Name: כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: חקור שיטות לכימות היפופיגמנטציה במבחנה באמצעות מדידת פעילות טירוזינאז, תוכן מלנין וצביעת תאים. השיטות מסייעות בפיתוח קוסמטיקה פונקציונלית ובחקר מנגנוני מלנוגנזה במהירות וביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קוריאה המכון של תכנון והערכה עבור טכנולוגיית מזון, חקלאות, יערנות (IPET) באמצעות תוכנית פיתוח טכנולוגיה Agri-Bioindustry, ממומן על ידי משרד החקלאות, המזון, לענייני כפרי (MAFRA ) (116159-02-2-WT011), בית הספר למדעי החיים וביוטכנולוגיה BK21 פלוס, אוניברסיטת קוריאה.

1. הכנת בינוני, תרכובות, ריאגנטים
<ol><li>להכין B16F10 מדיום מלאה של הגידול. תוספת של Dulbecco ששינה בינוני הנשר (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (המזיק).<ol>
<li>כדי להפוך את 500 מ"ל של מדיום מלאה, מערבבים 445 מ הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) 50 מ של FBS, 5 מ של המזיק בבקבוק זכוכית מעוקר 1 ליטר. לאחר ערבוב בעדינות, לסנן את המדיום דרך מסנן בקבוק-העליון 0.2-מיקרומטר בקבוק זכוכית מעוקר חדש, אז החנות ב 4 º C. התראה: לכל שיטות חקלאות התא צריך להתבצע ב- cabinet באמצעות הטכניקה aseptic כדי להבטיח עקרות מיקרוביולוגית בטיחות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת מאגר פירוק: 20 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane המכיל מאגר טריטון X-100 (וי/v) 0.1% ב- pH 7.5 (pH מותאם עם HCl). מאגר זה יכול לשמש במשך 3 חודשים כאשר בטמפרטורת החדר (RT). מוסיפים מעכבי פרוטאז למאגר פירוק לפני השימוש.</li>
	<li>להכין tyrosinase מעכב assay מאגר. להכין 1 מ ' נה2HPO4 (dibasic) פתרונות מניות של 1 מ ' NaH2PO4 (monobasic). מערבבים 46.3 מ ל נה2HPO4 ו- 53.7 מ ל2PO NaH4 להכין נפח סופי של 0.1 M סודיום פוספט מאגר (pH 6.8).<ol>
<li>לדלל התערובת המתקבלת 1 ליטר (נפח סופי) עם H2O. התאם את רמת החומציות של הפתרון הסופי את 6.8. מאגר זה יכול לשמש במשך חודש כאשר הוא מאוחסן ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין tyrosinase המצע פתרון: 0.1% 3,4-dihydroxy-L-פנילאלנין (DOPA, w/v) מומס tyrosinase מעכב assay מאגר (עיין שלב 1.3). התראה: לשמור על הקרח במהלך השימוש.</li>
	<li>לחלופין, להכין 100 tyrosinase פטריות U/mL. להמיס את tyrosinase פטריות lyophilized במאגר assay מעכבי tyrosinase. פתרון זה יכול לשמש למשך 2 חודשים כאשר הוא מאוחסן ב –20 ° C פעילות tyrosinase פטריות, כמו גם פעילות הסלולר tyrosinase מחושבים בנוכחות חומרים בתא. התראה: הפתרון הוא aliquoted לפני הקפאת ובכך חזר על הקפאה, מפשיר ניתן להימנע. שמור את הפתרון על קרח במהלך השימוש.</li>
	<li>להכין פתרון 1 N NaOH. שוקלת 4 g של NaOH בבקבוקון נפחי, להמיס במים מזוקקים לעשות 100 מ.</li>
	<li>להכין פתרון קיבעון (10% פורמלין). לדלל 27 מ"ל של 37% פורמלדהיד עם 73 מ ל מים מזוקקים. להכין טרי מדי יום.</li>
	<li>להכין את אמוני פתרון מלאי כסף. להכין 5 מ של 10% כסף חנקתי פתרון סטריליות. הוספת אמוניה מימית פתרון dropwise, עד התפרקה לחלוטין התמיסה. להוסיף 200 μL של כסף חנקתי פתרון (10%). הפתרון יהיה מעט עכורים. התראה: להימנע קשר אינהלציה. השתמש ברדס fume.</li>
	<li>להכין את אמוני הפתרון עובד כסף. למהול 2.5 מ של פתרון מלאי כסף אמוני עם 7.5 מ ל מים מזוקקים. שימוש פעם אחת ולאחר מכן למחוק. התראה: להימנע קשר אינהלציה. השתמש ברדס fume.</li>
	<li>הכנת 0.1% זהב כלורי. להכין 1 מ"ל של 10% זהב כלורי ולהוסיף 99 מ ל מים מזוקקים בבקבוקון הנפחי. להכין טרי מדי יום.</li>
	<li>להכין תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS). הוסף 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 g של Na-2-HPO-4 ו- g 0.242פו ח'4 ב- 800 מ ל מים מזוקקים. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl. Dilute התערובת המתקבלת 1 ליטר (נפח סופי) עם מים מזוקקים.</li>
	<li>להכין פתרון נתרן תיוסולפט 5% (w/v) מומס במים מזוקקים.</li>
