Name: להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: חקור את השפעות עמילואיד-β מוקדמות על חרוטי צמיחה אקסונליים בנוירונים מתרביות קורטקס מוח עכברי. הפרוטוקול מאפשר הדמיה וניתוח מיידיים של שינויים מורפולוגיים הקשורים למחלת אלצהיימר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן בחלקו על ידי מענקי מחקר של JSPS (KAKENHI 18K 07389), יפן, טקדה למדע, יפן ו קוביאשי פרמצבטיקה ושות', בע מ, יפן.

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה Sugitani בקמפוס של האוניברסיטה של טויאמה, אושרו על ידי ועדת לצורך טיפול בעלי חיים, שימוש של חיות מעבדה בקמפוס Sugitani של האוניברסיטה של טויאמה (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. התמוטטות Assay
<ol><li>ציפוי פולי-D-ליזין<ol>
<li>מעיל 8-ובכן תרבות שקופיות עם μL 400 של μg/mL 5 poly-D-ליזין (PDL) בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS), דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>הסר את הפתרון PDL ולשטוף הבארות 3 פעמים עם מים מזוקקים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נוירון תרבות24<ol>
<li>מינצ cortices מוחי טרי מבודד מן היום עובריים (E14) 14 ddY עכברים עם microscissors במדיום תרבות נוירון המכיל 12% הסוס סרום, 0.6% גלוקוז ו- 2 מ מגלוטמין (בינוני A). אל תוסיף אנטיביוטיקה. הערה: ב פרוטוקול זה, העכבר ddY משמש. זהו זן outbred נפוץ ביפן. פרוטוקול זה תרבות נוירון ניתן להחיל גם על החולדה הנוירונים קורטיקלית7,25.</li>
		<li>Centrifuge הרקמות ב g x 87 למשך 3 דקות.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע. אז בגדר, להוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין, תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C. מערבבים על-ידי הקשה כל 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף 4 מיליליטר A בינונית ומיקס על ידי הקשה.</li>
		<li>Centrifuge הרקמות ב g x 178 במשך 3 דקות.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר דגירה הרקמות עם 600 DNase U/mL ו- 0.3 מ"ג/מ"ל סויה מעכבי טריפסין מומס PBS למשך 15 דקות ב 37 º C. מערבבים על-ידי הקשה כל 5 דקות.</li>
		<li>לאחר דגירה, להוסיף 4 מיליליטר A בינונית ומיקס על ידי הקשה.</li>
		<li>Centrifuge הרקמות ב g x 178 במשך 3 דקות.</li>
		<li>לאחר הסרת את תגובת שיקוע, להוסיף 4 מיליליטר בינוני A, triturate הרקמות עם פיפטה מלוטשת פסטר.</li>
		<li>לסנן את רקמות triturated עם רשת שינוי גודל הנקבוביות 70 מיקרומטר. לאחר סינון, חישוב הצפיפות של תאים עם hemocytometer.</li>
		<li>התרבות התאים בתרבות 8-ובכן גולשים 0.8 x 104 תאים/טוב בינונית A ולתחזק אותם ב חממה2 CO עם אווירה humidified של 10% CO2 ב 37 º C.</li>
		<li>לאחר 4 שעות של culturing, להחליף את תרבות בינוני אחד המכיל 2% תוספת תרבות עצביים, 0.6% גלוקוז של 2 מ מגלוטמין (בינוני B). הערה: הטוהר של נוירונים היה כ- 75%, כפי שתואר לעיל26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התמוטטות assay27<ol>
<li>להמיס מסחרית שהושג באורך מלא עמילואיד β1-42 (Aβ1-42) במים מזוקקים-ריכוז של 0.5 מ מ, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים. לאחר הדגירה, לאחסן את הפתרון Aβ1-42 צבורים במקפיא למינוס 30 מעלות עד השימוש. הערה: הדגירה הזה הוא הכרחי עבור צבירה ורעילות של Aβ27,28,29,30.</li>
