השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה מהשאלות החשובות בתחום ייצור תהליכי ביו לגבי היבטים של אפיון קו התאים ותווך ואופטימיזציה של תהליכים. היתרונות של טכניקה זו הם שהיא מספקת שליטה רבה יותר בבקבוקי טלטול ומאפשרת אוטומציה וביצועים של מספר גדול של מחקרים בקנה מידה קטן להפקת נתונים מהירה. הדגמת ההליך תהיה, סאי רשמיקה ולגולה וקיסי כהנהורסט, עמיתי מחקר במעבדה שלי.

התחל על ידי טבילה במלאי נתעב של שלוש פעמים 10 לתאי המופע השביעי למיליליטר של מדיום הקפאה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. כאשר רק רסיס קטן של קרח נשאר, בעדינות צינור ההשעיה התא מופשר במהירות כמה פעמים ולהעביר מיליליטר אחד של תאים לתוך סטרילי 125 מיליליטר אוורור לנער בקבוקון המכיל 29 מיליליטר של מדיום OptiCHO. מניחים את הבקבוק באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס וב-8%CO2 עם טלטול של 130 סל"ד.

תת-תרבות התאים לאחר 72 שעות ב-100 מיליליטר של מדיום טרי של 37 מעלות צלזיוס בבקבוק ספינר של 125 מיליליטר לעוד דגירה של 72 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-8%CO2 עם ערבוב ב-70 סל"ד. ביום השלישי של תת-התרבות, הוסיפו מדיום טרי שחומם מראש לבקבוק הספינר כדי לשמור על התאים בכדאיות של לפחות 90% ל-24 שעות ספורות של תרבות. למחרת בבוקר, לחץ על סמל שולחן העבודה המרוחק ולחץ על התחבר.

כאשר שולחן העבודה המרוחק מחובר, פתח את תוכנת מונה התאים והתקן ריג'נט פאק חדש. לאחר מכן, רוקנו את הפסולת הכחולה של טריפאן והתנו את המערכת. לאחר מכן, צמצם את החיבור המרוחק ופתח את תוכנת כור המיקרו ביו באמצעות ניסוי קיים כתבנית ליצירת ניסוי חדש.

לפני תחילת הריצה, הגדר את הלוחות המשמשים במהלך הריצה בחלק החיקוי של התוכנה והצב 12 כלי תרבות סטריליים בכל תחנת תרבות. מניחים צלחות מהדק autoclaved על גבי כלי וממקמים את צלחות מערבבים על גבי לוחות מהדק לוודא כי כל סיכה מוכנסת היטב. לאחר מכן, לאבטח את לוחות מהדק עם ברגים ו nobs מסופק.

כדי להפעיל את המערכת לסרוק את הברקוד המסופק עם כל כלי תרבות. המערכת תתחל ותבדוק את נוכחות כלי השיט המתאימים. הגדר את בקרת הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ואת ערבוב 1, 000 סל"ד ולהדליק את צג חמצן PH מומס.

לאחר מכן, בצע את תוכנית הטעינה הבינונית. כאשר כל המדיום נטען, 35 microliters של ANTIFOAM לשעבר תא יתווספו מצלחת Antifoam לכלי התרבות. לאחר 30 דקות להתחיל להקליט את החמצן מומס PH בתוך התקשורת התרבותית, המאפשר חמצן מומס להגיע לנקודת סט של 50% לאחר שקילה חמצן מומס, להפעיל את התוספות בסיס הרקע כדי להשיג נקודת PH של 7.1 עבור כל כלי התרבות.

למחרת בבוקר, לבצע את הצעד PH מושהה ולהעביר את כל התוכן של בקבוק ספינר לתוך צינור חרוט סטרילי 250 מיליליטר עבור צנטריפוגה. תוסיפו את גלולה במדיום טרי מספיק כי הצפיפות הסופית תהיה אחת פעמים 10 לתאי CHO השישי למיליליטר לאחר הוספת inoculum לכלי התרבות ולהוסיף את התאים התלויים לתוך בארות המתאימות של צלחת סטרילית 24 גם. מוסיפים שלושה מיליליטר של inoculum לכל באר ומ מניחים את צלחת inoculum על השולחן המיועד בתוך מכסה המנוע.

לאחר מכן, תן לכלי התרבות לצייד לפחות שעה וליזום את צעד ספירת חמשת התאים לשעבר בתוכנית. לניתוח יומי של חומרים מזינים ומטבוליטים ביום השני מניחים את לוחות מחזיק הצינור לדוגמה על הסיפונים המיועדים להם ועומסים צינורות מיקרוצנטריפוגה פתוחים למחזיקים המתאימים. לאחר מכן, מניחים את הדגימות במגש המנתח, כדי לבצע את ניתוח החומרים המזינים.

כדי לסיים את הריצה תחילה לכבות את בקרת הטמפרטורה ואחריו את התסיסה. עצור את בקרת החמצן המומסת PH ותוספות בסיס הרקע, את כל הפקדים האחרים ואת צג המערכת. מוציאים את המהדק ומערבבים צלחות, מסירים את כלי התרבות ומברגים את צלחות הייבוש לתחנת התרבות.

לאחר מכן, בצע את מחזור הייבוש של שעתיים בתוכנית;לחיצה על עצור בתוכנה bioreactor לאחר מחזור הייבוש סיים. כדי לקצור את התאים להעביר את נוזל תרבות התא מכלי הכור לתוך צינורות חרוט המתאים עבור צנטריפוגה ולסנן את supernatants דרך סטרילי 0.22 מיקרומטר PVDH מסננים. לאחר מכן, להעביר מיליליטר אחד של כל תרבות תא סטרילי על טבעי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר עבור אחסון שלילי 20 מעלות צלזיוס עד ניתוח טיטר.

כדי למדוד את titers IgG של הדגימות, הפעל תחילה את מערכת biosensor סיוע חלבון. לאחר המנורה התחממה לפחות שעה אחת, לאפשר את הדגימות כדי לצייד את טמפרטורת החדר presoak טיפ עזר חלבון אחד לכל מדגם במדיום תא טרי לפחות 30 דקות. לאחר מכן, להגדיר את טמפרטורת הצלחת ל 26 מעלות צלזיוס.

טען את הדגימות לתוך המערכת והפעל את ההטענה באמצעות ברירת המחדל של רגישות גבוהה עם יצירה מחדש בתוכנת רכישת הנתונים. באמצעות מונה התאים המשולב, ניתן להשיג מדי יום את צפיפות התאים הממוצעת ואת הוויאציות עבור כל תנאי התרבות. באמצעות מנתח התזונה אנו יכולים גם להשיג את הפרופילים התזונתיים ותוצר הלוואי המדגימים את ההיתכנות של ניטור תכונות אלה במערכת הכור microbio.

כמו כן, ניתן לכמת את הפרודוקטיביות הכוללת של תרבות התאים בתנאי התרבות השונים של עניין באמצעות מערכת הביו-סנסור של סיוע החלבון כפי שהוכח. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור שהפרוטוקול פועל רק אם התיכנות נעשה כראוי; בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו: כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה ופיזור אור רב-זוויתי כדי לענות על שאלות נוספות לגבי המאפיינים הפיזיים והכימיים של המוצר המיוצר.