</ol>2. התא תרבות וטיפול
<ol><li>להשתמש בתאים B16F10 זמינים מסחרית. לשמור על התאים B16F10 בינוני מלא. לשמור את הבקבוקון תרבות תא humidified, 5% CO2 אווירה חממה ב 37 º C.</li>
	<li>הכנת תרכובות בדיקה, בקרה חיובית מעכב ודוגמאות שליטה שלילי.<ol>
<li>להמיס מבחן תרכובות של ממיסים המתאים. להמיס חומרים מסיסים במים מים מזוקק פעמיים. להמיס חומרים לא מסיסים במים המתאים הממס האורגני, למשל., דימתיל סולפוקסיד.</li>
		<li>. הנה, תשתמש יערות מומס במים מזוקק פעמיים (125 μg/mL) כפקד חיובי כדי להעריך את הפעילות היפופיגמנטציה לעומת מבחן תרכובות או פקד שלילי. כפקד שלילי (בקרת רכב שטופל), השתמש פתרונות או מאגרים המשמשים את מבחן לדוגמה, למשל, מזוקק פעמיים מים, דימתיל סולפוקסיד, אתנול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תא זריעה וטיפול<ol>
<li>זרעי B16F10 התאים × 10 54 תאים/טוב ב- 24-ובכן תרבות צלחות באמצעות בינוני מלא, דגירה ב חממה2 CO במשך 24 שעות ביממה. לאחר דגירה, תשאף המדיום מלאה.</li>
		<li>דגירה תאים DMEM בינונית (ללא FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין) המכילה תרכובות מבחן, פקד מעכב או על פקד שלילי חממה2 CO עבור ה 72 סימון תאים בכל 24 שעות מתחת למיקרוסקופ. לאחר שלב זה, לעבור אל השלבים 3-5 לניסויים נוספים. התראה: התערובת של חומר המבחן, DMEM בינוני לסנן דרך מסנן 0.2 μm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מדידת הפעילות התאית Tyrosinase
<ol><li>באמצעות השיטה המתוארת בשלב 2, להסיר מדיה ולשטוף תאים פעמיים עם 300 μL ל- PBS קר.</li>
	<li>מניחים את הצלחת התרבות התא על קרח. הוסף μL 300 פירוק מאגר ' תקופת דגירה של 5 דקות. לאחר מכן לאסוף lysate להשתמש במגרדת התא התא, התא lysate להעביר צינור 1.5-mL microcentrifuge.</li>
	<li>Homogenize תא lysate עם מהמגן תא ב rpm 14,500 2 s, 3 פעמים על הקרח כדי לקבל tyrosinase תאיים. שימוש במצב האופטימלי ספציפי מהמגן.</li>
	<li>צנטריפוגה 10 דקות ב × 12,000 g ב 4 ° C, להעביר את התא supernatant צינור 1.5-mL microcentrifuge. לשמור על הקרח במהלך השימוש.</li>
	<li>העברת μL 70 של תגובת שיקוע microplate 96-ובכן ברור פוליסטירן.</li>
	<li>להוסיף μL 140 של פתרון המכיל tyrosinase המצע (DOPA) כדי microplate 96-ובכן ברור פוליסטירן לנער בעדינות, תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>אופציונלי, להוסיף 70 μL של פתרון פטריות tyrosinase U/mL 100 מכל קידוח, תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>למדוד את הפעילות tyrosinase באורך-גל של 475 nm באמצעות קורא microplate.</li>
	<li>לנרמל את הפעילות tyrosinase חלבון לריכוז כל דגימה. למדוד את ריכוז חלבון כל מדגם על ידי וזמינותו ברדפורד.</li>
</ol>4. מדידת מלנין תוכן
<ol><li>באמצעות השיטה המתוארת ב- ' שלב 2, להסיר מדיה ולשטוף תאים פעמיים עם 300 μL ל- PBS קר.</li>
	<li>מניחים את הצלחת התרבות התא על קרח. הוסף μL 300 פירוק מאגר ' תקופת דגירה של 5 דקות. לאחר מכן לאסוף lysate להשתמש במגרדת התא התא, התא lysate להעביר צינור 1.5-mL microcentrifuge.</li>
	<li>צנטריפוגה 10 דקות ב × 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע חדש צינור ולמדוד חלבון הכולל ריכוז של נורמליזציה. למדוד את ריכוז חלבון כל מדגם על ידי וזמינותו ברדפורד.</li>
	<li>להוסיף 300 μL של 1 N NaOH כל גלולה, דגירה ב 60 מעלות צלזיוס לשעה.</li>
	<li>Centrifuge הפתרון מומסים עבור 10 דקות ב × 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העברת μL 200 של תגובת שיקוע microplate 96-ובכן.</li>
	<li>למדוד את התוכן מלנין באורך-גל של 400 nm.</li>
	<li>לנרמל את התוכן מלנין לריכוז החלבון.</li>
</ol>5. פונטנה – מאסון מכתים
<ol><li>פונטנה – מאסון מכתים<ol>
<li>רחץ תאים פעמיים עם 300 μL ל- PBS קר.</li>
		<li>להוסיף 200 μL של פורמלין 10% מכל קידוח, תקופת דגירה של h 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לשטוף עם מים מזוקקים.</li>