		<li>לאחר 4 ימים של תרבות עצביים, להתייחס הבארות עם 100 μL של B בינוני חדש, המכיל 0.5 μM המצטברים Aβ1-42 או הרכב פתרון (מים מזוקקים) לשעה. הערה: השפעות Aβ1-42 היו במינון-dependently עלה מ 0.1 ל 5 μM, לשיאה ב- 0.5 μM כפי שתואר לעיל27. יכול להיות שנצפו תוצאות דומות כאשר על ידי טיפול Aβ1-42 1 h אחרי 3 ימים של תרבות עצביים31.</li>
		<li>להסיר את המדיום תרבות, מיד לתקן את הנוירונים עם 4% paraformaldehyde המכיל 4% סוכרוז ב- PBS עבור h 1-37 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.</li>
		<li>לאחר קיבוע, לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS והר אותם בינונית הרכבה מימית. יבש המדיום הרכבה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-4 ימים.</li>
		<li>ללכוד את כל האזור (7.8 x 9 מ מ2) של כל טוב עם 20 X יבש המטרה עדשה במיקרוסקופ הפוכה.</li>
		<li>לסווג את neurites הארוך של כל נוירון בשלב 3 או 4 כמו אקסונים, כפי שתואר לעיל32,33.</li>
		<li>לסווג את הצמיחה קונוסים לפי הקריטריונים הבאים: צמיחה 1) עצב קונוסים חסר lamellipodia או 2) הפו filopodia פחות משלושה נחשבים התמוטט גביעי צמיחה, כפי שתואר לעיל17. הערה: גידול בריא קונוסים הם הבקיע כנקודת 0; צמיחה התמוטט קונוסים הם הבקיע כמו 1 נקודה. כלומר כיווץ הציונים מחושבים עבור כל טיפול.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. עמילואיד β Immunostaining
<ol><li>תרבות נוירונים בקליפת המוח העכבר במשך 3 ימים, כפי שמתואר בשלב 1.2.</li>
	<li>לטפל עם Aβ1 צבור-42 (5 μM) או רכב במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO.</li>
	<li>מבלי להסיר את המדיום, הוסף אמצעי שווה של 4% paraformaldehyde המכיל 4% סוכרוז ב- PBS כדי מכל קידוח, לשמור על התרבות ב 37 מעלות צלזיוס על פלטה חמה למשך 5 דקות.</li>
	<li>החלף את הפתרון μL 400 של 4% paraformaldehyde המכיל 4% סוכרוז ב- PBS, ולתחזק ב- 37 מעלות צלזיוס על הכיריים לשעה. פרוטוקול קיבוע זה שונה מן הדו ח הקודם34.</li>
	<li>לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS.</li>
	<li>בלוק עם הנסיוב עז רגילה 5% ב- PBS.</li>
	<li>דגירה נוירונים עם העכבר נגד עמילואיד β אימונוגלובולין G (IgG) (1:50) של 1% אלבומין בסרום שור ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS.</li>
	<li>דגירה הנוירונים עם פלורסצנטיות מצומדת נוגדנים משניים (1:400), 1% שור אלבומין ב- PBS בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.</li>
	<li>לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS והר אותם בינונית הרכבה מימית.</li>
	<li>לכידת תמונות פלורסצנטיות ותמונות שדה בהיר עם תאורה עקיפה על-ידי שימוש 40 X יבש המטרה עדשה מיקרוסקופ הפוכה B.</li>
</ol>3. עצב Immunostaining27
<ol><li>לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS לאחר קיבוע נוירון בתרבית, כפי שמתואר בשלב 1.3.3.</li>
	<li>דגירה הנוירונים עם העכבר אנטי-tau-1 IgG (שבערך), ארנב microtubule אנטי המשויך חלבון 2 (MAP2) IgG (שבערך) 5% עז נורמלית בסרום, 0.3% t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol ב- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS.</li>
	<li>דגירה הנוירונים עם פלורסצנטיות מצומדת נוגדנים משניים (1:400), 0.3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol ב- PBS בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.</li>
