Name: נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: חקור את תפקידם של נויטרופילים בצפיפות נמוכה בתפיסת תאי גידול באמצעות מלכודות חוץ-תאיות. שיטה זו מאפשרת הדמיה של אינטראקציות דביקות בין תאי גידול ל-NETs שלמים ומסייעת להבנת מטסטזיס סרטני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים גברת ג'יי שינוהרה, אני Nieda על עבודה טכנית, קלריקלי. כמו כן, אנו מודים ד"ר שירו מאצומוטו, Hidenori Haruta, Kurashina קנטארו ו Kazuya טקהאשי על שיתוף הפעולה שלהם עבור רכישת המדגם בחדר ניתוח. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הסיוע למחקר מדעי של משרד החינוך, המדע, הספורט, ואת התרבות של יפן והחברה יפן הקידום של המדע (17K 10606).

-כעבור שנה-התקבלו מחולים שהשתתפו במחקר זה ואושרו על-ידי מוסדיים סקירה לוח של jichi ב רפואה באוניברסיטה.
1. בידוד של-כעבור שנה-של חלל הבטן Lavages וזיהוי נטו
<ol><li>רכישת המדגם<ol>
<li>להשרות 1000 מ"ל של תמיסת סטרילית ישירות לתוך חלל הבטן לפני סגירת הפצע בחולים שעברו ניתוח בטן בשל ממאירות במערכת העיכול. הערה: דגימות התקבלו מהמטופלים שעברו ניתוח קיבה, קיצור קיבה, או esophagectomy ללא הטיה על בסיס גיל או מין. תמיסת מלח היה הועבר לתוך מיכל והוא נשפך לתוך הבטן כל. דקה אחת. זה מתבצע באופן שגרתי כמו שטיפת הצפק לאחר הניתוח ללא השפעות משמעותיות על חולים.</li>
		<li>שטיפת חלל הבטן בהרחבה לפחות 1 דקות. הערה: מומלץ כי הנוזל מוחדר אט-אט מנוער בידיים של המנתח כך הדגימות אחיד.</li>
		<li>לשחזר 200 מ של נוזל שטיפה עם 4 מזרקים 50 מ. הערה: לפעמים גומי מחבר משמש כדי לקחת את הנוזלים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע טיהור של הצפק-כעבור שנה-באמצעות גרנולוציט mAb ספציפי, CD66b16. הערה: כיוון שכבת ביניים לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות מכיל תאי תאי רבים, הבחירה חיובית של נויטרופילים פולימורף באמצעות CD66b mAb בוצעה.<ol>
<li>העברת נוזל שטיפת הצפק שפופרת 50 מ. הערה: בשלב זה, את הנוזלים עוברים דרך מסנן ניילון 100 מיקרומטר להסיר זיהומים.</li>
		<li>Centrifuge את הנוזל הצפק ב g x 270 במשך 7 דקות ב- RT.</li>
		<li>Resuspend כדורי ב 5 מ של PBS עם EDTA 0.02%.</li>
		<li>בזהירות כיסוי mL 5 תא השעיה על פתרון הדרגתי של צפיפות 3 מ.</li>
		<li>צנטריפוגה ב g x 1,700 למשך 15 דקות ב RT ללא כל מעברי.</li>
		<li>הקציר mL ~ 2-3 של פתרון המכיל שכבות ביניים (איור 1 א') באמצעות פיפטה ומערבבים אותו עם 10 מ"ל של PBS עם EDTA 0.02%.</li>
		<li>Centrifuge את הנוזל הצפק-400 g x עבור 7 דקות ב RT וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף עוד 10 מ"ל של PBS עם EDTA 0.02%, צנטריפוגה g x 270 עבור 7 דקות-RT. להשליך תגובת שיקוע.</li>
		<li>להמיס בגדר תא (1 x 107) 60 µL מאגר עבור ערכת ההפרדה תא מגנטי.</li>
		<li>להוסיף 20 µL של Fc גוש כדורי, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסף 20 µL של האנטי-CD66b מצומדת עם גרגרי ואת תקופת דגירה של 10 דקות נוספות ב 4 º C.</li>
		<li>רוחצים את מחדש להשעות את כדורי ב- 500 µL מאגר מקינטוש.</li>
		<li>החלת התליה תא על עמודה מגנטי בשדה המגנטי של מפריד מגנטי מתאים ולאסוף זרימה דרך המכיל CD66b(-) התאים ע י שטיפת העמודה עם 15 מ"ל של המאגר.</li>
		<li>הסר את העמודה במפריד מגנטי, מיד לשטוף את התאים CD66b(+) מגנטית שכותרתו בדחיפה בחוזקה על הבוכנה לתוך העמודה. הערה: האוכלוסייה תא CD66b(+) מורכב בעיקר נויטרופילים כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS המציין > 95% של השבר CD66(+) הם חיוביים עבור CD11b, CD15 CD16, אבל שלילי עבור CD14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דור של רשתות<ol>
<li>לאחר צנטריפוגה-g x 270 עבור 7 דקות-RT, מחדש להשעות את-כעבור שנה-מבודד (5 x 106) ב 1 מ"ל של RPMI1640 עם 10% FCS.</li>
