אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של אימונוביולוגיה בסיסית ומחקר מחלות מעי דלקתיות לגבי מפל ההיתוך של תאים חיסוניים הנדרשים עבור ביות לאיברים היקפיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא גישה נוחה וישירה לענות על שאלות פונקציונליות בהקשר של הידבקות בתא בתנאי זרימה. למרות שיטה זו פותחה לחקר המנגנון של נוגדנים אנטי אונטגרין פואטי תא במחלות מעי דלקתיות, זה יכול להיות שונה כדי לנתח בעיות דומות בהגדרות מחלות דלקתיות אחרות.

התחל על ידי מתיחת חתיכת צינורות גומי בצד אחד עם מספריים קטנים כדי לאפשר החדרת נימי מלבני כ 0.5 ס"מ לתוך הצינור. ואז לאטום את הקשר עם סרט פרפין. מצפים את נימי עם 20 microliters של כתובת עניין ולאטום את הצד לא מחובר צינורות עם סרט פרפין פלסטיק לפחות שעה אחת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, להסיר את הסרט פרפין פלסטיק ולתת את הנוזל להשרות מתוך נימי על מגבת נייר כדי לרוקן את הצינורות. ואז לחסום נימי עם 20 microliters של פתרון חסימה לפחות שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. חשוב מאוד להחיל את החסימה על נימי ישירות לאחר הסרת הציפוי, כדי למנוע ייבוש של נימי כמו זה עלול לפגוע בפונקציונליות של חלבונים מקודד.

בעוד נימי נחסם, להוסיף 18 מיליליטר של דם אנושי שלם נוגד קרישה מצינור 50 מיליליטר לדלל את הדם לנפח כולל של 35 מיליליטר עם PBS. שכבה 10 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות תחת ת פתרון הדם ולבודד את תאי הדם מונונוקלאריים בדם ההיקפיים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בסוף ההפרדה, להעביר את התאים mononuclear הדם ההיקפיים מהממשק של מדיום שיפוע צפיפות לצינור חדש 50 מיליליטר.

ולהביא את הנפח הכולל בצינור עד 50 מיליליטר עם PBS טרי. לאחר צנטריפוגה, להשתמש מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של PBS טרי לספירה ולהכתים את התאים עם צבע מעקב תא מתאים על פי הוראות היצרן. בסוף הדגירה מכתים, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה resuspend את גלולה ב 1.5 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני RPMI מלא.

ואז לזרוע מיליליטר אחד של תאים לתוך כמו בארות רבות של צלחת 48 גם כמו שיש תנאים. ותוסיפו את הנפח המתאים של נוגדן אנטי-אונטגרין ל בארות המתאימות לשעה אחת של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש פיפטה P1000 כדי לנצל מחדש את התאים מספר פעמים לפני העברת התאים לתוך צינורות בודדים שני מיליליטר.

לשטוף כל היטב עם מיליליטר אחד של PBS ול בריכה את לשטוף את הצינורות המתאימים שני מיליליטר. לאחר הספירה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspened התאים בנפח המתאים של חיץ הידבקות כדי להשיג 1.5 פעמים עשר לתאים השישי לכל מתלים מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים את הנפח המתאים של כלוריד מנגן לכל צינור לריכוז סופי מילימולר אחד.

כאשר התאים מוכנים, הפעל את המיקרוסקופ ובחר את המסננים והלייזרים המתאימים, מצב מטרה ורכישה. הסר את סרט הפרפין מפלסטיק מה קצה הנימים ולהשתמש במספריים כדי למתוח חתיכה של חמישה סנטימטרים של צינורות גומי כדי לאפשר נימי להיות מחובר לצינור קטן יותר. לאטום את הקשר בין נימי הצינור עם סרט פרפין פלסטיק.

