הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים
6 בספטמבר 2018
אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי טיפול עצמי בעין, כגון מהי היעילות של רקמה מהונדסת ביולוגית שתוכננה במיוחד in vivo. בטכניקה זו אנו מספקים שיטה לייצור ועיצוב רקמת הרשתית וכן אסטרטגיה לעיבוד הרקמה להשתלת עין במודל של בעלי חיים. התחל בשטיפה של 1 עד 4 חתיכות של 30 על 30 מ"מ של קרום מי שפיר אנושי, או hAM.
תקן פיגומי ניילון פעמיים ב-80 מ"ל PBS לכל שטיפה בבקבוק 250 מ"ל על שייקר, במהירות גבוהה למשך חמש דקות. לאחר הכביסה השנייה, הוסיפו 40 מ"ל תמיסת תרמוליזין עובדת לכל בקבוק, ונערו את הבקבוקים פעמיים במשך חמש דקות ב-450 סל"ד, ולאחר מכן 30 שניות של מערבולת. לאחר הסבב השני של הטיפול בתרמוליזין, שטפו את החלקים פעמיים נוספות עם 80 מ"ל PBS לכל כביסה, כפי שהודגם.
לאחר מכן, השתמשו במלקחיים סטריליים ארוכים כדי להעביר את ה-hAMs בנפרד, לתוך צלחת תרבית בגודל 10 ס"מ, המכילה 10 מ"ל PBS. לאחר מכן, הניחו קרום אחד כשהניילון פונה כלפי מטה בצלחת תרבית שנייה בגודל 10 ס"מ של PBS, ונתק שניים מארבעת הקליפים המחזיקים את הממברנה לניילון. הכנס את הטבעת הקטנה יותר של תוספת התרבית בין הניילון לממברנה, וודא שהממברנה מכסה את הטבעת הקטנה יותר לחלוטין.
מהדקים את החלק השני של תוספת התרבית לחלק העליון של הממברנה כך שממברנת הבסיס של ה-hAM פונה כלפי מעלה בתוספת התרבית ונתק את שני הקליפים האחרונים. לאחר מכן השתמש במספריים סטריליים כדי לקצץ כל קרום מחוץ לתוספת התרבות לפי הצורך. והשתמש במלקחיים כדי להעביר את הממברנה לבאר אחת של צלחת 12 בארות, המכילה PBS לאחסון ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
לפני הזריעה, בקבוקוני קריו חמים המכילים פעם אחת 10 עד תאי RPE השישיים ב-3 מ"ל של מדיום RPE בצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל לכל בקבוקון. כאשר התאים הופשרו, פיפטה כדי להשיג תרחיפי תאים בודדים בכל אחד מהצינורות, וספרו את מספר התאים הקיימים על ידי אי הכללה כחולה של שלושה פאנים. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים בריכוז שבע פעמים 10 עד חמישית תאים למיליליטר במדיום RPE טרי.
לאחר מכן, שאפו את ה- PBS מכל באר של צלחת 12 הבארות המוכנה, והוסיפו 500 מיקרו ליטר תאים למרכז כל תוספת תרבות, ו -1 מ"ל מדיום RPE לתחתית כל באר. לאחר מכן החזירו את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 30 יום, והחליפו את המדיום פעמיים בשבוע עד לסיום התרבית. ביום התרבות, 30, יש לחמם תמיסת ג'לטין של 8% באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות.
וממלאים את החדר הפנימי של ויברטום במדיום עצמאי של ארבע מעלות צלזיוס CO2. השתמש באזמל כדי לחתוך גוש בגודל 5 ס"מ על 5 ס"מ מגוש ג'לטין של 20% המאוחסן בארבע מעלות צלזיוס. אבטח את הצד העליון של הבלוק לתמיכה בעזרת דבק מתאים.
והנח להב חדש לתוך הוויברטום. כוונן את הבלוק עד שהוא יהיה באותה רמה כמו סכין הגילוח, ומלא את האמבטיה סביב התמיכה במדיום עצמאי טרי של ארבע מעלות צלזיוס CO2. חותכים את הבלוק במהירות בינונית עד שהבלוק נחתך באופן אחיד עם משטח מוביל חלק ומגדירים את המיקום לאפס.
