הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הננו-רפואה לגבי היעילות והבטיחות של תרופה הנטענת על ננו-חלקיקים המועברים לאם ולעובר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מדידה ביוכימית מדויקת של כמות התרופה המועברת לשליה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בסיבוכי הריון בתיווך שליה מכיוון שחשוב להבטיח מיקוד מדויק של העברת התרופה לשליה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הערכת אולטרסאונד בתדירות גבוהה של התפתחות עוברית דורשת סבלנות וניסיון כדי לשלוט בה. להזרקת ננו-חלקיקים תוך ורידית, העבירו עכבר בהריון Embryonic Day 14.5 עם ורידי זנב מורחבים בחום לתוך מסנן, ונקו את הזנב בעזרת ספוגית אלכוהול. לאחר מכן הכניסו את קצה המחט של מזרק אינסולין בגודל 28 לווריד זנב מורחב, ולחצו לאט על הבוכנה במשך חמש עד 10 שניות בלחץ אחיד כדי להעביר את הננו-חלקיקים לווריד הזנב.

30 דקות לאחר ההזרקה, הנח את העכברה ההרה המורדמת בתא ההדמיה של מערכת הדמיה פלואורסצנטית in vivo במצב שכיבה. בחר פלואורסצנטי דו-ממדי ואת פרמטרי הצילום המתאימים להדמיית אותות הקרינה הירוקה של אינדוציאנין, והגדר את החשיפה לאוטומטי ואת אורכי הגל של העירור והפליטה ל-710 ו-820 ננומטר, בהתאמה. לאחר מכן דמיינו את החיה, והחזירו את העכבר ההרה לכלוב שלו.

48 שעות לאחר ההזרקה, השתמשו במלקחיים של Graefe, מלקחיים של רקמות Graefe ומספריים לניתוח כדי לאסוף את העוברים והשליה, והדמינו את הרקמות שנקטפו כפי שהודגמו זה עתה עבור החיה כולה. להערכת אולטרסאונד בתדר גבוה של התפתחות עוברית, 24 שעות לאחר הזרקת ננו-חלקיקים, אבטח את הסכר ההריוני המורדם על פלטפורמת הדמיית אולטרסאונד מחוממת מראש של 37 עד 42 מעלות צלזיוס במצב שכיבה, והנח את המתמר של 40 מגה-הרץ לתוך הזרוע המכנית. לאחר מכן התאם את מיקום המתמר כדי לקבל תמונות אורכיות של העובר והשליה עם אזור העניין באזור המוקד.

להדמיה וניתוח במצב B, בחר במצב B והורד את המתמר מעל הבטן עד שהעובר והשליה נראים לעין. לחץ על סריקה/הקפאה כדי להתחיל ולהפסיק את ההדמיה, על Cine Store כדי לאחסן את לולאת הקולנוע ועל Frame Store כדי לאחסן את תמונות המסגרת. לאחר מכן לחץ על מדידה כדי לנתח את אורך שק ההריון, אורך גוש הכתר העוברי, הקוטר הדו-קודקודי, היקף הבטן, קוטר השליה ועובי השליה.

להדמיה וניתוח של דופלר גל דופק, באמצעות אותה הקרנת סריקה, לחץ תחילה על צבע, לאחר מכן בחר גל דופק, והנח את תיבת נפח הדגימה במרכז עורק הטבור. לחץ על סריקה/הקפאה כדי להפעיל הדמיה ועל Cine Store כדי לאסוף את תמונות עורק הטבור. לאחר מכן לחץ על מדידה כדי לחשב את מהירות השיא של עורק הטבור.

להדמיה וניתוח במצב דופלר צבעוני, באמצעות אותה הקרנת סריקה, לחץ על צבע והתאם את מיקום המתמר כדי לקבל תמונות של לב העובר כפי שמודגם. לאחר מכן לחץ על מדידה כדי לחשב את דופק העובר של לולאת התמונה הקולנועית המאוחסנת. לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה, או HPLC, הזריק תחילה לעכבר בהריון Embryonic Day 14.5 מנה אחת של ננו-חלקיקים כפי שהודגם.