		<li>להוסיף 200 μL ומחוממת מראש כסף אמוני עובד פתרון, תקופת דגירה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס, או עד התאים להיות בצבע צהוב/חום. התראה: למקם טריים הפתרון עובד אמוני כסף באמבט מים 58-60 מעלות צלזיוס, מאפשרים זמן לטמפרטורה equilibrate נאותה.</li>
		<li>להסיר את אמוני כסף עובד פתרון ולשטוף עם מים מזוקקים.</li>
		<li>הסר מים מזוקקים. להוסיף 200 μL של 0.1% זהב כלורי, דגירה למשך 2 דקות ב- RT.</li>
		<li>הסרת פתרון כלוריד זהב 0.1% ולשטוף עם מים מזוקקים.</li>
		<li>הסר מים מזוקקים. להוסיף 200 μL של נתרן תיוסולפט פתרון (5%, w/v), דגירה למשך 2 דקות.</li>
		<li>הסרת פתרון נתרן תיוסולפט ולשטוף עם מים מזוקקים.</li>
		<li>הסר מים מזוקקים. להוסיף 200 μL של הגרעין האדום מהר, תקופת דגירה של 5 דקות.</li>
		<li>להסיר את הגרעין האדום מהר ולשטוף עם מים מהברז.</li>
		<li>להסיר את מי הברז ולבחון את התאים מוכתם תחת מיקרוסקופ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>פונטנה – מאסון מכתים (סף ניתוח באמצעות ImageJ) הערה: דוגמה של ההליך ניתוח תמונה באמצעות תוכנה ImageJ מוצג החומרים משלימה.<ol>
<li>פתח את התוכנית ImageJ.</li>
		<li>בחר קובץ | פתוח | תמונת מיקרוסקופ.</li>
		<li>בחר את התמונה | התאם | צבע הסף.
</li>
		<li>כדי למדוד את השטח מוכתם פונטנה – מאסון, מוגדר הבר פרמטר הבהירות אפס ולהתאים הבר בהירות כדי לאתר את הנקודה שבה כלולים כל התאים ויטראז'ים (שחור או חום).</li>
		<li>בחר לנתח | לנתח חלקיקים. סמן את התיבה סכם בחלון חלקיקים נתח ' ולחץ על ' אישור'. להשיג את התוצאה סיכום ולהדביק לתוך גיליון אלקטרוני. הערה: התיאור של הפרמטרים תיבת וכתוצאה מכך הן כדלקמן: פרוסת: השם של כל תמונה ספירה: מספר התאים מוכתם שטח: שטח כולל של התאים שנספרו גודל ממוצע: סה כ שטח/ספירה אזור %: מוכתם לאזור/סה כ שטח × 100%; השטח הכולל מחושב באופן אוטומטי.</li>
		<li>לחשב היחסית באזור מוכתם מלנין באמצעות הערך של שטח כולל. מלנין היחסי צבעונית אזור (%) = ערך של שטח הסלולר בדיקת הדגימה/ממוצע בשטח כולל של שליטה × 100, קרי,
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+controlling+the+migration+of+melanocytes+and+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).</li>
<li>Brenner, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+melanin+against+UV+damage+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The protective role of melanin against UV damage in human skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).</li>
<li>Galvan, I., Solano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanin+chemistry+and+the+ecology+of+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">Melanin chemistry and the ecology of stress.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).</li>
<li>Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+whitening+cosmetics%3A+Feedback+and+challenges+in+the+development+of+natural+skin+lighteners%5BTitle%5D)+AND+%22Cosmetics%22%5BJournal%5D)">Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners.</a> Cosmetics. 3 (4), 36(2016).</li>
<li>Cooksey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+indirect+formation+of+the+catecholic+intermediate+substrate+responsible+for+the+autoactivation+kinetics+of+tyrosinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).</li>
<li>Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+inhibitors+of+melanin+biosynthesis+via+the+quality+control+of+tyrosinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).</li>
<li>Gillbro, J. M., Olsson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanogenesis+and+mechanisms+of+skin-lightening+agents+-+existing+and+new+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cosmetic+Science%22%5BJournal%5D)">The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents - existing and new approaches.</a> International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).</li>
