L)</td> <td>כל</td><td>צינורות</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה (גודל: 2 מ"ל)</td> <td>כל</td><td>צינורות</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה (גדלים: 15 מ"ל, 50 מ"ל)</td> <td>כל</td><td>פיפטות</td><td></td></tr><tr><td>העברה חד פעמיות (גודל 2 מ"ל)</td> <td>כל</td><td>צלחות</td> פטרי (גודל: 100 מ"ל) כל n/a <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg; מחסניות פלאש SNAP KP-SIL 100 גרם</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני HPLC (1 מ"ל), תוספות בקבוקון וכובעים</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>כפפות ניטריל סגולות חד פעמיות</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עליון ל-E-914, תאית</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>מסנן תחתון ל-E-916 / 914, סיבי זכוכית</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td><חזק> ריאגנטים</חול קוורץ></td><td></td><td></td><td></td>חזק</tr><tr><td>, 0.3 - 0.9 מ"מ</td><td>בוצ'י</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>קליט 545 (אדמה דיאטומית)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל סיליקה 60 (0.040 -0.0063 מ"מ)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-חומצה אתנסולפונית</td><td>מלפורד</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>סימגה-אלריך</td><td>208337-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>סימגה-אלריך</td><td>60377-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>3' 5'-דימתוקסי-4'-אצטופנון (אצטוסירינגון)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>מלפורד</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB מרק מילר</td><td>סימגה-אלריך</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>סימגה-אלריך</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אלריך</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&reg; &nbsp; 900 הידרוקסיד (שרף חילופי יונים בסיסי)</td><td>סיגמא-אלריך</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן</td><td>פישר</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אצטט</td><td>פישר</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>פישר</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא-אלריץ'</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q מים</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>קומפוסט Levington F1</td><td>כל</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>קומפוסט Levington F2</td><td>כל</td><td>ערכת</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep (ערכת טיהור פלסמיד).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha מוכשר E. coli</td><td>ספק ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 וקטור</td><td>מעבדת לומונוף ג'ון אינס סנטר</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>תרמו-פישר</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>תרמו-פישר</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (פרוטוקול שיבוט רקומבינציה ספציפי לאתר)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II Enzyme Mix (פרוטוקול שיבוט רקומבינציה ספציפי לאתר)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100 מ"מ</td><td>תרמו-פישר</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III מערכת סינתזה ראשונה גדיל</td><td>פישר</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>טריטון</td><td>סיגמא-אלריך</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטיאנה Benthamiana זרעים</td><td>כל ספק מכובד</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

ארעי ביטוי טבק benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Triterpenes הם אחד מהגדולים רוב המשפחות מגוונות מבחינה מבנית של מוצרים טבעיים מהצומח. רבים נגזרים טריטרפן הוכחו בעלי פעילות ביולוגית רלוונטית מסיבות בריאותיות. עם זאת, עד כה פוטנציאל זה לא תורגמה שפע של סמים נגזר טריטרפן במרפאה. . זה ניתן לטעון (לפחות חלקית) תוצאה של גישה מוגבלת סינתטי מעשי ברמה זו של המתחם, בעיה אשר יכולים להחניק חקר מבנה-פעילות הגומלין ופיתוח של עופרת מועמדים על ידי מסורתי מרפא כימיה זרימות עבודה. למרות המגוון העצום שלהם, triterpenes כל נגזרים מתוך הקדמה ליניארי יחיד, 2, 3-oxidosqualene. ביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana ש להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים לא המיוצרים באופן טבעי על-ידי מחשב מארח זה. אגרו-חדירה הוא אמצעי יעיל ופשוט של השגת ביטוי benthamiana שארעית. התהליך כרוך חדירה של צמח עלים עם השעיה של Agrobacterium tumefaciens נושאת את construct(s) ביטוי של עניין. הסתננות שותף נוסף tumefaciens א זן נושאת לבנות ביטוי קידוד מגבירה את אנזים זה מגביר אספקת קודמן באופן משמעותי את התשואות. לאחר תקופה של חמישה ימים, החומר העלה הסתנן ניתן לקצור ולעבד לחלץ ולבודד את המוצר טריטרפן וכתוצאה מכך. זהו תהליך זה באופן ליניארי ובאמינות מדרגיים, פשוט על ידי הגדלת מספר צמחים המשמשים את הניסוי. בזאת הוא תיאר פרוטוקול לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה triterpenes ניצול פלטפורמה זו מבוססת על צמחים. הפרוטוקול מנצל מכשירים חדירה ואקום בקלות ניתן לשכפול, אשר מאפשר חדירה בו זמנית של עד ארבעה צמחים, ומאפשרת חדירה batch-wise של מאות צמחים בתקופה קצרה של זמן.