		<li>תרבות של-כעבור שנה-על הצלחת מצופה 6-ובכן פולי-L-ליזין (6 ס מ קוטר) עבור 2 h ב- 37 הלעפה תרוטרפמט 5% CO2.</li>
		<li>להוסיף את counterstain פלואורסצנטי ירוק (צבע ממברנה-אטום כדי להכתים את גרעין ואת כרומוזומים) הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר.</li>
		<li>מיד להבחין המורפולוגיה של רשתות (חוץ-תאי DNA הרכיבים שגורשו את-כעבור שנה-תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. צביעת של תאים סרטניים עם צבע מקשר תא ניאון אדום
<ol><li>להכין סרטן אנושי שורות תאים MKN45, NUGC, OCUM-1.</li>
	<li>לשטוף את התאים7 עונה 1 פרק 10 עם PBS + EDTA 0.02% 15 מ"ל שפופרת, צנטריפוגה ב 270 x g במשך 7 דקות ב- RT.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של פתרון עבור צבע מכתימה את כדורי, פיפטה בעדינות.</li>
	<li>להמיס 4 µL של צבע מקשר תא ניאון אדום ב 1 מ"ל של פתרון עבור צביעת ומערבבים עם התליה תא מהשלב 2.2.</li>
	<li>דגירה כדורי במשך 4 דקות ב- RT.</li>
	<li>להוסיף 4 מ של DMEM (10% FBS) כדי לעצור את התגובה מוכתמים.</li>
	<li>צנטריפוגה g x 270 עבור 7 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.6 ו- 2.7 פעמיים.</li>
	<li>בדוק עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (עירור = 551 nm, פולטות = 567 ננומטר) כי בתאי הגידול מוכתמים באדום.</li>
</ol>3. ניתוח של גידול התא הדבקה על רשתות
<ol><li>מחדש להשעות את תאי הגידול מוכתם ניאון אדום (1 x 106) ב 1 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת BSA 0.1%.</li>
	<li>הוסף את תאי הגידול התרבות-כעבור שנה-שהפיקה את הרשתות כפי שמתואר בשלב 1.3.</li>
	<li>תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 הלעפה תרוטרפמט, אשר מאפשרת לתאי הגידול ליצור קשר עם הרשתות. הערה: זמן דגירה גורם גידול התא אדהזיה-כעבור שנה- או את הצלחות.</li>
	<li>להסיר את המדיום ולשטוף בעדינות את הבארות על-ידי הוספת 2 מ"ל של מדיה prewarmed (BSA 0.1% + RPMI 1640), מתערבל המנה.</li>
	<li>חזור על הפעולות כביסה בשלב 3.4 פעמיים. הערה: מאז רשתות בחולשה לצרף הצלחת, כביסה צריך להיעשות בעדינות ככל האפשר כדי למנוע הסרה של הרשתות עצמם.</li>
	<li>הוסף את הפלורסנט ירוק עבור מכתימה את גרעין ואת כרומוזומים-ריכוז הסופי של 5 µg/mL עבור ויזואליזציה של הרשתות.</li>
	<li>לצפות את הרשתות ומחוברת תאים סרטניים באמצעות את המסננים המתאימים (ירוק, עירור = 504 nm, פולטות = 523 ננומטר; רד, עירור = 551 nm, פולטות = 567 ננומטר).</li>
	<li>למזג את הנתונים כדי להציג את תאי הגידול כי הם לכודים על ידי הרשתות. הערה: כמה ניסויים, האנזים DNA השפלה נוספה התרבות-כעבור שנה-(הריכוז הסופי של 100 U/mL) 5 דקות לפני שיתוף הדגירה למשך 5 דקות.</li>
</ol>4. זמן לשגות ניתוח וידאו של תאי הגידול לכוד
<ol><li>תרבות-כעבור שנה-פריטוניאלית ב 35 מ מ עגול מאכל מצופה פולי-L-ליזין כפי שמתואר בשלב 1.3.</li>
	<li>הוסף את הפלורסנט ירוק עבור מכתימה את גרעין ואת כרומוזומים להמחיש רשתות כפי שמתואר בשלב 1.3.</li>
	<li>לאחר 1 דקות של דגירה, מסיר את המדיה ולהוסיף 2 מ"ל של BSA 0.1% + RPMI 1640.</li>
	<li>מסיר את המדיה ולהוסיף מוכתם עונה 1 פרק 106 MKN45 תאים הושעו ב- 0.1% BSA + RPMI 1640. תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.</li>
	<li>להסיר תאים סרטניים כעיגולים בצבע כלשהו על ידי שטיפת בעדינות כפי שמתואר בשלב 3.4 ולהוסיף DMEM עם 10% FCS בתוספת 100 u/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100.</li>
	<li>הר המנה תרבות במערכת תצפית נוף כל תא, בחר את השדה המתאים איזה גידול תאים לכוד על ידי הרשתות.</li>
	<li>ממשיכים תרבות משותפת עבור נוספים יומיים לצלם תמונות רציף של השדה בכל 6 דקות תחת תאורה רגילה וזריחה, אשר מזהה תאים MKN45 ורשתות, בהתאמה.</li>
	<li>להרכיב את התמונות על כל timepoint ולבנות זמן לשגות וידאו באמצעות התוכנה מציג תמונה.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