	<li>לשטוף את הנוירונים 3 פעמים עם PBS, והר באמצעות בינוני של הרכבה מימית.</li>
	<li>לכידת פלורסצנטיות דיפרנציאלית ותמונות חדות (DIC) הפרעה על-ידי שימוש 20 × יבש המטרה עדשה מיקרוסקופ הפוך א</li>
</ol>4. חיים תא הדמיה27
<ol><li>מעיל המבוסס על זכוכית מנות עם 500 μL של PDL (5 μg/mL), כמתואר בשלב 1.1.1. הערה: ב פרוטוקול זה, מנות ביתיות המבוסס על זכוכית שימשו. כלים מבוססי-זכוכית זמינים מסחרית יכול לשמש גם עבור הדמיה בשידור חי. מנות ביתיות המבוסס על זכוכית הוכנו כדלקמן: 1) תעשה חור כ 1.4 מ מ קוטר במרכזה של צלחת 35 מ מ עם אגרוף ביד ולאחר 2) לצרף את coverslip של זכוכית (קוטר 22 מ מ) לחלק האחורי של המנה עם סיליקון.</li>
	<li>לשטוף הצלחות עם מים מזוקקים, כפי שמתואר בשלב 1.1.2, תרבות הנוירונים קורטיקלית בצלחת זכוכית מבוססי-3 x 104 תאים/תבשיל עם A בינוני, כפי שמתואר בשלב 1.2.</li>
	<li>לאחר 4 ימים של התרבות תאים, להחליף את המדיום 2 מ"ל של מדיום חדש B, והעברה המנה כדי הפוכה מיקרוסקופ א שמור על התרבות באווירה humidified של 10% CO2 ב 37 º C.</li>
</ol>5. אנדוציטוזה ניסוי
<ol><li>תרבות נוירונים בקליפת המוח את העכבר כפי שמתואר בשלב 1.2.</li>
	<li>ארבעה ימים לאחר מכן, החלף את המדיום μL 100 של מדיום חדש B המכיל 20 μM פלורסצנטיות רגש קרום 1 דקות.</li>
	<li>להוסיף 1 μL 0.05 מ"מ צבורים Aβ1-42 (סופי 0.5 μM), תערובת או רכב (מים מזוקקים) פתרון על-ידי pipetting. תקופת דגירה של 20 דקות.</li>
	<li>להסיר את המדיום. ולשטוף את בארות פעמיים עם בינוני B כי כבר מראש ומחוממת ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לתקן, לשטוף, והר הנוירונים כפי שתואר בשלבים 1.3.3 ו 1.3.4.</li>
	<li>לכידת פלורסנט ותמונות DIC עם 63 X עדשה המטרה שמן על מיקרוסקופ הפוך א</li>
	<li>לכמת הצפיפות של אזור בדיקה-חיוביות ממברנה זריחה בחרוט גידול בריא כל באמצעות תוכנה תמונה.</li>
</ol>6. גנים תרביות תאים
<ol><li>להכין נוירונים בקליפת המוח כפי שמתואר בשלב 1.2. לאחר השלמת השלבים 1.2.1 כדי 1.2.10, centrifuge את הנוירונים ב g x 178 במשך 3 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 4 מ של Ca2 +-חינם ו- Mg2 +-חינם של הנקס מאוזנת תמיסת מלח (CMF-HBSS), ומערבבים על ידי pipetting.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב g x 178 במשך 3 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 4 מיליליטר CMF-HBSS ומערבבים על ידי pipetting. בשלב הבא, לחשב את צפיפות התאים, כפי שמתואר בשלב 1.2.10.</li>
	<li>להעביר 5 x 106 תאים, צינור 1.5 מ ל ו צנטריפוגה ב 1,677 x g עבור 1 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 100 μL של תרביות תאים פתרון עם תוספת μg 3 של ה-DNA פלסמיד קידוד EGFP או EGFP-AP180 קצה קרבוקסילי ומערבבים על ידי pipetting.</li>
	<li>להעביר את הפתרון שלעיל (שלב 6.6) cuvette מוסמך, transfect עם electroporator, על-פי הפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>מיד לאחר תרביות תאים, להוסיף 500 μL בינוני A cuvette ולהעביר את הפתרון צינור 1.5-mL עם פיפטה מוסמך. בשלב הבא, לחשב את צפיפות התאים, כפי שמתואר בשלב 1.2.10.</li>
	<li>התרבות התאים שקופית 8-ובכן תרבות-0.8 x תאים4 10/טוב, כפי שתואר בשלבים 1.2.11 ו- 1.2.12.</li>
	<li>לאחר 4 ימים של תרבית תאים, לבצע assay התמוטטות כפי שמתואר בשלב 1.3.</li>
</ol>