לאחר 24 שעות, יש להחדיר את לב החיה ההרה ב-50 מיליליטר של 0.9% מלח קר כקרח למשך 10 דקות כדי להסיר ננו-חלקיקים לא קשורים, ולאסוף את העוברים והשליות לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס. ביום הניתוח, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת הומוגניזציה טרייה שהוכנה לכל דגימת רקמה של 200 מיליגרם, והומוגניזציה של הדגימות פעמיים במהירות מלאה למשך 30 שניות לכל דיסוציאציה. לאחר ההומוגניזציה השנייה, יש לצנטריפוגה את הדגימות ולסנן את הסופרנטנטים דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר לתוך בקבוקון HPLC.

הנח את בקבוקוני הדגימה במגש דגימה אוטומטית להזרקה, והפעל את מסיר ה-HPLC כדי להוציא אוויר מהמערכת. לאחר מכן, הפעל את הזרימה כדי לאזן את העמודה עם השלב הנייד למשך 30 דקות כדי להפחית את רעש הבסיס, והגדר את טמפרטורת העמודה ל -25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הזרקו נפחי דגימה של 20 מיקרוליטר בקצב זרימה של מיליליטר לדקה תוך 30 דקות, ולחצו על שיטת הפעלה כדי להתחיל בניתוח.

לאחר השלמת הריצות, שנה ידנית את השלב הנייד לאצטוניטריל בדרגת HPLC, והפעל את האצטוניטריל למשך כ-15 דקות כדי להגן על המערכת. הדמיה in vivo חושפת אותות ירוקים אינדוציאנין חזקים ברקמת הרחם 30 דקות לאחר הזרקת ננו-חלקיקים מצומדים פלואורסצנטיים הקשורים לשליה, בעוד שהננו-חלקיקים הבלתי קשורים מתמקמים בעיקר בכבד ובאזורי הטחול. 48 שעות לאחר ההזרקה, נצפה אות פלואורסצנטי בשליה של בעלי חיים מוזרקים ננו-חלקיקים הקשורים לכונדרואיטין סולפט, ללא אותות שזוהו בתוך העובר.

ניטור אולטרסאונד בתדר גבוה של בעלי חיים מוזרקים ננו-חלקיקים מצומדים פלואורסצנטיים הקשורים לשליה, חושף ירידה משמעותית בציוני דרך התפתחותיים מרכזיים בעובר ובשליה. מעניין לציין כי טיפול בננו-חלקיקים הקשורים למטוטרקסט גם פוגע מעט בהתפתחות העובר והשליה, מה שמצביע על כך שהננו-חלקיקים עשויים לשפר את העברת המטוטרקסט לשליה באמצעות אפקט החדירות והשמירה המשופרים. מדידת ריכוזי מטוטרקסט על ידי HPLC מצביעה על זמן שמירה של שבע דקות בתוך השליה של עכברים שהוזרקו על ידי ננו-חלקיקים הקשורים למטוטרקסט.

24 שעות לאחר ההזרקה, רמות מטוטרקסט השליה בקבוצה שהוזרקה על ידי ננו-חלקיקים הקשורים למטוטרקסט נמוכות משמעותית מאלו שנמדדו בקבוצת כונדרואיטין סולפט שליה וננו-חלקיקים קשורים למטוטרקסט, ללא מטוטרקסט שזוהה בעוברים של האחרונים. עדיין ניתן לזהות מטוטרקסט בשליה 48 שעות לאחר הזרקת כונדרואיטין סולפט שליה וננו-חלקיקים הקשורים למטוטרקסט, מה שמדגים כי כונדרואיטין סולפט שליה וננו-חלקיקים הקשורים למטוטרקסט אינם יכולים לחצות את השליה, ובכך למזער את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות על העובר. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהשליה מתחילה להיווצר בסביבות היום העוברי 9 וחצי, ולכן עדיף לבצע את ניסוי ההדמיה in vivo ביום העוברי 10 וחצי ואילך.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעה וניתוח אימונופלואורסצנטי כדי לענות על שאלות נוספות לגבי לוקליזציה של הננו-חלקיקים בתוך השליה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום רפואת הרבייה לחקור את האפשרות של טיפול ממוקד שליה בסיבוכי הריון.