<li>Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+in+the+study+of+human+skin+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes.</a> Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Momilactione+B+inhibits+protein+kinase+A+signaling+and+reduces+tyrosinase-related+proteins+1+and+2+expression+in+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes.</a> Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+inhibitions+of+lemon+balm+%28Melissa+officinalis%29+ethanolic+extract+on+melanogenesis+in+B16-F1+murine+melanocytes%3A+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+its+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression.</a> Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p-Coumaric+acid+inhibition+of+CREB+phosphorylation+reduces+cellular+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis.</a> European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).</li>
<li>Jun, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+inhibition+of+%CE%B3-oryzanol+on+cellular+melanogenesis%3A+inhibition+of+tyrosinase+activity+and+reduction+of+melanogenic+gene+expression+by+a+protein+kinase+a-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism.</a> Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).</li>
<li>Choi, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+isoflavone+puerarin+and+its+glycosides+on+melanogenesis+in+B16+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes.</a> European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).</li>
<li>Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+reduces+cellular+melanin+content+via+suppression+of+microphthalmia-associated+transcription+factor+in+B16-F1+murine+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes.</a> Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).</li>
<li>Overwijk, W. W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B16+as+a+mouse+model+for+human+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B16 as a mouse model for human melanoma.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER 20, Unit 20.1 (2001).</li>
<li>Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+protocol+for+assessing+regulators+of+pigmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation.</a> Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).</li>
<li>D'Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+melanogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in melanogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144(2016).</li>
<li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage%3A+interactions+between+KIT+and+MITF%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).</li>
<li>Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-MSH+and+melanogenesis+in+normal+human+adult+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).</li>
<li>Hu, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+evaluation+of+melanin+content+and+production+of+pigment+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro.</a> Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).</li>
<li>Carriel, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+histochemical+method+for+a+simultaneous+staining+of+melanin+and+collagen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים לדווח.

