הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ויסות ביטוי גנים כגון כיצד חלבונים קושרי RNA מתאספים על RNA מסוים in vivo ובכך כופים ויסות גנים לאחר שעתוק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה זקוקה לשום שיבוט או מניפולציה גנטית. ניתן להתאים אותו לכל אורגניזם מודל או תת-סוג.

כדי לתכנן אוליגונוקלאוטידים, נתח את המבנה המשני של ה-mRNA או קטע ממנו באמצעות כלים מקוונים. ראשית, הזן את רצף הנוקלאוטידים בתיבה הריקה, ולאחר מכן בתיבה אפשרויות בסיסיות בחר אנרגיה חופשית מינימלית והימנע מזוגות בסיסים מבודדים. ב אפשרויות פלט תיבה, בחר עלילת מבנה משני אינטראקטיבית של RNA, ולבסוף לחץ על המשך לחצן.

יופיע חלון חדש המציג את המבנה המשני של ה-mRNA המעניין. בחר לפחות שלושה רצפים שונים באורך 21 עד 24 נוקלאוטידים בתוך ה-mRNA המעניין, בעדיפות באזורים חסרי מבנים משניים נרחבים וממוקמים באזורים לא מתורגמים של 3 ראשוניים. בחר אזורים עם יחס גואנידין/ציטוזין קרוב ל-50% וחסר חזרות טנדם נוקלאוטידים כדי למנוע היווצרות פוטנציאלית של סיכות שיער או חישול עצמי.

תכנון ידני של אוליגונוקלאוטידים של RNA 2-prime-methoxy הנושאים חלק ביוטין ב-3-prime המשלימים לחלוטין את האזורים שנבחרו בתוך ה-mRNA הרצוי. השתמש בכלי מקוון מתאים כדי להתאים את טמפרטורת ההיתוך של היברידיות ה-RNA בין 60 ל-65 מעלות ובעל מורכבות רצף לשונית טובה. השתמש בכלי החיפוש הבסיסי ליישור מקומי כדי לחפש הכלאה צולבת פוטנציאלית של ASO עם mRNAs אחרים בטרנסקריפטום.

בחר Nucleotide BLAST, הכנס את הרצף לתיבה הריקה ובחר את האורגניזם המעניין. שמור את הפרמטרים הנותרים כברירת מחדל ולחץ על BLAST. טרנספקט תאי HEK293 במפגש של 70% בצלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר על ידי ערבוב שני מיקרוגרם של הגן המדווח עם 20 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה והוספה לתאים.

מניחים את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפני הקטיף. ביום הקציר, הסר את המדיום בעזרת פיפטה סרולוגית ושטוף במהירות את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר PBS שחומם מראש ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו למנה שישה מיליליטר PBS והניחו על קרח.

לאחר מכן חשוף את התאים לאור UV ב-100 מילי-ג'אול לסנטימטר רבוע ב-UV-crosslinker. לאחר חשיפה ל-UV, יש לגרד את התאים ואת PBS ולהעביר לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן סובב את התאים ב -250 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הסרת הסופרנטנט עם פיפטה, השעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של מאגר ליזיס מקורר מראש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש או שש פעמים תוך שמירה על הצינור על קרח. העבירו את הליזאט עם פיפטה לצינור של חמישה מיליליטר המונח על קרח וסוניקט למשך שלושה סיבובים המורכבים מהתפרצויות של 20 שניות במשרעת של 10 מיקרון עם 30 שניות של תקופות קירור על קרח. לאחר העברת הליזאט לצינורות של שני מיליליטר, צנטריפוגה ב -15, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

אוספים את הסופרנטנט ומעבירים לצינור חדש. כדי להתחיל בבידוד RNA, יש לאזן מיליגרם אחד של חרוזים מגנטיים מצומדים אוליגו (dT) ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה. הסר את הצינור מהמסובב, הנח אותו על מתלה מגנטי והסר את מאגר הליזיס.

שלבו ארבעה מיליגרם של תמצית חלבון HEK293 עם החרוזים המגנטיים המצומדים אוליגו(dT)25. מערבבים את הדגימות במרץ, ואז מדגרים במשך 10 דקות בחום של 25 מעלות צלזיוס. הנח את הצינורות על מעמד מגנטי למשך 10 שניות, ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט.