המחבר אין לחשוף.

הפרוטוקול המתוארים במחקר זה מאפשר התבוננות תופעות בראשית צמיחת עצב קונוסים לאחר טיפול Aβ1-42. Aβ1-42 המושרה אנדוציטוזה ב צמיחת עצב קונוסים בתוך 20 דקות, התמוטטות חרוט הצמיחה נצפתה בתוך h 1 של הטיפול. אנדוציטוזה הזה היה כנראה בתיווך clathrin. באמצעות פרוטוקול זה, עיכוב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin אושר כדי למנוע התמוטטות חרוט הצמיחה Aβ1-42-induced, ניוון עצב נוירונים בתרבית27. בנוסף, עיכוב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin הקלוש Aβ1-42-induced ניוון עצב ו זיכרון גירעונות ויוו<sup class="xref"...

משקעי עמילואיד-β (Aβ) נמצאים במוח של חולי מחלת אלצהיימר (AD) והם נחשבים מטרה קריטית לספירה1 לשבש רשתות עצביים, המוביל אל זיכרון ליקויי2,3,4. מועמדים סמים קליניים רבים הוכחו יעיל למנוע ייצור עמילואיד-β (Aβ) או להסיר משקעים Aβ. עם זאת, איש לא הצליח לשיפור הזיכרון הפונקציה ב- AD חולים5. Aβ כבר נצבר במוח לפני תחילתה של ליקויי זיכרון6; לכן, הפחתת רמות Aβ במוחם של חולי מפגין ליקויי הזיכרון עשוי להיות לא יעיל. Aβ התצהיר נוכחת חולי אלצהיימר פרה; עם זאת, חולים אלו להציג רק לעתים רחוקות עצביים ניוון וזיכרון גירעונות6. יש פער-זמן בין התצהיר Aβ ליקויי הזיכרון. לכן, אסטרטגיה קריטי למניעת לספירה חוסם רעילות Aβ איתות כבר בשלבים המוקדמים של AD, לפני הפיתוח של זיכרון גירעונות. Aβ התצהיר המניע האקסון ניוון7,8,9,10,11,12,13, דבר שעלול להוביל לשיבוש רשתות עצביות, ליקוי הקבע של פונקציית הזיכרון. מחקרים רבים חקרו את המנגנונים רעילות Aβ; לדוגמה, האקסונים מנוונת של המוח עכברים לספירה הוכחו הגדילו autophagy14. הפעלת Calcineurin דווחה כמנגנון אפשרי של Aβ-induced ניוון עצב15; עם זאת, הגורם הישיר של ניוון עצב נותר עלום.
מחקר זה מתמקד ההתמוטטות של קצות עצב הנקרא צמיחה קונוסים. נפילת קונוסים צמיחת עצב יכול להיגרם על ידי דוחי צמיחת עצב, כגון semaphorin-3A ו- ephrin-A516,17,18,19,20. קצות עצב dystrophic כמו התמוטטות נצפו במוחם של המודעה חולים21,22. בנוסף, כישלון של תפקוד חרוט הצמיחה יכול לעורר ניוון עצב23. עם זאת, לא ידוע אם Aβ גורם לקריסת חרוט הצמיחה. לפיכך, מחקר זה מציג פרוטוקול הרומן לבחון את ההשפעות המוקדמות של Aβ בנוירונים בתרבית ולחקור התמוטטות חרוט הצמיחה הנוצרות על-ידי Aβ.

