דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי NK לגבי התפקיד והתפקוד של גנים ומסלולים ספציפיים המווסתים את תפקוד תאי האפקטור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אחוזי ההצלחה הגבוהים שלה בהשוואה לגישות תלויות DNA המאפשרות נוקאאוט יעיל ביותר של אחד הגנים הרלוונטיים ביותר מבחינה קלינית בטיפול בתאי NK. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אימונותרפיה של גידולים מוצקים וגידולי מוח המבטאים TGF-beta כאמצעי לבריחה חיסונית.

עבור התמרת תאי NK ראשונית, דגרו שלוש פעמים 10 לחמשת תאי ה-NK המבודדים הטריים למיליליטר של מדיום RPMI בתוספת 100 IU למיליליטר של IL2 לכל בקבוק T75 למשך ארבעה ימים והחליפו את המדיום כל יומיים ויום לפני ההעברה. להמרת תאי NK מורחבת, עורר את תאי ה-NK הראשוניים ביום האפס עם תאי הזנה K562 המבטאים IL21 הקשורים לממברנה ביחס של אחד לאחד ומחליפים את המדיום כל יומיים ויום לפני ההתמרה. ביום האלקטרופורציה, מלאו בקבוק T25 אחד בשמונה מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת 100 יחב"ל למיליליטר IL2 לכל מצב תא ניסוי והניחו את הצלוחיות באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

בזמן שהמדיום מתאזן, הוסף שלוש עד ארבע פעמים 10 לתאים השישיים לכל 26 מיקרוליטר של תערובת התמרה לצינור חרוטי וגלול את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים ב-12 מיליליטר PBS סטרילי לכל שטיפה כדי להסיר את כל ה-FBS ממתלי התאים. בזמן שטיפת התאים, השעו מחדש כל CRISPR RNA ו-tracrRNA לריכוזים סופיים של 200 מיקרו-מולרים.

מערבבים 2.2 מיקרוליטר מכל CRISPR RNA עם נפח אחד של 200 מיקרו-מולרי של tracrRNA לדגימה ומחממים את הדגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הניחו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר ואחסנו את קומפלקסי ה-CRISPR RNA/tracrRNA בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש בהם. כדי ליצור את קומפלקסי הריבונוקלאופרוטאין, הוסף אנדונוקלאז Cas9 לקומפלקס ה-CRISPR RNA/tracrRNA המתאים עם מערבולת של 30 עד 60 שניות ודגר את קומפלקסי הריבונוקלאופרוטאין Cas9 המתקבלים בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות.

לאחר הכביסה האחרונה, הוסף את כל נפח תוסף האלקטרופורציה מערכת P3 של תמיסת Nucleofector והשהה מחדש כל כדור תא ב-20 מיקרוליטר של תמיסת 4D-Nucleofector הראשונית P3 תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר. הוסף מיד חמישה מיקרוליטר מכל קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין לתרחיף התאים המתאים והוסף מיקרוליטר אחד של משפר אלקטרופורציה Cas9 מיקרו-מולרי לתערובת התאים של קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין Cas9. העבירו 26 מיקרוליטר מתמיסת תאי ריבונוקלאופרוטאין Cas9 לבארות בודדות של רצועת נוקלאוקובט והקישו בעדינות על הרצועה כדי לוודא שהדגימות מכסות את החלק התחתון של כל באר.

לאחר מכן התחל את תוכנית מערכת 4D-Nucleofector EN138. בתום ההתמרה תנו לתאים לנוח במשך שלוש דקות. לאחר מכן הוסיפו 80 מיקרוליטר של מדיום התרבית המאוזן מראש לכל קובטה והעבירו בעדינות את הדגימות לבקבוק אחד לכל מצב בדגירה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 48 שעות של תרבית, חלץ את ה-DNA הגנומי מחמש פעמים 10 לחמשת התאים המומרים לבדיקת מחיקת גנים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר מכן לעורר את שאר התאים המומרים עם תאי הזנה טריים המבטאים IL21 הקשורים לממברנה ביחס של אחד לאחד ולחלץ את ה-RNA לאחר חמישה ימים של תרבית משותפת על פי פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותי. ניתוח ציטומטריית זרימה מגלה כי תוכנית EN138 מביאה לאחוז הגבוה ביותר של כדאיות התא ויעילות ההתמרה של תוכניות מערכת Nucleofector הזמינות.

לדוגמה, באמצעות ה-RNA המנחה המסופק מסחרית, HPRT1 אנושי נוקאאוט בהצלחה בתאי NK אנושיים מורחבים. בנוסף, ריבונוקלאופרוטאינים Cas9 המכילים RNA2 מדריך, RNA1 מנחה בתוספת RNA2 מנחה ומנחה RNA3 מציגים נוקאאוט מוצלח של קולטן TGF-beta שני גנים אקטודומיין בעוד ש-RNA1 מנחה לבדו אינו גורם למחיקות החדרה הניתנות לזיהוי של T7E1. ואכן, שימוש בתוכנית EN138 לאלקטרופורציה של ריבונוקלאופרוטאין Cas9 מביא להפחתה של 60% בביטוי שני mRNA של קולטן TGF-beta בתאים שהומרו באמצעות תוכנית זו.

יתר על כן, תרבית משותפת של התאים המומרים עם TGF-beta וקו תאי מדולובלסטומה ראשוני אנושי אינה משפיעה באופן משמעותי על הציטוטוקסיות של תאי NK בהשוואה לתאי ביקורת שלא טופלו ב-TGF-beta, ומתמודדת עם מחסור מקביל בקולטן TGF-beta שני פונקציה בתאים ששונו לריבונוקלאופרוטאין Cas9 ברמת החלבון. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעצב מספר RNA מנחים שונים כדי למצוא את התוצאה הטובה ביותר לעריכת גנים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף DNA או בדיקת מוטציה T7E1 כדי לענות על שאלות נוספות לגבי יעילות עריכת הגנים או כיצד לקבוע מוטציות גנטיות פוטנציאליות מחוץ למטרה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונותרפיה של סרטן לחקור את הפוטנציאל לשימוש בתאי NK ערוכים גנטית בטיפול בסרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע עריכת גנים של תאי NK אנושיים ראשוניים.

למידע נוסף על הרחבת תאי NK לאחר תהליך זה, אנא עיין במאמר הקודם שלנו ב- Jove. אל תשכח שעבודה עם דם אנושי עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות אוניברסליים לבריאות ובטיחות בעת ביצוע הליך זה.