מחקרים קודמים דיווחו כי מחזורי תאים סרטניים יכולים להיות. לכוד סובסטרטים נטו ויוו10,11. תאי סרטן שד גרורתי הוכחו לעורר נויטרופילים, זירוז היווצרות של רשתות, אשר מסייע צמיחת תאים סרטניים גידולים איבר המטרה17. בנוסף, מצאנו כי של נוזל שטיפה לאחר הניתוח לטווח קצר תרבויות של-כעבור שנה-המיוצר מסיבי ברשתות יכול ביעילות אומללותו תאים סרטניים ללא גירוי נוסף15. מקרים אלה מצביעים על תפקיד אפשרי למעורבות מכני של רשתות ...

פולימורף נויטרופילים גרעיני במחזור הדם מופרדים בדרך כלל תאי תאי דרך שיטת הכנה הדרגתיות צפיפות. עם זאת, כמה נויטרופילים הידוע בשם נויטרופילים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), עם פנוטיפים CD11b(+), CD15(+), CD16(+), CD14(-), הם מטוהרים במשותף עם תאי תאי. המספר היחסי של-כעבור שנה-מגדיל באופן משמעותי בתנאים פתולוגיים שונים, כולל מחלות אוטואימוניות1,2, אלח דם3ו-4,סרטן5. מחקרים קודמים הראו כי-כעבור שנה-מחלקה phenotypically והן מבחינה תפקודית ברורים של נויטרופילים6. יצוין, כי-כעבור שנה-במחזור הדם הם נוטים יותר לייצר מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) מצפיפות נורמלי נויטרופילים2,7. הרשתות הן מבנים דמויי-אינטרנט המורכב של חומצות גרעין, שינויים היסטוניים, פרוטאזות, חלבונים פרטנית ו cytosolic, הם ביעילות במלכודת, להרוס פתוגנים8.
לאחרונה, רשתות הוכחו ללכוד לא רק חיידקים, אבל גם טסיות דם ופיזור תאים סרטניים, אשר יכולים לסייע כגון היווצרות9 וגידול גרורות10,11. עם זאת, המנגנונים המולקולריים מאחורי האינטראקציות דבק בין רשתות, טסיות דם או תאים סרטניים נמצאים עדיין לא ברור. לאחרונה, assay אדהזיה במבחנה גילה כי תאים לוקמיה מיאלואידית (K56212) ותאים קרצינומה של הריאות (A54913) לצרף רשתות באמצעות אינטגרינים β1 וβ3. המחברים השתמשו נטו מניות מבודד נויטרופילים ומופעל על ידי phorbol 12-פעילים 13-אצטט (PMA) המצע אדהזיה14. למרות assay זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות אמיתי עם רכיבים נטו בהיעדרו של נויטרופילים, זה לנתיחה אם "התא ללא מניות נטו" מבודדת על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה משמרת את המבנה המולקולרי זהה רשתות המיוצר ב ויוו. לאחרונה, מצאנו את נוזל שטיפת הצפק לאחר ניתוח בבטן הכיל הרבה בוגרים-כעבור שנה-, אשר נוצר רשתות מסיבי המוצמדות לתאים הגידול גורם גרורות הצפק15. במחקר זה, בדקנו בהצלחה את הידבקות תאים סרטניים רשתות שלמות ללא כל פעולה פיזית. כאן, אנו מראים פרטים של טכניקה לגילוי דבק אינטראקציות בין רשתות תאים סרטניים חינם.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, שוודיה</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightFrom&trade; Whole Blood CD66b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>Miltenyi Biotec , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS Rinsing Solution</td><td>Miltenyi Biotec , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>Miltenyi Biotec , ברגש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi Biotec, ברגיש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>מפריד מגנטי MACS</td><td>Miltenyi Biotec, ברגיש גלדבאך, גרמניה</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת כתם חומצת גרעין ירוקה של SYTOX 5 מ"מ ב-DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומים לתיוג קרום תא כללי</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>מדלל C</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr> RPMI1640 <tr><td>בינוני</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle גלוקוז בינוני-גבוה (DMEM)</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת 0.5mol/l-EDTA (pH 8.0)</td><td>nacalai tesque, יפן</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA</td><td>gibco by Life Technologies, מקסיקו</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין אבקה ליופילית, &ge; 96% (אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז)</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies יפן</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פלסמוצין מונע</td><td>InvivoGen, סן דייגו, קליפורניה-ארה"ב</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>וורת'ינגטון, לייקווד ניו ג'רזי)LS002138</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MICROPLATE מצופה פולי-L-ליזין 6Well</td><td>IWAKI, יפן</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>MICROPLATE מצופה פולי-L-ליזין 24Well</td><td>IWAKI, יפן</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצאין</td><td>BX8000, Keyence, אוסקה יפן</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תצפית על תאים בתצוגה מלאה</td><td>ניקון, קנאגאווה, יפן</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr> <tr><td>MKN45 קו תאי סרטן קיבה אנושי</td><td>Riken, Tukuba יפן</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NUGC-4 קו תאי סרטן קיבה אנושי</td><td>Riken, טוקובה יפן</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 קו תאי סרטן קיבה אנושי</td><td>אוניברסיטת אוסקה סיטי, יפן</td><td>N/A</td><td>מתנה מד"ר מ. יאשירו</td></tr></tbody></table>

נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

הפעלת נויטרופילים שחרור נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות), אשר יכולים ללכוד ולהשמיד חיידקים. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי רשתות מעורבים בתהליכי מחלה שונים, כגון גרורות המחלה פקקת, הגידול אוטואימוניות. כאן, אנו מראים טכניקה מפורט במבחנה לזיהוי פעילות נטו במהלך לכידה של תאים סרטניים חינם, אשר גדלים לאחר חיבור רשתות. ראשית, אספנו בצפיפות נמוכה נויטרופילים (-כעבור שנה.-) של נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח בחולים שעברו laparotomies. Culturing לטווח קצר של-כעבור שנה-הביא שמצביעה נטו מסיבית היה מדמיין עם גרעיני ירוק פלורסנט, כרומוזום counterstain. לאחר דגירה שיתוף של שורות תאים סרטן קיבה אנושית MKN45, OCUM-1 ו- NUGC-4 עם הרשתות, תאים סרטניים רבים נלכדו על ידי הרשתות. כתוצאה מכך, הקובץ המצורף היה יושב לחלוטין על ידי ההשפלה של רשתות עם Time-lapse אני DNase הסרטונים גילה כי תאים סרטניים, שנלכד על ידי הרשתות לא מת, אבל במקום גדל נמרצות בתרבות רציפה. שיטות אלה ניתן להחיל את הגילוי של דבק אינטראקציות בין רשתות סוגים שונים של תאים וחומרים.

בתרבות 2 שעות CD66b(+)-כעבור שנה-נגזר מבנים מחרוזת הראה נוזל שטיפת הצפק צבעונית עם צבע ירוק-פלורסנט עבור גרעיני, כרומוזום (איור 1B), בעוד CD66b(-) תאי תאי לא (איור 1C). עם זאת, כאשר pretreated היו התרבויות-כעבור שנה-עם 100 DNase U/mL, המבנה האופייני היה נהרס (איור 1D), המציין כי הם מורכבים של דנ א חוץ-תאית, שגורשו נויטרופילים. כאשר-כעבור שנה-היו תרבותי על צלחות פלסטיק ללא ציפוי, אשכולות נטו רבים צף, ...

כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידן של תת-אוכלוסיות נויטרופילים באימונולוגיה של גידולים, במיוחד לגבי המעורבות המכנית של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות, או NETs, בגרורות גידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה של אינטראקציות הדבק של תאי גידול ל-NETs שלמים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בסרטן.מכיוון ש-NETs שמקורם בתת-קבוצות נויטרופילים ספציפיות עשויים לקדם גרורות גידול. מי שמדגים את ההליך יהיה ג'ונקו שוניוהרה מהמעבדה שלנו. כדי לרכוש את הנויטרופילים יש להחדיר תחילה ליטר אחד של מי מלח סטריליים רגילים מיד לפני סגירת הפצע ישירות לחלל הבטן של מטופל שזה עתה עבר ניתוח בטן עקב ממאירות במערכת העיכול ולשטוף את חלל הבטן באופן נרחב למשך דקה אחת לפחות.לאחר מכן מערבבים את מי המלח בתוך החלל ומחזירים 200 מיליליטר של נוזל שטיפה עם ארבעה מזרקים של 50 מיליליטר. במעבדה מעבירים את נוזל השטיפה הצפק דרך מסנן ניילון של 100 מיקרומטר לצינורות בודדים של 50 מיליליטר לצנטריפוגה. השעו מחדש את הכדורים ב-5 מיליליטר PBS בתוספת 0.02% EDTA וכסו בזהירות כל תרחיף תא על שלושה מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות.לאחר הפרדת שיפוע צפיפות קצרו שניים עד שלושה מיליליטר משכבת הביניים מכל צינור ושטפו את דגימות הנוזל הצפק ב-10 מיליליטר PBS טרי בתוספת EDTA לכל צינור. אסוף את הכדורים ב-10 מיליליטר PBS טרי בתוספת EDTA לשטיפה נוספת ודלל את התאים ל-10 פעמים 10 עד התאים השביעיים לכל 60 מיקרוליטר של מיון תאים פעילים מגנטיים, או MACS, ריכוז חיץ. חסום כל קשירה לא ספציפית עם 20 מיקרוליטר של בלוק Fc למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאחר מכן תוספת של 20 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים נגד CD66b.לאחר 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס יש לשטוף ולהשעות מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS ולהוסיף את התאים לעמוד מגנטי בגודל מתאים בתוך השדה המגנטי של מפריד מגנטי מתאים. כאשר כל התאים השליליים של CD66b עברו דרך העמודה, הוסף 15 מיליליטר של מאגר MACS טרי למאגר העמודה והעביר את העמודה מהמפריד המגנטי לצינור חרוטי חדש. לאחר מכן צללו מיד את העמודה כדי לשטוף את ה-CD66b החיובי המסומן מגנטית לתוך הצינור.לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את הנויטרופילים המבודדים בצפיפות נמוכה בחמישה פעמים 10 עד שישי תאים למיליליטר של מדיום RPMI1640 בתוספת ריכוז FBS וזרע 1 מיליליטר של נויטרופילים לבאר על הצלחת המצופה פולי-L-ליזין בת שש. לאחר שעתיים, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, יש לצבוע את התאים בכל באר בקרום פלואורסצנטי מתאים, צבע גרעיני וכרומוזומי אטום, בהתאם להוראות היצרן, ולהתבונן מיד במורפולוגיה של ה-NETs במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כדי להעריך את הידבקות תאי הגידול ל-NETs, יש להשעות מחדש תאי גידול בקיבה המוכתמים בצבע פלואורסצנטי מנוגד ב-10 פעמים 10 עד שישית למיליליטר של RPMI1640 בתוספת ריכוז אלבומין בסרום בקר של 0.1% ולהוסיף מיליליטר אחד של תאי גידול לכל באר של תרביות נויטרופילים בצפיפות נמוכה.