לאחר מכן שואבים את המדיום סביב הג'לטין עד שהג'לטין יבש לחלוטין. והשתמש במלקחיים כדי לפתוח בזהירות תוספת תרבית זרעי RPE על גבי הבלוק. השתמש במספריים כדי להסיר את כל הממברנה מחוץ לטבעת ההכנסה, ולשאוף את כל נפח המדיום השיורי.
הוסף עד 1 מ"ל של תמיסת ג'לטין נוזלית 8% לקרום עד לכיסוי. והסר בזהירות את כל עודפי הג'לטין. לאחר חמש עד שמונה דקות, הוסף מדיום עצמאי טרי של ארבע מעלות צלזיוס CO2 לאמבטיה עד לכיסוי הממברנה המוצקה.
ועם הוויברטום במצב 100 מיקרון, חותכים קטע מהקרום במהירות בינונית, תוך הקפדה על כיוון הרקמה. חותכים פינה של הקטע בעזרת אזמל כדי לאפשר זיהוי כיוון הקטע. והשתמש במרית כדי להעביר את הממברנה המוטבעת בג'לטין לאחת משש בארות, מלאה במדיום שימור של ארבע מעלות צלזיוס.
כיוון הפרוסה יכול להיות הפוך עקב תנועה משוחררת לפני חיתוך הפינה. לכן הקפידו לאבטח את מיקום הפרוסה מיד לאחר הקטע. לאחר מכן ניתן להתאים את גודל השתל לגודל העין הנמענת תחת מיקרוסקופ כירורגי, לפני השתלה.
בדרך כלל נשארים כמה תאים מתים על פני הממברנה, לאחר קיבוע על תוספת התרבית, אך תאים אלה מסולקים כאשר מדיום התרבית משתנה. סיבי קרום הבסיס נראים בהגדלה גבוהה יותר כאשר לא נותרו תאים, מה שמעיד על כך שתקופת הטיפול בתרמוליזין עברה אופטימיזציה. קל יותר לראות את אפיתל הרשתית במיקרוסקופ, כשהוא מתבגר, ויוצר שכבה חד-שכבתית שלמה דמוית אבן לאחר שלושה שבועות.
לאחר ארבעה שבועות, האפיתל בוגר מספיק כדי להיות מוכן להשתלה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמצב הג'לטין תלוי בטמפרטורה. לכן הקפידו להקפיד על הטמפרטורות המומלצות.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול בתאי גזע, לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של רקמה מהונדסת ביולוגית במודל של בעלי חיים של רטיניטיס פיגמנטוזה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו להכנת רקמה על גבי פיגום, לצורך השתלתה לאחר מכן, ניתן ליישם אותה גם על מערכות מורכבות יותר המכילות שכבות קולטני צילום. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הקושי לטפל בקרומי השפיר האנושיים, שהם דקים מאוד ונוטים להתקפל בקלות.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקיבוע קרום מי השפיר האנושי ושלבי הטמעת ג'לטין, קשים ללמידה ודורשים גישת טיפול מסוימת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להנדסת רקמת רשתית באמצעות תאי אפיתל של pigment של הרשתית המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. הרקמה גודלה על קרומי שליה אנושיים ומוכנה להשתּלה במודלים של בעלי חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- רפואה רגנרטיבית
- הנדסת רקמות
רקע
- מחלות רשתית עלולות להוביל לאובדן ראייה.
- רקמות בהנדסה ביו-טכנולוגית עשויות לספק אפשרויות טיפוליות.
- תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מהווים מקור מבטיח לסוגים של תאי רשתית.
- קרומי שפך יכולים לשמש כפיגומים להנדסת רקמות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להפקת רקמת רשתית עבור יישומים מחקריים וטיפוליים.
- הערכת היעילות של רקמת רשתית מהונדסת ביולוגית in vivo.
- ביסוס פרוטוקול לעיבוד רקמה לצורך השתלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שטיפת חלקי קרום שליה אנושי.
- קיבוע פיגומים מניילון ב-PBS.