הצגנו פרוטוקולים להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של תרכובות בדיקת שימוש בתרבית מלנוציטים. התוצאות נציג הראו את השפעת היפופיגמנטציה יערות, מעכב tyrosinase זה עכבות פעילות tyrosinase ותוכן מלנין הסלולר. שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר פעילות אנטי-melanogenic. באמצעות מבחני האלה, גם בהצלחה זיהינו מספר תרכובות ביו כי בעבר melanogenesis מעכבות ההשפעות על תאים B16F10 עשור9,10,11,12, <sup c...

מלנין תפקיד קריטי, פיזיולוגיה, פתולוגיה, טוקסיקולוגיה של מספר איברים לרבות עור, עיניים, המוח1. התפקידים העיקריים של מלנין תופעות צילום-הקרנה וביוכימי. המלנין סופג אור אינפרא אדום ונראה לעין, כמו גם קרינת אולטרה סגול (UV), עם קליטה מוגברת ממחירים באורכי גל קצרים יותר של אור; לפיכך, מלנין מגן על רקמות מן הנזק שנגרם על ידי האור הנראה או קרינת UV2. מלנין הוא נוגד חמצון, יש זיקה מתכות וכימיקלים רעילים אחרים; לכן, זה באפשרותך להגן על רקמות סטרס חמצוני וכימיים3. עם זאת, ייצור יתר של המלנין גורם בעיות עור.
ובאיכות של מלנין בעור, איריס הן גורמים החשובים ביותר של הצבע של איריס, העור. אנשים אולי יש העדפות צבע עור שונים; כמה טובה לעור שזוף, בעוד אחרים לטובת עור בצבעים בהירים יותר. בהתאם פרופילים אלה הצרכן, מוצרי קוסמטיקה היפופיגמנטציה פותחו כדי לספק שווקים נפרדים עבור העור המועדף צבעים4. בהתאם לכך, מחקרים של היפופיגמנטציה ופעילות אנטי-melanogenic חשובים הן מבחינה מדעית והן מבחינה מעשית.
Melanogenesis הוא תהליך מורכב של מלנין ביוסינטזה דרך סדרה של תגובות כימיות אנזימטי ספונטנית של מלנוציטים. מלנוציט אחד מוקף כ 36 keratinocytes, melanocytes הם המפעלים סינתזת המלנין להפיץ את המוצר שלהם כדי keratinocytes שכנות. העור, המלנין מיוצר ומאוחסן בתא melanosomal של מלנוציטים מועבר keratinocytes שכנות בתוך האפידרמיס ויה דנדריטים.
L-טירוזין משמשת מצע ראשוני עבור melanogenesis ו- tyrosinase את האנזים מזרז שתי תגובות רצופות להמיר L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. תגובות אלו הן הצעד הגבלת קצב ב-5,melanogenesis6. בהתאם לכך, פעילות היפופיגמנטציה קודם נמדד על ידי הערכת הפעילות התאית tyrosinase ישירות. כדי לעשות זאת, תמציות מלנוציט המכיל tyrosinase מודגרת עם DOPA ולא dopaquinone המיוצר הדגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר-475 ננומטר. הערכים הם מנורמל על ידי ריכוז חלבון של דגימות, וכן חומרים מהתוצאה פעילות היפופיגמנטציה תפקידים במערך dopaquinone פחות בהשוואה עם פקדים.
שנית, ניתן לכמת פעילות היפופיגמנטציה על ידי מדידת מלנין בעור מלנוציטים בתרבית ישירות. לאחר מטפלים תאים עם החומר במבחן, מלנין מופק בתנאים אלקליין, התוכן מלנין הוא לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר 400 nm. סוכן היפופיגמנטציה תגרום תוכן מלנין נמוכה יותר מאשר הפקדים7.
לבסוף, ניתן לכמת את הפעילות היפופיגמנטציה על ידי פונטנה-מאסון מלנין מכתים וניתוח תמונות עוקבות. פונטנה-מאסון מכתים, גרגרי המלנין להפחית חנקת אמוניה-הכסף למצב מתכתי שחור גלויה, שחור באזורים של תאים בתמונות מיקרוסקופיים מייצגים את כמות המלנין.
סוכן היפופיגמנטציה בדרך כלל נותן תוצאות דומות בקנה אחד עם שלוש שיטות אלה, שמאשר כי הפעילות של החומר הוא חוקי. לחלופין, זה עשוי להיות שימושי למדוד את הביטוי של גנים מרכזיים, חלבונים ב- melanogenesis בתגובה חומר המבחן לבחון פעילות היפופיגמנטציה. בנוסף tyrosinase, חלבונים הקשורים tyrosinase (TRP-1) dopachrome tautomerase (TRP-2) הם קריטיים לאנזימים melanogenesis8. גורם שעתוק microphthalmia-הקשורים פקטור שעתוק (MITF) הוא הרגולטור הראשי melanogenesis, כימות של רמות ביטוי גנים/חלבון שלה או assay פעילות יזם יכול לשמש גם כדי להעריך את פעילות היפופיגמנטציה.

