זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מפתח וירולוגיה הפטיטיס B, כגון מציאת גורמים הסלולר או וירולוגי המשפיעים על שילוב DNA HPV. ישנם יתרונות רבים לטכניקה זו. זה זול יחסית, וקל לבצע, ניתוח של התוצאות הוא פשוט, וזה מאוד רגיש, עד עותקים בודדים.

למרות שיטה זו יכולה לשמש כדי לספק תובנה אינטגרציה HBV, זה יכול לשמש גם עבור וירוסים אחרים המשתלבים בגנום התא המארח, כגון HIV, HTLV-1, או HPV. כדי להדביק את התאים, זרע 200, 000 תאים למיליליטר בצלחת 12 באר, עם 1 מיליליטר של D-mem. ביום שלמחרת, השתמש בטור הפרין מטוהר su-per-na-din מ HEP-AD 38 כמו inoculant להדביק את התאים ב 1, 000 VGE לכל תא, ב 500 microliters של מדיום תרבות.

לאחר מכן, תרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס. ואז, ביום שלמחר, לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של סטרילי פעם PBS. לאחר מכן, להחליף את מדיום התרבות כל 2 ימים, עד הקציר.

ביום 3 לאחר זיהום, לטפל בתאים עם 5 micromolar tenofovir disoproxil ו 10 מיקרומולרי Lamivudine כדי להגביל את הייצור של ביניים שכפול HBV כי הם להגביר את היכולת על ידי PCR ההופכי. ביום 5, לאחר זיהום, trypsinize כמה תאים עם 200 microliters של טריפסין EDTA ולהשעות אותם 2 מיליליטר של D-mem המכיל 5 micromolar Tenofovir disoproxil ו 10 מיקרומולרי Lamivudine. לאחר מכן, להעביר את המתלים התא לצלחת שש גם, כדי לגרום לסיבוב אחד של מיטוזה.

ביום 7 לאחר זיהום, טריפסין התאים המורחבים ב 400 microliters של טריפסין EDTA ולהשעות את התערובת ב 1 מיליליטר של D-mem. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה בצינור 1.5 מיליליטר. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 פעמים G, במשך חמש דקות.

ולהסיר את הסו-פר-נה-דין בשאיפה. לחלץ את ה-DNA מכדור התא באמצעות ערכת מיצוי DNA, לפי הוראת היצרן. עבור היפוך DNA, להקצות 1.5 כדי 2.5 מיקרוגרם של תמצית ה-DNA הכולל לתוך צינור PCR 200 מיקרוליטר.

לאחר מכן, להוסיף את הכמות המתאימה של אנזים הגבלה לערבב כדי לגרום 40 microliter של נפח התגובה, המכיל 1 פעמים חיץ תגובת עיכול ו 10 יחידות NCO-1HF. הדגירה את תגובת האנזים הגבלה במכונת PCR ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, ליעילות עיכול אופטימלית. לאחר מכן, להשבית את האנזים הגבלה על ידי דגירה זה 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.

העבר את תגובת האנזים ההגבלה כולה לצינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של 1 פעמים T4 מאגר ליגאז DNA ו 500 יחידות של T4 DNA ligase, ומערבבים ביסודיות. נפח תגובה גדול מעודד רצועות תוך-מולקולריות של שברי הדנ"א המתעכלים.

הדגירה את תגובת הקשירה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות כדי להבטיח קשירה מלאה. לאחר שעתיים, יש להשבית את רצועת הדנ"א T4 ב-70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של 10 נתרן דודצ'יל סולפט כדי להבטיח השבתה מלאה של ligase T4.

מוסיפים נתרן כלורי לריכוז סופי של 100 מילימולר, ודקסטרן לריכוז סופי של 90 מיקרוגרם למיליליטר. מערבבים על ידי מערבולת דופק, ולסובב בקצרה את תערובת התגובה. לאחר מכן, להוסיף 900 microliters של 100 אתנול, ומערבבים על ידי היפוך.

לזרז את ה-DNA ב 20 מעלות צלזיוס שלילי בן לילה. ו גלולה DNA זירז על ידי צנטריפוגה ב 14000 פעמים G במשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את Su-per-na-לסעוד על ידי שאיפה.

לשטוף את גלולה עם 500 microliters של 70 אתנול. וצנטריפוגה ב 14000 פעמים G במשך 15 דקות. לאחר מכן, להסיר את אתנול על ידי שאיפה לייבש את האוויר גלולת ה-DNA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.

ממיסים את גלולה ב 20 microliters של מים ולהוסיף 20 microliters של הגבל אנזימים מאסטר לערבב לגרום 40 נפח התגובה microliter, המכיל 1 פעמים חיץ תגובת עיכול, 5 יחידות BSIHK-1, ו 5 יחידות של SPH-1HF. קן, הדגירה תגובת האנזים הגבלה בבלוק חום ב 37 מעלות צלזיוס, במשך שעה אחת. בקצרה לסובב את תערובת התגובה, לה הדגירה את תגובת האנזים הגבלה בבלוק חום ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.