התשואות מבודד טיפוסי תלויות השילוב אנזים/אנזים תחת חקירה, את היציבות הכימית של המתחם היעד, איך מאתגר את תהליך החיטוי היה. בעבר דיווחנו התשואות מבודד של β-amyrin נגזרים מן הניסויים שלנו ביוסינטזה קומבינטורית ועד 0.12 מ ג 3.87 גרם של יבש benthamiana ש אבקה. תרכובות אלו נע באופן נרחב רמת חמצון, וכללה שילובים לא טבעי של אנזימים (איור 3)8. פרוטוקול זה משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לייצר עשרות או מאות מיליגרם של המוצר מטוהרים עבור אפיון מבניים NMR ספקטרוסקופיה ו מבחני פונקציונלי במורד הזרם. גם הראו את התועלת מפוח של פלטפורמה זו על-ידי הפקת 0.8 גר' טריטרפן לגרדום β-amyrin-טוהר של יותר מ-98%. ניסוי זה נעשה שימוש בצמחים 459, ומייצג של התשואה מבודד של 3.3 מ ג לגרם של יבש benthamiana ש העלה אבקת8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> איור 1: סיכום סכמטי. ייצוג סכמטי של תהליך ניצול הביטוי ארעית של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana ש עלה להטיית אנדוגני אספקה של 2, 3-oxidosqualene לכיוון לייצור מוצרים חדשים בעלי ערך גבוה טריטרפן מפוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> איור 2: ואקום המסתנן ובניה בתהליך.) העידו צמח בעל כנף אחד מנותק. b) Bespoke צמח בעל כנפיים המצורפת. c) היפוך, ועלייתו של צמחים. d) החדרת האמבט הסתננות. e) הסתננות אמבטיה במקום בתוך תא הסתננות. המסתנן ואקום f) ביצוע: משאבת ואקום (1) (2) התקשרות של משאבת ואקום כדי מאגר ואקום (3) ואקום מאגר בידוד שסתום (4) הקשר בין מאגר ואקום שסתום היניקה (7) (5) מד הלחץ (6) אוויר קאמרית הסתננות הסתננות קאמרית (8) ואקום המאגר. g) נציג עלים מצמח אחד שחדר עם לבנות ביטוי עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לאחר חמישה ימים שלאחר הסתננות צמיחה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> איור 3: בעבר דיווחו על תוצאות נציג לייצור מיכשור וציוד נגזרים β-amyrin באמצעות פרוטוקול זה8. טבלה זו הוא הורה על ידי תשואות מבודד. עמודות מעוצבים באופן מותנה עם צבע אינדיקציה הערך היחסי. אדום = גבוה, ירוק = נמוך (למרות ביניים צהוב). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