<table><tbody><tr><td>3,4-דיהידרוקסי-ל-פנילאלנין</td><td>סיגמא</td><td>D9628</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמוניום הידרוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>#320145</td><td></td></tr><tr><td>ארבוטין</td><td>פלוקה</td> <td>#10960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין</td><td>כימיקלים טהורים</td> <td>#16223</td><td>37%</td></tr><tr><td>זהב כלוריד</td><td>אמריקן מאסטרטק</td><td>AHG0226</td><td>0.10%</td></tr> <tr><td>HCl</td><td>Samchun כימיקל</td><td>H0255</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ביו בסיסי קנדה בע"מ</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>#60218</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>#3817-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>#81</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>גרעיני מהיר</td><td>אדום Merck</td><td>100121</td><td>אדום מהיר גרעיני 0.1% ב-5% אלומיניום סולפט.</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>כסף חנקתי</td><td>Duksan Pure Chemicals #</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)</td> <td>J.T. Baker</td><td>#3817-01</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט פנטהידראט</td><td>דוקסן כימיקלים טהורים</td><td>#2163</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Bio Basic Canada</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Union Carbide</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>טירוזינאז מפטרייה</td><td>Sigma</td><td>T3824</td><td>25 KU</td></tr></tbody></table>

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

מחקר זה מציג שיטות מעבדה כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה. מלנין, הפיגמנט העיקרי של מלנוציטים, הוא מסונתז בתגובה מספר גורמים הסלולר וסביבתיים. המלנין מגן על תאי העור מפני נזק אולטרה, אך יש גם פונקציות biophysical הביוכימי. ייצור יתר או הצטברות של מלנין בעור מלנוציטים עלול לגרום לבעיות עור, כגון, כתמים כהים, melasma, שומות ונמשים. לכן, השליטה של melanogenesis עם סוכנים היפופיגמנטציה חשוב אצל אנשים בעלי צרכים רפואיים או קוסמטיים. מלנין הוא מסונתז בעיקר melanosomes של מלנוציטים תהליך ביוכימי מורכב שנקרא melanogenesis, אשר מושפע חיצוני, פנימי גורמים, כגון הורמונים, דלקות, גיל חשיפה אור אולטרה סגול. אנו מתארים שלוש שיטות כדי לקבוע את הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים או חומרים טבעיים בתוך המלנוציטים: מדידה של פעילות הסלולר 1) tyrosinase ו 2) מלנין תוכן, ו 3) צביעת וכימות מלנין הסלולר עם תמונה ניתוח.
ב- melanogenesis, tyrosinase מזרז את הצעד הגבלת קצב הממירה L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (בסדר גמור) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. לכן, עיכוב של tyrosinase הוא מנגנון היפופיגמנטציה תפקידים ראשיים. ב מלנוציטים תרבותי, ניתן לכמת פעילות tyrosinase על-ידי הוספת בסדר גמור כמו מצע ומדידת dopaquinone הייצור על ידי ספקטרופוטומטר. Melanogenesis גם נמדד על ידי לכימות התוכן מלנין. השבר תאי המלנין המכילים מופק עם NaOH, מלנין הוא לכמת spectrophotometrically. לבסוף, ניתן לכמת את התוכן מלנין מאת ניתוח תמונות בעקבות פונטנה-מאסון מכתים של מלנין. למרות התוצאות של מבחני במבחנה אלה לא תמיד לשכפל בעור האדם, שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר melanogenesis, במיוחד כשלב ראשוני לזיהוי פעילות היפופיגמנטציה פוטנציאליים. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך את פעילות מלנוציט צמיחה, בידול. תוצאות עקביות עם שלוש שיטות שונות לוודא את החוקיות של האפקטים.

נציג תוצאות הפעילות היפופיגמנטציה של יערות, anti-melanogenic במתחם, ב- B16F10 מלנוציטים מוצגים להלן. איור 1A מציג שאת יערות באופן משמעותי לדכא את הפעילות התאית tyrosinase לעומת הפקד שטופלו הרכב. באופן דומה, התוכן המלנין בתאי מגורה עם יערות פחתו משמעותית בהשוואה עם הפקדים (איור 1B). תמונות מיקרוסקופי של תאים צבעונית עם הכתם פונטנה-מאסון מוצגים באיור 1C. טיפול יערות ירד באזור של פיגמנט שחור לעומת הפקד....

