כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

אנו מתארים שלוש שיטות להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים במבחנה: כימות של פעילות tyrosinase 1) סלולר ותוכן 2) מלנין, או 3) מידה של מלנין מאת צביעת תאי המלנין וניתוח התמונה.

שיטה זו עשויה להיות מועילה בפיתוח של קוסמטיקה פונקציונלית סוכן העור עם פעילויות אנטי מלנוגנית. זה שם כדי לבצע את התוצאה ניתן להשיג במהירות. בנוסף, שיטה זו עשויה להיות שימושית עבור חוקרים, שרוצים לזהות או לחקור את ההשפעות או את התרכובות או לחקור את הפעילות antimelanogenic או promelanogenic.

כדי למדוד את פעילות טירוזינאז להתחיל על ידי זריעת B16-F10 מלניקים בחמש פעמים 10 לתאים הרביעי ל הבאר של ריכוז צלחת 24 גם במדיום מלא במשך 24 שעות באינקובטור תרבות התא. למחרת, להחליף את supernatant בכל באר עם DMEM בתוספת תרכובת בדיקה מוכנה טרי שליטה מעכב או שליטה שלילית ולהחזיר את הצלחת לחממה עוד 72 שעות. בסוף הטיפול שוטפים את בארות פעמיים עם 300 microliters של pbs קר לגם ולה מניחים את הצלחת על קרח.

הבא להוסיף 300 microliters של מאגר תזה לכל באר באמצעות מגרד תאים כדי לאסוף את התא lysates לאחר חמש דקות. העבר את המתלים חלקיק התא וכתוצאה מכך בודדים 1.5 צינורות מיקרו צנטריפוגה מיליליטר. ולהומוגניזציה lysates שלוש פעמים במשך שתי שניות ב 14, 500 סל"ד על קרח כדי לשחרר את טירוזינאז intercellular.

גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות צנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר על קרח. להקצות 70 microliters של כל על טבעי בארות בודדות של ברור 96 צלחת מיקרו פוליסטירן היטב ולהוסיף 140 microliters של פתרון מצע טירוזינאז לכל באר של על טבעי. מנענעים את הצלחת בעדינות כדי לערבב את תכולת הבאר.

ואז לה הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. ולמדוד לפעילות טירוזינאז ב 475 ננומטר על קורא מיקרופלסטיק. כדי למדוד את תוכן המלנין של התאים לאחר איסוף lysate של התאים המטופלים כפי שהוכח.

לאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות חדשים. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד לכל גלולה למשך שעה אחת של דגירה ב-60 מעלות צלזיוס. ואחריו צנטריפוגה של השעיות התא מומס.

ואז להעביר 200 microliters של supernatants לכל באר של צלחת 96 היטב. ולמדוד את תכולת המלנין על קורא מיקרופלסטיק באורך גל של 400 ננומטר. עבור פונטנה-מאסון כתמים, לשטוף את התאים שטופלו פעמיים עם 300 microliters של pbs קר לתקן את התאים עם 200 microliters של 10% פורמלין במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.

שוטפים את התאים העבים במים מזוקקים ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של 58 עד 68 מעלות צלזיוס אמוניקלי כסף פתרון עבודה לכל באר. במשך שעה אחת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס או עד התאים הופכים צהוב חום בצבע. שוטפים את התאים המוכתמים במים מזוקקים ואחריהם דגירה של שתי דקות בכלוריד זהב 0.1% בטמפרטורת החדר.

לשטוף את התאים המטופלים כלוריד זהב עם מים מזוקקים ולהוסיף 200 microliters של פתרון thiosulfate נתרן לתאים. לאחר שתי דקות לשטוף את התאים שוב. ולתייג את התאים עם 200 מיקרוליטרים של אדום גרעיני מהיר לכל באר במשך חמש דקות.

לאחר מכן לשטוף את התאים מוכתמים עם מי ברז לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ אור. לניתוח סף, פתחו את התמונות בתמונה J ובחרו תמונה, התאמה ותסף צבע. כדי למדוד את האזור המוכתם בפונטנה מאסון, הגדר את סרגל הפרמטרים של הבהירות לאפס והתאם את הבהירות לנקודה שבה נכללים כל התאים המוכתמים בשחור או חום.

בחר נתח ונתח חלקיקים וסמן את התיבה מסכם בחלון נתח חלקיקים ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לקבל סיכום של התוצאות ולהעתיק ולהדביק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני. טיפול Arbutin מדכא באופן משמעותי פעילות טירוזינאז הסלולר לעומת תאים מטופלים ברכב בקרה. באופן דומה התוכן מלנין של תאים מגורה עם Arbutin מצטמצם באופן משמעותי בהשוואה לפקדים.

למרות התאים דומים מורפולוגית בין קבוצות טיפול, Arbutin מקטין את האזור של פיגמנט שחור לעומת התאים המטופלים שליטה. שיטה זו שימושית להקרנת פעילויות באמצעות הספרייה המורכבת שלנו. יש יותר ממאות דגימות להיבדק במהירות.

יתר על כן שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את המנגנון מעורבים מלנוגנזה. לאחר שזוהו תרכובות המועמדים הביו-אקטיביים, בעדותם לחקר מנגנונים ביולוגיים או יישומים מסחריים.