פרוטוקול זה מעניק גישה נוחה בקנה מידה הכנה לתרכובות טריטרפן לשימוש במחקרים במורד הזרם, כגון אפיון מבני או פקיעת פעילות ביולוגית רלוונטית מבחינה רפואית. הפרוטוקול מהיר, ניתן להרחבה, ומאפשר להשתמש בשילובים של אנזימים פשוט על ידי חדירה משותפת של זנים שונים של אגרובקטריום, מה שמבטל את הצורך בבניית וקטורים רב-גנים גדולים. כדי להתחיל, יש לחסן צלחת אגר LB סלקטיבית עם פסים של זני Agrobacterium tumefaciens הרצויים מתרביות מלאי גליצרול.דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 28 מעלות צלזיוס באינקובטור עומד. למחרת, יש לחסן בנפרד 50 מיליליטר של חומר LB סלקטיבי עם דגימה של כל זן Agrobacterium tumefaciens. דגרו את התרבית למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-200 סל"ד.העבירו בנפרד את תרביות ה-50 מיליליטר ל-1,000 מיליליטר של מדיה LB סלקטיבית, ודגרו למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס באינקובטור הרועד ב-200 סל"ד. למחרת, גלולה בנפרד את ה- Agrobacterium tumefaciens מהתרביות הנוזליות על ידי צנטריפוגה ב -4,000 פעמים גרם. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו בנפרד את הכדורים ב-50 מיליליטר של מאגר MMA טרי.דגרו את הכדורים התלויים בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה. כעת, קבע את הנפח המתאים של כל מתלה MMA של Agrobacterium tumefaciens כדי לייצר OD 600 סופי של לפחות 0.2 בנפח סופי כולל של 10 ליטר. שלב את הנפחים שנקבעו של כל מתלה.כעת, הוסף מאגר MMA נוסף למתלים המשולבים לנפח סופי של ליטר אחד, שישמש באופן מיידי לחדירת ואקום. העבירו את ליטר אחד של תרחיף הסתננות וליטר אחד של מאגר MMA בעוצמה פי 10 לאמבט ההסתננות, ואחריו שמונה ליטר מים נוספים. הסר את הכנפיים הניתנות להסרה של מחזיק הצמח המותאם אישית.הכנס ארבעה צמחים בני חמישה שבועות שגודלו כמתואר בפרוטוקול הטקסט, וחבר מחדש את הכנפיים. כיסוי ההסתננות נפגע אם העלים אינם שקועים במלואם בתרחיף הסתננות. בעיה זו ממוזערת על ידי הבטחה שמפלס המתלה יגיע למשטח העליון של מחזיק הצמח לפני טיפול בוואקום.הפוך את המחזיק, והנח אותו על גבי אמבט ההסתננות כדי להטביע את העלים בתרחיף ההסתננות. העבירו את אמבט ההסתננות עם צמחים שקועים לתא ההסתננות, וסגרו את הדלת. ודא ששסתום כניסת האוויר סגור על המסתנן.לאחר הפעלת משאבת הוואקום, פתח את שסתום כניסת הוואקום בתא ההסתננות. לאחר שהלחץ בתא ההסתננות ירד ב-880 מיליבר, סגור את שסתום כניסת הוואקום ופתח את שסתום כניסת האוויר. עם החזרה ללחץ האטמוספרי, פתח את הדלת והסר את אמבט ההסתננות.כעת, הרם את מחזיק הצמח עד שהצמחים כבר לא שקועים בתרחיף ההסתננות. לאחר מכן, נער בעדינות את המחזיק כדי לאפשר למתלה עודף לברוח מהעלים ולחזור לאמבט ההסתננות. לבסוף, החזר את המחזיק למצב זקוף, הסר את הכנפיים הניתנות להסרה והסר את הצמחים.גדלו את הצמחים שחדרו במשך חמישה ימים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ב-16 שעות אור ביום עם השקיה יומית. לאחר חמישה ימי צמיחה, קצרו את העלים ולאחר מכן יבשו אותם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. טוחנים את העלים היבשים לאבקה גסה בשיטה נוחה, כמו שימוש במעבד מזון ביתי או ריסוק ידני של העלים כשהם בתוך שקית.מערבבים את אבקת העלים עם חול קוורץ בכלי מתאים. זה משמש כחומר מפזר ומשפר את יעילות תהליך המיצוי. כעת, הכינו ארבעה תאי מיצוי למילוי על ידי היפוכם תחילה.לאחר מכן, הכנס את מסנן סיבי הזכוכית, ואחריו את פריט המתכת ותקע האחיזה. החזר את תאי החילוץ למצב זקוף, והוסף שכבה בעומק סנטימטר אחד של חול קוורץ. מלאו את תאי החילוץ באבקת העלים המוכנה עד לקו המילוי.במידת הצורך, דחסו בעדינות את האבקה במהלך תהליך זה כדי להקל על הוספת כמות גדולה יותר בכל תא מיצוי. כעת, הוסף שכבה קטנה של חול קוורץ לחלק העליון של האבקה הארוזה, והכנס את מסנן התאית העליון. הכנס את תאי החילוץ הארוזים למכשיר מיצוי הממס בלחץ, והפעל את השיטה הרצויה.לאחר השלמת השיטה, יש לרכז את ליקר המיצוי המשולב לייבוש באמצעות אידוי סיבובי בוואקום, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. בדוק את התפוקה הצפויה של תרחיץ ירוק כהה. כדי להסיר את הכלורופילים, באמצעות שרף חילופי יונים בסיסי, יש להמיס תחילה את התמצית הגולמית בנפח מינימלי של אתנול.הוסף 50 מיליליטר של חרוזי שרף בסיסיים להחלפת יונים לתמיסה המתקבלת. לאחר מכן, מערבבים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הוסף עוד 50 מיליליטר של חרוזי שרף בסיסיים להחלפת יונים כל 30 דקות עד שהתגובה הסתיימה.בהתחלה, חרוזי השרף הבסיסיים להחלפת יונים הם בצבע ורוד, והשלב הנוזלי הוא ירוק. ככל שהתגובה מתקדמת, חרוזי השרף משתנים לירוק והשלב הנוזלי לצבע כתום או חום עכור בהתאם לקנה המידה. סנן את תערובת התגובה דרך עמודה קצרה של אדמה דיאטומית באמצעות עמוד כרומטוגרפיה של הבזק זכוכית, באמצעות מפוח ידני להפעלת לחץ.שוטפים את חרוזי השרף שנאספו באתנול, ואחריהם אתנול אחד לאחד להקסאן, ולבסוף עם הקסאן. השתמש בנפח שטיפה מספיק כדי להשעות מחדש את החרוזים על גבי עמוד האדמה הדיאטומית. לבסוף, שלבו את המסנן, השטיפות והתרכיז לייבוש על ידי אידוי סיבובי בוואקום.מוצגת כאן תמונה של עלים של צמח אחד שחדרו עם מבנה ביטוי לחלבון הפלואורסצנטי GFP לאחר חמישה ימים לאחר גידול ההסתננות. זה ממחיש את היקף כיסוי ההסתננות שניתן לצפות. העלים מסודרים משמאל למעלה לימין התחתון של התמונה בסדר יורד, ביחס לגובהם המקורי על הצמח.תמונה זו מייצגת 0.8 גרם של בטא-אמירין המיוצר באמצעות פרוטוקול זה, שהוא יותר מ-98% טהור. הניסוי נערך בקנה מידה של 459 צמחים ומייצג יבול מבודד של 3.3 מיליגרם לגרם של חומר עלים יבש. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לזכור שרק עלים שהסתננו ייצרו את מתחם העניין שלך.לכן כדאי לקצור את העלים הללו באופן סלקטיבי במידת האפשר כדי למנוע דילול של הדגימה שלך ברקמה לא פרודוקטיבית. השלבים שלאחר הקטיף בפרוטוקול זה ניתנים למטרות המחשה. ניתן להחליף אותם בטכניקות טיהור אחרות של מיצוי מוצרים טבעיים בהתאם לזמינות המומחיות ו/או המתקנים במוסד שלך.מצאנו כי הטיפול הבסיסי בשרף חילופי יונים המוצג בפרוטוקול זה הוא אלטרנטיבה נוחה לסבוניפיקציה מסורתית יותר ואחריה חלוקה נוזלית/נוזלית להסרת כלורופיל בקנה מידה גדול יותר. לפני ביצוע פרוטוקול זה, עליך להכיר את נתוני בטיחות החומרים עבור כל החומרים המשמשים ולנקוט באמצעי זהירות מתאימים. יש לבדוק ולהקפיד על חקיקה מקומית הנוגעת לעבודה עם חומר טרנסגני, כולל ביצוע נהלי בלימה מתאימים.