אנו מתארים שלוש שיטות להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים במבחנה: כימות של פעילות tyrosinase 1) סלולר ותוכן 2) מלנין, או 3) מידה של מלנין מאת צביעת תאי המלנין וניתוח התמונה.

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

שיטה זו עשויה להיות מועילה בפיתוח של קוסמטיקה פונקציונלית סוכן העור עם פעילויות אנטי מלנוגנית. זה שם כדי לבצע את התוצאה ניתן להשיג במהירות. בנוסף, שיטה זו עשויה להיות שימושית עבור חוקרים, שרוצים לזהות או לחקור את ההשפעות או את התרכובות או לחקור את הפעילות antimelanogenic או promelanogenic.כדי למדוד את פעילות טירוזינאז להתחיל על ידי זריעת B16-F10 מלניקים בחמש פעמים 10 לתאים הרביעי ל הבאר של ריכוז צלחת 24 גם במדיום מלא במשך 24 שעות באינקובטור תרבות התא. למחרת, להחליף את supernatant בכל באר עם DMEM בתוספת תרכובת בדיקה מוכנה טרי שליטה מעכב או שליטה שלילית ולהחזיר את הצלחת לחממה עוד 72 שעות. בסוף הטיפול שוטפים את בארות פעמיים עם 300 microliters של pbs קר לגם ולה מניחים את הצלחת על קרח.הבא להוסיף 300 microliters של מאגר תזה לכל באר באמצעות מגרד תאים כדי לאסוף את התא lysates לאחר חמש דקות. העבר את המתלים חלקיק התא וכתוצאה מכך בודדים 1.5 צינורות מיקרו צנטריפוגה מיליליטר. ולהומוגניזציה lysates שלוש פעמים במשך שתי שניות ב 14, 500 סל"ד על קרח כדי לשחרר את טירוזינאז intercellular.גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות צנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר על קרח. להקצות 70 microliters של כל על טבעי בארות בודדות של ברור 96 צלחת מיקרו פוליסטירן היטב ולהוסיף 140 microliters של פתרון מצע טירוזינאז לכל באר של על טבעי. מנענעים את הצלחת בעדינות כדי לערבב את תכולת הבאר.ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. ולמדוד לפעילות טירוזינאז ב 475 ננומטר על קורא מיקרופלסטיק. כדי למדוד את תוכן המלנין של התאים לאחר איסוף lysate של התאים המטופלים כפי שהוכח.לאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות חדשים. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד לכל גלולה למשך שעה אחת של דגירה ב-60 מעלות צלזיוס. ואחריו צנטריפוגה של השעיות התא מומס.ואז להעביר 200 microliters של supernatants לכל באר של צלחת 96 היטב. ולמדוד את תכולת המלנין על קורא מיקרופלסטיק באורך גל של 400 ננומטר. עבור פונטנה-מאסון כתמים, לשטוף את התאים שטופלו פעמיים עם 300 microliters של pbs קר לתקן את התאים עם 200 microliters של 10% פורמלין במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.שוטפים את התאים העבים במים מזוקקים ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של 58 עד 68 מעלות צלזיוס אמוניקלי כסף פתרון עבודה לכל באר. במשך שעה אחת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס או עד התאים הופכים צהוב חום בצבע. שוטפים את התאים המוכתמים במים מזוקקים ואחריהם דגירה של שתי דקות בכלוריד זהב 0.1% בטמפרטורת החדר.לשטוף את התאים המטופלים כלוריד זהב עם מים מזוקקים ולהוסיף 200 microliters של פתרון thiosulfate נתרן לתאים. לאחר שתי דקות לשטוף את התאים שוב. ולתייג את התאים עם 200 מיקרוליטרים של אדום גרעיני מהיר לכל באר במשך חמש דקות.לאחר מכן לשטוף את התאים מוכתמים עם מי ברז לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ אור. לניתוח סף, פתחו את התמונות בתמונה J ובחרו תמונה, התאמה ותסף צבע. כדי למדוד את האזור המוכתם בפונטנה מאסון, הגדר את סרגל הפרמטרים של הבהירות לאפס והתאם את הבהירות לנקודה שבה נכללים כל התאים המוכתמים בשחור או חום.בחר נתח ונתח חלקיקים וסמן את התיבה מסכם בחלון נתח חלקיקים ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לקבל סיכום של התוצאות ולהעתיק ולהדביק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני. טיפול Arbutin מדכא באופן משמעותי פעילות טירוזינאז הסלולר לעומת תאים מטופלים ברכב בקרה. באופן דומה התוכן מלנין של תאים מגורה עם Arbutin מצטמצם באופן משמעותי בהשוואה לפקדים.למרות התאים דומים מורפולוגית בין קבוצות טיפול, Arbutin מקטין את האזור של פיגמנט שחור לעומת התאים המטופלים שליטה. שיטה זו שימושית להקרנת פעילויות באמצעות הספרייה המורכבת שלנו. יש יותר ממאות דגימות להיבדק במהירות.יתר על כן שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את המנגנון מעורבים מלנוגנזה. לאחר שזוהו תרכובות המועמדים הביו-אקטיביים, בעדותם לחקר מנגנונים ביולוגיים או יישומים מסחריים.