<table><tbody><tr><td>עכברי ddY</td><td>SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופית תרבית שמונה בארות</td><td>פלקון</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>פולי D ליזין</td><td>וואקו</td><td>168-19041</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית, מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>סרום בית</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Wako</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>0.05% טריפסין</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>DP</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה</td><td>Gibco</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עם 70 & מיקרו; m גודל רשת, מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CO2 אינקובטור</td><td>Astec</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>עמילואיד ובטא; 1-42</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9810</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז&nbsp;</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה מימי, Aqua-Poly/Mount</td><td>polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך A</td><td>Carl</td><td>Zeiss Axio Observer Z1&nbsp;</td><td>מחובר עם AxioCam MRm, יחידת חימום XL S, מודול CO2 S1 ו-TempModule S1</td></tr><tr><td>Objective Plan-Apochromat 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901</td><td></td></tr><tr><td>Objective Plan-Apochromat 63x</td><td>Carl Zeiss</td><td>440762-9904</td><td></td></tr><tr><td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2 IgG</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>anti-tau-1 IgG</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-עמילואיד ובטא; נוגדן</td><td>IBL</td><td>10379</td><td>שיבוט 11A1</td></tr><tr><td>סרום עזים רגיל</td><td>Wako</td><td>143-06561</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Wako</td><td>010-25783</td><td></td></tr><tr><td>t-octylphenoxyethoxyethanol</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG מצומד עם AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי ארנב IgG מצומד עם AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>NISSIN</td><td>NHP-M30N</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>סיליקון</td><td>RTV Shin-Etsu</td><td>KE42T</td><td></td></tr><tr><td>אגרוף יד</td><td>רופר וויטני</td><td>מס. </td> בדיקת ממברנה פלואורסצנטית XX<td></td></tr><tr><td>, FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+- ו-Mg2+-free תמיסת מלח מאוזנת של הנקס</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טרנספקציה, תמיסת נוקלאופקטור</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורטור, נוקלאופקטור I</td><td>Amaxa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך B</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת תמונה, ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

עמילואיד-β (Aβ) גורמת ליקויי הזיכרון מחלת אלצהיימר (AD). למרות הרפוי הוכחו להפחית את רמות Aβ במוחם של חולי אלצהיימר, אלה לא לשפר זיכרון פונקציות. מאז Aβ אגרגטים במוח לפני הופעתו של ליקויי הזיכרון, מיקוד Aβ עשוי להיות יעיל לטיפול בחולי לספירה אשר כבר תערוכת זיכרון גירעונות. לכן, איתות במורד הזרם עקב Aβ התצהיר לחסום לפני פיתוח לספירה. Aβ גורם ניוון עצב, שמוביל שיבוש רשתות עצביים, ליקויי הזיכרון. למרות שיש מחקרים רבים על המנגנונים רעילות Aβ, המקור של רעילות Aβ נותר עלום. כדי לסייע בזיהוי המקור, אנו מציעים הרומן פרוטוקול העושה שימוש במיקרוסקופ ג'ין תרביות תאים, תא חי הדמיה כדי לחקור מוקדם השינויים שנגרמו על ידי Aβ ב צמיחת עצב קונוסים של נוירונים בתרבית. פרוטוקול זה חשף כי Aβ המושרה בתיווך clathrin אנדוציטוזה בתוך גביעי צמיחת עצב ואחריו התמוטטות חרוט הצמיחה, הוכחת כי עיכוב של אנדוציטוזה מונעת Aβ רעילות. פרוטוקול זה יהיה שימושי ללמוד את ההשפעות המוקדמות של Aβ, עלול להוביל יותר יעיל, מונעת טיפול לספירה.

ב פרוטוקול זה, Aβ1-42, נדגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים לפני השימוש, כי דגירה של Aβ1-42 שהיה נחוץ לייצור צורות רעילים27,28,30,35. לאחר דגירה הזה, נצפו צורות צבורים של Aβ (איור 1 א'). בעבר דווח כי דגירה דומה של Aβ1-42 המיוצר fibril בצורת Aβ36. לאחר הטיפול עם Aβ1 הזה צבור-42, immunostaining עם נוגדן עבור אול...

כאן מוצג פרוטוקול לחקור את ההשפעות המוקדמות של עמילואיד-β (Aβ) במוח. זה מראה Aβ גורם אנדוציטוזה בתיווך clathrin וכיווץ של צמיחת עצב קונוסים. הפרוטוקול שימושי בלימוד ההשפעות המוקדמות של Aβ על צמיחת עצב קונוסים, עשוי להקל על מניעת מחלת אלצהיימר.