שמור את הסופרנטנט על הקרח לסבבי ההתאוששות הבאים. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה A לחרוזים ולמערבולת למשך חמש שניות. אוספים את החרוזים בעזרת מגנט ולאחר מכן שוטפים את החרוזים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה B.To לחסל את ה-RNA, להוסיף 30 מיקרוליטר של Tris-HCl 10 מילי-מולרי ולדגור את הצינור ב-80 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות עם ניעור מתמשך ב-1,000 סל"ד.

העבירו את הצינור ישירות למעמד המגנטי ואספו את הפליטה במהירות האפשרית לאחר 10 שניות בערך כדי למנוע קשירה פוטנציאלית של mRNAs לחרוזים בטמפרטורות נמוכות יותר. לאחר מכן משולבים הפליטים מסיבובים חוזרים וניתן לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי ללכוד mRNAs ספציפיים, הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים לסטרפטווידין למיליליטר אחד של מאגר קשירה ושטיפה המכיל 0.1 מיליגרם למיליליטר RNA העברת E.coli.

שיווי משקל על מסובב למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שעה יש לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 750 מיקרוליטר של מאגר כריכה ושטיפה. מערבב את הצינור, ואז הסר את מאגר השחור-לבן, ואז השהה מחדש ב-30 מיקרוליטר של חוצץ והשאר על הקרח עד לשימוש.

יש לדלל כ-35 מיקרוגרם של חלבון כולל מבידוד הפולי (A) הקודם ב-100 מיקרוליטר של מאגר קשירה ושטיפה, ולאחר מכן להוסיף 200 פיקומולים של האוליגונוקלאוטיד האנטי-סנס המתאים ולדגור ב-70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להקל על החישול. הסר את כל גוש החום מהמכשיר והנח אותו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להתקרר לאט. לאחר מכן, הוסף לדגימה את 30 המיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים מצומדים לסטרפטווידין מאוזנים, ולאחר מכן דגר את התערובת למשך 30 דקות ב-25 מעלות צלזיוס עם ניעור מתמיד ב-950 סל"ד במיקסר.

הנח את הצינור על המעמד המגנטי, הסר את הסופרנטנט ושטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 750 מיקרוליטר של מאגר כריכה וכביסה מחומם מראש ב-55 מעלות צלזיוס. הוסיפו 20 מיקרוליטר של Tris-HCl של 10 מילי-מולרית והניחו ב-90 מעלות צלזיוס עם ניעור מתמיד ב-950 סל"ד למשך 10 דקות כדי לחסל את ה-RNA. לאחר 10 דקות, הנח את הצינור במעמד המגנטי ואסוף מיד את הפליטה.

זהו ג'ל אגרוז המשמש לזיהוי mRNAs עם RT-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים בעת לכידה עם אוליגו(dT) ואוליגונוקלאוטיד אנטיסנס ל-p27 mRNAs מתמצית תאי HEK293. מוצגת גם בקרה ללא אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס. נתיבי הקלט מציגים את סך ה-RNA מהתאים המקושרים.

בנוסף, מוצגות גם תוצאות מתחרות עם poly(A). מוצג כאן ניתוח אימונובלוט של חלבונים הקשורים ל-mRNA עם נוגדנים המזהים אנטיגן R אנושי, חלבון קושר RNA לא ידוע ובטא-אקטין, שהוא חלבון בקרה שלילי. הכתם מראה כי אנטיגן R אנושי זוהה בהצלחה בבידוד פולי (A) RNA עם לכידת mRNA p27 עם אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס.

אנטיגן R אנושי לא זוהה בבידוד ביקורת ללא אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס. נתיבי הקלט מראים את החלבונים בתמצית מתאים צולבים ותוצאות מתחרות עם poly(A) מוצגות גם כן. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה אחרת כמו ספקטרומטריית מסה כדי לנתח באופן שיטתי את כל דגימת החלבון המקיימת אינטראקציה עם RNA מסוים in vivo.

חשוב לציין, TRIP היא גישה רב-תכליתית שניתן להתאים לכל סוגי ה-RNA הפוליאדניליים על פני אורגניזמים כדי להבין את הסידור הדינמי של אינטראקציות חלבון RNA. לכן, ניתן להשתמש בו כדי לחקור RNA מבוקר התפתחותי או הקשור למחלה ועשוי בסופו של דבר להוביל למטרות חדשות להתערבות טיפולית.