לאחר חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס הוציאו את הסופרנטנט מכל באר ושטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 2 מיליליטר של מדיום RPMI1640 מחומם מראש בתוספת BSA לכל שטיפה. דגירה של חמש דקות ארוכה מספיק כדי לזהות כריכה ספציפית ל-NET. מוסיפים את המדיום המחומם לצד כל באר, מערבבים לאט את הצלחת בעדינות ומסירים את הסופרנטנט בעזרת שואב.לאחר מכן ניתן לצפות ב-NETs ובתאי הגידול המחוברים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לניתוח וידאו של תאי הגידול הלכודים מתרבית ומכתים את הנויטרופילים בצפיפות נמוכה בצלחת של 35 מילימטר, בצלחת מצופה פולי-L-ליזין, כפי שהודגם שטיפה קצרה בשני מיליליטר של 0.1% BSA בתוספת RPMI1640. החלף את המדיום בתאי גידול קיבה חד פעמיים 10 עד השישי הלא מוכתמים התלויים בשני מיליליטר RPMI בתוספת BSA למשך חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר.בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בשני מיליליטר של RPMI טרי בתוספת BSA למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מערבולת עדינה להסרת תאי גידול לא מחוברים. לאחר מכן החלף את הסופרנטנט ב-DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה והרכיב את הצלחת במערכת תצפית תאים שלמה לניתוח זמן-lapse של לכידת תאי הגידול על ידי ה-NETs. לאחר שעתיים של תרבית, נויטרופילים חיוביים בצפיפות נמוכה CD66b שמקורם בנוזל שטיפת הצפק מציגים מבני מיתרים על ידי צביעה גרעינית וכרומוזומלית פלואורסצנטית ירוקה, בעוד שתאים חד-גרעיניים שליליים CD66b לא.עם זאת, כאשר תרביות הנויטרופילים בצפיפות נמוכה מטופלות מראש ב -100 יחידות למיליליטר של DNAse I, מבני המאפיינים נהרסים, מה שמעיד על כך שהמבנים מורכבים מ- DNA חוץ-תאי שנפלט מהנויטרופילים. כאשר הנויטרופילים בצפיפות נמוכה מתורבתים על לוחות פלסטיק לא מצופים, ניתן לראות אשכולות NET רבים צפים בתוך המדיום עם מעט NETs המחוברים לתחתית הצלחת. לאחר חמש דקות של דגירה עם קו תאי גידול קיבה המסומן פלואורסצנטי, תאי גידול רבים נצמדים לנויטרופילים בתוך ה-NETs, תופעה שאינה נצפית לאחר טיפול מקדים ב-DNAse I. דפוסי הידבקות דומים נראים גם עבור תאי גידול אחרים.OKUM-1 ו-NUGC-4. מעניין לציין שבעוד שה-NETs נעלמים בהדרגה תוך מספר שעות מהתרבית המשותפת המורחבת של תאי הגידול, תאי הגידול הכלואים על ידי ה-NETs מתחילים להתרבות במרץ לאחר שחרור ה-NET. בהליך זה חשוב לזכור שמכיוון שה-NETs נדבקים לצלחת בצורה חלשה, יש לבצע את תהליכי הכביסה והעברת הכלים בצורה זהירה במיוחד.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחומים שונים של מדע הביו-רפואה לחקור את הקשר הסיבתי של NETs עם מחלות שונות כגון פקקת, תסמונת תגובה דלקתית מערכתית ומחלות אוטואימוניות.