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן...

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

אנו מתארים עיצוב של גישת ניסויים שיכולים לשמש כדי לקבוע ולעצב את ההשפעה של אלמנטי transgene רגולציה, פרמטרים גדילה והתפתחות צמח, ותנאי דגירה על הביטוי החולף של נוגדנים חד שבטיים וחלבונים כתב בצמחים.

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מועמד חיסון אוראלי נגד סוכרת מסוג 1 במפעל אכיל.

ארעי ביטוי סלק אדום של חיסון ביולוגיות המועמד לסוכרת מסוג 1

כאן אנו מציגים קל להשתמש בפרוטוקולים להפקת וטיהור diterpenoid מטבוליטים דרך הביטוי קומבינטורית של אנזימים ביולוגיים ב Es chia coli או טבק benthamiana, ואחריו מוצר כרומאטוגרפי טיהור. מטבוליטים המתקבלים מתאימים למחקרים שונים כולל אפיון מבנה מולקולרי, מחקרים פונקציונלים וביואקטיביים.

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של IgG אנושי רקומביננטי התמזגו GFP בניקוטיאנה benthamiana. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לטיהור והדמיה חזותית של חלבונים רבים המשתמשים כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, הפרוטוקול הוא הסתגלות למעבדת הוראה פנים אל פנים ווירטואלית במכללה, מתן מחקר מבוסס פרוייקט.

ייצור חלבוני פיוז'ן IgG המתבטאים באופן ארעי בניקוטיאנה

למדו שיטה מהירה לייצור טריטרפנים בקנה מידה מפוח בעזרת ביטוי ארעי ב-Nicotiana benthamiana. הפרוטוקול מאפשר שימוש בשילובי אנזימים שונים ללא צורך בבניית וקטורים מורכבים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

גלה סרטונים נוספים