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחקר מחלת האלצהיימר, במיוחד האירועים המוקדמים המעורבים בקריסת חרוט צמיחה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לאפשר לדמיין ולנתח קונוסים צמיחה אקסונאלי מיד לאחר טיפול עמילואיד בטא. התחל על ידי שימוש מיקרו מספריים כדי לטחון קליפת המוח מבודד טרי מן העובר יום-14 עכברים באמצעי תרבות נוירון ללא אנטיביוטיקה.לאסוף את הרקמות צנטריפוגה את הרקמות ב 87G במשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהוסיף שני מיליליטר של 0.05% טריפסין לכדור. דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ומערבבים על ידי הקשה כל חמש דקות.לאחר 15 דקות, מוסיפים ארבעה מיליליטר של בינוני A כדי לנטרל את טריפסין, ומערבבים על ידי הקשה. ואז צנטריפוגה הרקמות ב 178 פעמים G במשך שלוש דקות. לאחר הסרת supernatant, מוסיפים DNAse ו פתרון מעכבי טריפסין סויה דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב כל חמש דקות כמו קודם.כאשר זמן הדגירה חלף, להוסיף ארבעה מיליליטר של בינוני A.Mix ו צנטריפוגה כמו קודם. לאחר הסרת supernatant, להוסיף ארבעה מיליליטר של בינוני A ו triturate את הרקמות עם פיפטה פסטר מלוטש עד לא פסולת נצפתה. לאחר מכן, סנן את הרקמות המשולשות עם רשת בגודל נקבוביות של 70 מיקרון.לאחר הסינון, לספור את התאים עם hemocytometer ולחשב את צפיפות התא. פיפטה 0.8 פעמים 10 לתאים הרביעיים במדי

visualizing-axonal-growth-cone-collapse-early-amyloid-effects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

סרטון זה מדגים את יצירתו של מודל פגיעה עצבית בנוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכברים. הוא מתאר את השלבים המעורבים בגרימת פגיעה עצבית באמצעות NMDA, אגוניסט קולטן נוירוטרנסמיטר מעורר, וגליצין, אגוניסט משותף. NMDA וגליצין נקשרים לקולטנים עצביים ספציפיים, גורמים לגירוי יתר שלהם וכתוצאה מכך זרם סידן תוך תאי מסיבי, מה שמוביל לנזק לתאי עצב ולמוות.

מידול פגיעה עצבית בתאי עצב גרגיריים צרבלריים ראשוניים בעכבר

סרטון זה מדגים הערכה חוץ גופית של קריסת חרוט גדילה עצבי על ידי צברי עמילואיד-β (Aβ). טיפול בנוירונים עם אגרגטים Aβ גורם לערעור יציבות השלד הציטו-שלד, מה שמוביל לקריסת מדוכי צמיחה בקצה האקסונים. התאים המטופלים מושווים לתאי ביקורת כדי להעריך את מידת קריסת חרוט הגדילה.

הערכה חוץ גופית של β עמילואיד מצטבר על קריסת חרוט גדילה עצבי

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעירוי מוח סטריאוטקסי ישיר של עמילואיד-בטא. מתודולוגיה זו מספקת מודל עכבר in vivo חלופי לטיפול בהשפעות קצרות הטווח של עמילואיד-בטא על נוירונים במוח.

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מערכת מבוססת תא משכפל היווצרות של אלפא-synuclein אגרגטים ויוו. תכלילים תאיים אלפא-synuclein הם זרועה בנוירונים הראשי על-ידי הפנמת האמונה, הפצת אקסוגני מנוהל אגרגטים מקורי microsomes-הקשורים אלפא-synuclein מבודד מן העכברים הטרנסגניים חולה אלפא-synuclein.

הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

חקור את השפעות עמילואיד-β מוקדמות על חרוטי צמיחה אקסונליים בנוירונים מתרביות קורטקס מוח עכברי. הפרוטוקול מאפשר הדמיה וניתוח מיידיים של שינויים מורפולוגיים הקשורים למחלת אלצהיימר.

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

גלה סרטונים נוספים