neutrophil-extracellular-traps-generated-low-density-neutrophils

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

בסרטון זה, אנו מתארים את ההליך לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה, או LDN, מנוזל שטיפת הצפק של מטופל אנושי לאחר הניתוח. כך ניתן להשתמש ב- LDNs המתקבלים בניסויים נוספים במורד הזרם כדי להבין את תפקידם בצמיחת הגידול והתקדמותו.

בידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה בצפק: טכניקה להשגת נויטרופילים בצפיפות נמוכה מנוזל שטיפת הצפק באמצעות מיון תאים מופעלים מגנטיים

סרטון זה מדגים את הצביעה הפלואורסצנטית של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs), רכיבי הדנ"א החוץ-תאיים הנפלטים על ידי נויטרופילים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של אינטראקציה דבק בין תאים סרטניים ו- NETs.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים או NETs: טכניקה לצפייה באינטראקציה דבקית בין תאים סרטניים לבין NETs

בסרטון זה, אנו מנתחים את ההתנהגות שלאחר ההדבקה של תאים סרטניים הכלואים במלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs) על ידי תרבית משותפת של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ותאי סרטן קיבה. ניתוח הווידאו בהילוך מהיר מסייע לנטר אירועים תאיים שונים וללמוד את תפקידם של NETs בתנאים פתולוגיים.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים או NETs: טכניקה לניתוח אינטראקציה לאחר הידבקות בין תאים סרטניים ו- NETs

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה ליצירת ובידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). נויטרופילים מבודדים מדם היקפי ומעוררים באמצעות phorbol myristate acetate (PMA) כדי לייצר NETs. במהלך הדגירה, הנויטרופילים עוברים תהליך של מוות תאי (NETosis) כדי לשחרר NETs המורכבים מכרומטין מעובה מעורבב עם חלבונים ציטופלזמיים גרגיריים.

טכניקת מבחנה ליצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקה המשתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות הידבקות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). בבארות הבדיקה ניכרת עלייה ניכרת במספר התאים הסרטניים המסומנים באופן פלואורסצנטי הנצמדים ל-NETs, בעוד שבבארות שטופלו ב-DNase נרשמה היצמדות מופחתת של תאים סרטניים ל-NETs.

בדיקת הידבקות חוץ גופית לאיתור היצמדות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים

נויטרופילים ממלאים תפקיד חשוב לא רק בהגנה על המארח מפני מיקרואורגניזמים פולשים, אלא גם מעורבים במעקב חיסוני אחר תאי גידול. כאן, אנו מתארים טכניקות הקשורות לבידוד נויטרופילים בעלי תכונות אנטי-גידוליות ושיטות לניטור תפקוד נויטרופילים נגד גידול במבחנה וב-vivo.

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

מתוארת סדרה של שיטות, כולל בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) מפלזמה אנושית, התמיינות של תאי HL-60 לתאים דמויי נויטרופילים, הכנת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בנוכחות LDL, וגירוי של תאי אנדותל אבי העורקים האנושיים עם תערובת של NETs ו-LDL.

גירוי של תאי אנדותל בכלי הדם באמצעות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנוכחות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה

חקור את תפקידם של נויטרופילים בצפיפות נמוכה בתפיסת תאי גידול באמצעות מלכודות חוץ-תאיות. שיטה זו מאפשרת הדמיה של אינטראקציות דביקות בין תאי גידול ל-NETs שלמים ומסייעת להבנת מטסטזיס סרטני.

נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

גלה סרטונים נוספים