בהליך זה, להסיר אמפילונים פוטנציאליים מחתם מחצלת סיליקון לשימוש חוזר, באמצעות פתרון השפלה DNA. יש לשטוף את המחצלת ביסודיות במים נטולי דנ"א ולייבש אותה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להכין מיליליטר אחד של 1 פעמים PCR לערבב המכיל את פריימרים קדימה והפוך בריכוז של 0.5 micromolar.

הוסף 170 microliters אם 1 פעמים PCR לערבב בארות A-1 ו E-1, בצלחת PCR 96 היטב. לאחר מכן, להוסיף 120 microliters של 1 פעמים PCR לערבב בארות B-1 ו H-1. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של ה-DNA הפוך בארות A-1 ו E-1.

מערבבים את התגובה בכל באר, על ידי צינור בעדינות כל אחד, כ 10 פעמים באמצעות P-1000 להגדיר 100 microliters. לדלל באופן סדרתי את הדגימות מ בארות A-1 ל- D-1, ביחס של 1:3 על ידי העברת 60 microliters בכל שלב. מערבבים את הבארים בכל שלב על ידי צינורות בעדינות אותם על 10 פעמים באמצעות P-1000 להגדיר 100 microliters.

הימנע להרכיב בועות, לחזור על ההליך גם E-1, דילול עד גם H-1. לאחר מכן, להקצות 10 microliters של תערובת התגובה, באמצעות פיפטה רב ערוצית, מ ולס A-1, H-1, לתוך בארות A-2, H2, A-3, H-3 וכן הלאה, עד להגיע בארות A-12, H-12 של צלחת 96 באר. מכסים את צלחת PCR עם מחצלת סיליקון יבשה, ולחץ בחוזקה.

לאחר מכן, למקם את הצלחת במכונת PCR, ולהפעיל את התוכנית המצוינת, לפני העברת הצלחת לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מחממים את הסיכות של משכפל 96 פינים לחום אדום עם מבער בונזן, ואז מצננים לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר. מלאו את בארות לוחית PCR שנייה ב-10 מיקרוליטרים של תערובת PCR 1 פעמים, המכילה חיץ מוכן לעומס ג'ל, ואת הפנימי קדימה ואחורה ב-0.5 מיקרו-מולאר.

בזהירות להסיר את מחצלת הסיליקון מצלחת PCR של צלחת 96 גם מן PCR הסיבוב הראשון, ולהימנע זיהום צולב בין בארות. השתמש משכפל מקורר להעביר את מוצרי PCR של צלחת 96 גם, מ PCR בסיבוב הראשון, כדי צלחת 96 באר שהוקצה לאחרונה. לבצע את PCR מקונן, באמצעות התנאי כפי שצוין.

כדי לבודד את מוצרי PCR, לנתח אותם על ידי אלקטרופורזה ג'ל, באמצעות צלחת 96 גם, עם 1.3 ג'ל אגרוז. עבור 100 מיליליטר ג'ל אגרוז, לרוץ ב 200 וולט במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, יש למלמל את רצועות הדנ"א מהג'לים של אגרוז, תוך שימוש בקשיות שתייה חד פעמיות.

עבור כל מוצר PCR, מניחים את הקש ואת תקע ג'ל אגרוז בצינור 1.5 מיליליטר, לקצץ את הקש לגודל עם מספריים. לאחר מכן, להוציא את אגארוז מתחבר לתוך כל צינור, על ידי סחיטה על קצה שבר הקש. לאחר מכן הוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי ג'ל, ו-5 מיקרוליטרים של בחנוזי זכוכית מיצוי ג'ל לכל צינור.

לחלץ את מוצרי PCR לפי הוראות היצרן עבור ערכת מיצוי ג'ל, ולדלל את ה-DNA מן חרוזים עם 30 microliters של מים. שלח את ה- DNA המטוהר עבור רצף סנגר, עם פריימר קדימה בשימוש בסיבוב השני מקונן PCR. דוגמה אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של PCR הפוכה מוצלחת, לפני ואחרי בידוד מוצר PCR, מוצג כאן.

M מייצג סמן DNA האחרון, כל שורה של 12 מייצג את השכפולים הטכניים בדילול יחיד על לוח PCR. במקרה זה, מוצרי PCR יחיד צריך להיות מושגת על ידי דילול 1:3 השני או השלישי של כל מדגם. בדילול זה, כ-50% מהמוצרים ייצגו צמתים אמיתיים של DNA של תאי וירוס.

בעוד החצי השני מייצג הגברה של מתווכים DNA HBV. טכניקה זו אפשרה לחוקרים לחקור אינטגרציית דנ"א HPV במערכות זיהום במבחנה מבוקרות מאוד. שיטות נוספות, כגון ניתוח ביותמטיקה, ניתן להשתמש כדי לענות על שאלות נוספות.

לדוגמה, אם אינטגרציה של דנ"א HPV מתרחשת באזורים ספציפיים בגנום התאי. אל תשכח כי עבודה עם זיהום הפטיטיס B וירוס, יכול להיות מסוכן ובקרות זיהום מתאימות, כגון ארונות בטיחות ביולוגית וחיסון קודם, תמיד צריך לקחת בעת ביצוע הליך זה.