ולהוות את נימי על מגש קיבעון. מניחים את המגש על מחזיק המגש של המיקרוסקופ כך נימי הוא בפוקוס. ולהכניס את צינורות הגומי לתוך הרץ המתאים של המשאבה peristaltic.

מניחים את הקצה הלא מחובר של הצינור לתוך צינור הדגימה הראשון המכיל את ההשעיה התא. ולהכניס את הצינור הקצר בצד השני של נימי לתוך צינור 15 מיליליטר כדי לאסוף זרימה דרך. תן צינורות למלא בקצב זרימה של 500 microliters לדקה עד ההשעיה התא כמעט מגיע נימי.

ואז לתת את המילוי נימי בקצב זרימה של 100 microliters לדקה. כאשר נימי מלא בתאים, להתאים את קצב הזרימה ל 10 microliters לדקה וללכוד זמן לשגות תמונות של התאים נעים לאט דרך נימי לאורך החלק הפנימי של הקיר מצופה addressin כל שתי שניות במשך שלוש דקות בסך הכל. ברגע ההשעיה התא מגיע החלק הפנימי של נימי, זה קריטי כדי למנוע כל הפרעה של הזרימה כמו זה יוביל אינטראקציה סטטית integrin addressin פוטנציאל הטיה המדידה.

לפני השלכת זרם נימי שלם דרך העין של המיקרוסקופ כדי לוודא כי החלק שנצפה על המסך מייצג. שחררו את הצינורות מהמשאבה ותנו לנוזל הנותר לרוץ חזרה לצינור שני המיליליטר. לאחר מכן נתק את נימי ואת צינורות ממגש קיבעון ותמונה נימי הבא כפי שהודגם רק.

כדי להעריך את הקלטות לשגות זמן, לפתוח את הרצף הראשון בתוכנת הניתוח המתאימה ולייצא את שלוש התמונות הראשונות והאחרונה כקבצי TIFF. פתחו את שלוש התמונות הראשונות ב-ImageJ ובחרו תמונה, כתב ו- 32 סיביות להמרת התמונות ל- 32 סיביות. לאחר מכן בחרו תמונה, צבעו ומזגו ערוצים כדי למזג את התמונות לתמונה אחת ולהמיר את התמונה ללא הפרדות צבע ל-RGB לשמירה כקובץ TIFF.

לאחר המרת שלוש התמונות האחרונות באותו אופן, לספור את התאים הלבנים גלויים בהתחלה וסיום תמונות ללא הפרדות צבע. וחסיר את מספר התאים הלבנים בתמונה המתחילים ממספר התאים הלבנים בתמונה המסתיימת. זירוז של נימים מצופה ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, אבל לא Isotype Fc כימרה עם PBMCs אנושי מוביל הידבקות מסומנת כאשר אחד משלושת addressins קיים.

לעומת זאת, עיכוב של אינטראקציות integrin addressin באמצעות נוגדנים נטרול בדרך כלל מוביל לירידה ניכרת של הידבקות דינמית כי הוא נעדר כאשר נוגדנים בקרת isotype מתווספים. יתר על כן, טיפול בתאי T אנושיים CD4 עם כימוקינים ספציפיים מוביל הידבקות מוגברת addressins לעומת תאים אנושיים מטופלים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור כי גורמים שונים תורמים הידבקות תאים דינמית ב vivo כי לא ניתן לכבוש מחדש לחלוטין בהכנעה זו.

עם זאת, ניתן להתאים את ההתכווננות כדי לענות על שאלות מורכבות מאוד. על מנת לענות על שאלות נוספות על התנהגות הידבקות דיפרנציאלית של בדיקת סוגי תאים, ניתן גם לבצע בדיקות הידבקות תחרותיות עם סוגי תאים שונים המסווים בצבעי מעקב תאים שונים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו אפשרה לנו לחקור את ההשפעות של נוגדנים אנטי אונטגרין שונים המשמשים או נמצאים כעת בפיתוח לטיפול במחלות מעי דלקתיות.