quantification-of-hypopigmentation-activity-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

השיטה מתוארת למדוד סמנים ביוכימיים של הילוד היפוקסיה, איסכמיה. הגישה מנצל גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ (HPLC) וגז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה (GC / MS).

מדידה ביוכימית של היפוקסיה ילודים

טיפול פוטודינמי (PDT) הוא שיטה לא פולשנית ולא ניתוחית לטיפול בסרטן ריאות. פוטוסנסיטיזרים מצטברים באופן סלקטיבי ברקמת הגידול ומובילים למוות תאי הגידול בנוכחות חמצן ואורך גל תקין של אור. בסרטון פרוטוקול זה, שיטה מבוססת PDT משמשת להערכת הפוטנציאל הפוטוטוקסי של פוטוסנסיטיזר פוטנציאלי בתאי סרטן ריאות.

בדיקת פוטוטוקסיות חוץ גופית: שיטה מבוססת PDT להערכת הפוטנציאל הפוטוטוקסי של פוטוסנסיטיזר בתאי סרטן ריאות

סרטון וידאו זה מתאר שיטה למדידת רגישות לקרינת UV במודל עכבר אנושי – מודל עכבר המחקה עור אנושי. אנו קובעים את המינון המינימלי של קרינת UV (MED) שעלולה לגרום לאריתמה או בצקת על העור. השיטה יכולה לעזור לגלות את היעילות של תרופות המשמשות להפחתת רגישות UV.

בדיקת מינון אריתמטי מינימלי: שיטה למדידת רגישות UV במודלים עכבריים

המלנין עוריות הוא מושרה על ידי יישום מקומי של forskolin במודל עכברי של אדם UV רגיש בהיר עור. מניפולציה תרופתי של רמות cAMP בעור ואפידרמיס המחשיכים מאוד להגן מפני דלקות בתיווך UV (כוויות שמש), כפי שנמדד על ידי מינון erythematous מינימום assay (MED).

אינדוקציה תרופתי של עוריות מלנין והגנה מפני כוויות שמש בדגם מואנש מאוס

נייר זה מדווח כי התוספת של Y-27632 כדי בינונית הגוף יכול להגדיל באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים.

Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים

פרוטוקול זה מציג סדרה של ניסויים שאומצו להערכת פפטידים אנטי-סרטניים הניתנים להחלפה, שניתן להשתמש בהם בסינון פרה-קליני של תרכובות כאלה. זה כולל הערכת ציטוטוקסיות בתרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות, הערכת יעילות פוטואיזומריזציה של רקמת מודל (ex vivo) ויעילות in vivo .

הערכה חוץ גופית ו-in vivo של תרכובות פעילות ביולוגיות מבוקרות - תרופות מועמדות פוטנציאליות לפוטופרמקולוגיה של סרטן

פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.

מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

מחלות עיניים ניווניות המשפיעות על שכבת אפיתל פיגמנט הרשתית של העין יש מקורות מונוגניים ופוליגניים. מספר מודלים של מחלות ויישום תוכנה, LipidUNet, פותחו כדי לחקור מנגנונים של מחלות, כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

שיטה מבוססת ליפידים-למידת מכונה לאפיון וכימות משקעי שומנים באמצעות אפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

חקור שיטות לכימות היפופיגמנטציה במבחנה באמצעות מדידת פעילות טירוזינאז, תוכן מלנין וצביעת תאים. השיטות מסייעות בפיתוח קוסמטיקה פונקציונלית ובחקר מנגנוני מלנוגנזה במהירות וביעילות.

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

גלה סרטונים נוספים