השימוש Autometallography כדי להתאים לשפה וכסף למחצה לכמת ברקמות נושפים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטוקסיקולוגיה הסביבתית על הפצות תת-איברים וריכוז מתכות כבדות בתוך מערכות ביולוגיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי AMG היא מתודולוגיה קלה לשימוש וזול, כי הוא מסייע יקר ערך לחקירת מתכות כבדות ברקמות. אנחנו משתמשים ברקמות מדולפינים ולווייתנים כדי להדגים את הפרוטוקול.

עם זאת, אנו מאמינים כי ניתן להשתמש בפרוטוקול במגוון מיני בעלי חיים. הדגמת ההליך עם וון-טה לי תהיה שון תאנג, קלינאית מהמכון שלנו. התחל על ידי איסוף זוג תואם רקמות הכבד והכליות לניתוח AMG מ cetacean תקוע, ותיקון הרקמה ב 10 פעמים את הנפח של 10% ניטרלי אוגר פורמלין במשך 24 עד 48 שעות.

לאחר מכן, השתמשו בהבי מיקרוטום חד פעמיים מפלדת אל-חלד כדי לקצץ את רקמות הכבד והכליות הקבועות בפורמלין לשני סנטימטרים בסנטימטר אחד, שלושה מילימטרים, והמקמו את שני חלקי הכבד והכליות מאותו אדם לאותם קלטות מסומנות. ייבש את החלקים במעבד רקמות באמצעות סדרה של טבילות אתנול וקצילן מדורגות, ואחריו טבילות פרפין של שעה ושעה. לאחר טבילת הפרפין בת השעתיים, מעבירים את הרקמות לתחתית תבניות ההיסטולוגיה מפלדה ומטביעים את דגימות הרקמה המיובפלות בפרפין מומס טרי.

מצננים את גושי הרקמות הקבועים בפרפין על צלחת קרה, עד שהפארפין מתגבש, וחותכים כל בלוק במיקרוטום עד שפני הרקמה נחשפים. מצננים את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ומשיגים מקטעי רקמת חמישה מיקרומטר במיקרוטום. באמצעות פינצטה ומברשות, להרים את הסרטים של קטע רקמות כפי שהם נרכשים, ולצוף אותם על פני השטח של 45 מעלות צלזיוס פעמיים מזוקקים אמבט מים, עד שהם יכולים להיות מופרדים, והמקום על מגלשות מיקרוסקופ בודדות.

לאחר מכן, מניחים את השקופיות על שקופית חמה במשך שעה אחת, ב 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מקם את השקופיות במדפים לשקופיות, ורוקן את הפרפיניזציה של החלקים בשלוש מנות כתמים שונות המכילות 200 עד 250 מיליליטר של קסילן טהור ללא קסילן עבור דגירה של שמונה וחמש ושלוש דקות. לחות את הדגימות דה parrafinized במנות כתמים שונות של פתרונות אתנול מדורגים, ואחריו שטיפה במים מזוקקים כפול.

יש לשטוף את החלקים פעם אחת ב-PBS בתוספת 5%Triton X 100, מספר פעמים ב-PBS בלבד, ופעם אחת במים מזוקקים כפולים טריים למשך 30 שניות לכביסה. לאחר הכביסה האחרונה, סמן כל דגימה עם 300 מיקרוליטרים של פתרון ערכת שיפור כסף מעורב, במשך לא יותר מ 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות עם מים מזוקקים כפולים, ולהכתים את החלקים ב 300 microliters של hematoxylin לכל שקופית, במשך 10 שניות.

לשטוף את המגלשות עם מי ברז זורמים. יבש אותם ולהוות את החלקים עם מדיום הרכבה. לאחר מכן, ללכוד 10 תמונות היסטולוגיות אקראיות של כל קטע רקמה, תחת המטרה 40X של מיקרוסקופ אור.

כדי לנתח את האוטוביוגרפיה, או AMG, חיוביות של הדגימות, לפתוח את התמונות בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה, ולבחור תמונה, סוג, מחסנית RGB, כדי לפצל את התמונה הראשונה לתוך ערוצי צבע אדום, כחול וירוק. בערוץ הכחול, בחרו תמונה, התאם וסף, כדי למדוד את אחוז האזור עם אותות חיוביים AMG בכל תמונה, ולהתאים ידנית את ערך החיתוך לסף של כל תמונה בהתבסס על נוכחותם של אזורים חיוביים כוזבים בגרעין, או בתאי דם אדומים. לחץ על נתח והגדר מידות ובדוק את שבר האזור כדי לציין ששבר האזור נרשם.

לחץ על נתח ולמדוד כדי להציג את אזור האחוז החיובי של כל עמודת אזור אחוז תמונה היסטולוגית בחלון התוצאות. כדי להעריך את המתאם בין התוצאות של ספקטרוסקופיית מסת פלזמה מזוגגת באופן אינדוקטיבי לבין ערכים חיוביים של AMG, פתח את תוכנת הגרפים המתאימה. צרו קובץ פרוייקט חדש ובחרו XY ומתאם.

הזן את התוצאות של ספקטרוסקופיית מסת פלזמה מזוגגת באופן אינדוקטיבי וניתוחי AMG, ובחר ניתוח, ומתאם, כדי לנתח את עוצמת הקשר בין תוצאות הניתוח על ידי ניתוח מתאם פירסון. בפרמטרים, חלון רגרסיה לא ליניארית, בחר מודל רגרסיה שונה בדף מתאים ובחר את שיטות ההשוואה בדף ההשוואה. כלול את הסכום הנוסף של מבחן ריבועים F וקריטריון המידע של Akaike.

על פי התוצאות של שיטות ההשוואה, בחר מודל רגרסיה מתאים יחסית בהסטאי הכסף היסטולוגי cetacean, ולהשתמש בהסטה כדי להעריך את ריכוזי הכסף של הכבד cetacean ורקמות הכליות, עם ריכוזי כסף לא ידועים. אותות AMG חיוביים כוללים גרדנים בגודל מגוון, חום לשחור בציטופלסמה של hepatocytes ותאי קופפר, ומדי פעם אמורפי, צהוב זהוב לאותות AMG חיוביים חומים בלומן וממברנה במרתף של כמה צינוריות כליות פרוקסימליות. יש מתאם חיובי בין התוצאות של ספקטרוסקופיית מסת פלזמה מזוגגת באופן אינדוקטיבי וערכי חיוביות AMG ברקמות הכבד והכליות המנותחות, עם רגרסיה ליניארית מועדפת דרך המקור, על פי הסכום הנוסף של ריבועים F מבחן, וקריטריון המידע של Akaike.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי שיטת AMG היא שיטה חסידה, ויש להשתמש בה עם שיטה ספציפית אחרת, כגון ICPMS, לניטור ההרכב בפועל של מתכות כבדות ברקמות.