- טיפול בתמיסת Thermolysin.
- ערבוב במכשיר וורטקס ושטיפה להכנת הרקמה.
תוצאות עיקריות
- הוקמה שיטה הדירה להנדסת רקמת רשתית.
- הטכניקה מאפשרת ייצור ועיצוב של רקמת רשתית.
- פירוטו של שלבי ההכנה להשתלה בעין.
- השיטה עשויה להקל על מחקרים עתידיים בנושא טיפולים ברשתית.
מסקנות
- שיטה זו מספקת תשתית להנדסת רקמות רשתית.
- היא עשויה להעמיק את ההבנה בנושא טיפול עצמי של הרשתית.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על טכניקה זו עבור יישומים קליניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הנדסת רקמת רשתית תפקודית מתאיים פלוריפוטנטיים אנושיים נותנת מענה לבקע קריטי בטיפולים רגנרטיביים עבור דגנרציה של הרשתית. שיטה זו מאפשרת הערכה פרה-קלינית של שתלים בהנדסה ביולוגית במודלים של מחלה, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור התערבויות מבוססות תאים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במסלולים תרגומיים עבור תוכניות לטיפול בניוון גביעית הקשור לגיל וברטיניטיס פיגמנטוזה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות יצירת רקמת RPE הרלוונטית למחלה מתאי גזע.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הדירה לתיקוף תפקודי של מטרות בפיזיולוגיה הפתולוגית של הרשתית.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הערכת יעילות השתבל לפני מחקרי in vivo יקרים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר שכבות חד-שכבתיות (monolayers) סטנדרטיות של RPE על פיגומים רלוונטיים ביולוגית לצורך סריקת תרכובות.
- תוצרים כמותיים: מאפשר מדידה של הבשלה רקמטית ומדדים תפקודיים לאורך זמן התרבית.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מאפשר הכנה בקנה מידה רחב של רקמה המוכנה להשתלה לצורך הערכה טיפולית בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה את הפתופיזיולוגיה של ניוון רשתית באמצעות TPE המופק מתאי גזע בסביבה הדומה לממברנת ברוך (Bruch’s membrane).
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין שלב הגילוי למחקרי השתלה במודלים של חיות עם רתיניטיס פיגמנטוזה (retinitis pigmentosa).
- החלטות מותאמות סיכון: מספק בסיס לקריטריונים של קבלה או דחייה (go/no-go) בהתבסס על שלמות הרקמה ובקרת האוריינטציה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משלבת דיפרנציאציה של תאי גזע עם הנדסת רקמות כדי לתמוך בגילוי לאורך שלבי הפיתוח הפרה-קליניים של טיפולים ברשתית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות יצירה מבוקרת של רקמת RPE על קרומי שליה אנושיים.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות זריעה רפרודוקבילית של רקמות ולוחות זמנים קבועים להבשלה.
- אנליזה: מספק מדדים מבניים ותפקודיים כגון יצירת שכבה אחת (monolayer) ונראות של קרום הבסיס.
- מחקר תרגומי: מקשר בין רקמה המופקת מתאי גזע להכנה להשתחלה לצורך בדיקת יעילות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להפקת רקמת רשתית מוכנה להשתלה במגוון פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתפקוד של השתל רשתית באמצעות הנדסה ברמת הרקמה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות טיפול סטנדרטי בפיגומים ביולוגיים עדינים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להערכה תפקודית של תרפיה תאית בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורט폴יו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי תיקוף איכות הרקמה לפני השתלה in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות של תאי גזע וטיפול עדין ברקמות.
- תלוי בבקרה מדויקת של הטמפרטורה במהלך הטמיעה בג'לטין והחיתוך.
- מחייב טכניקה סטרילית וציוד ייעודי כגון vibratome וסבבי תרבית (culture inserts).
- כולל אופטימיזציה של הטיפול האנזימטי כדי לשמור על שלמות ממב ratification הבסיס.
- מוגבל על ידי השבירות של קרומי השית (amniotic membrane) האנושיים, הדורשת מניפולציה קפדנית כדי למנוע קיפול או קרע.
