שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית
27 בספטמבר 2018
אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.
שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של המערכת, כגון מנגנון הוויסות שמאחורי הרשת המיטוטית והמאפיינים והפונקציות הדינמיים של שעון מחזור התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא תיצור כמות גדולה של טיפות עם מחזורי תאים מרובים בכל אחד, מתן לנו מסגרת תפוקה גבוהה עבור מניפולציה כמותית וניתוח. ראשית, השליכו קבוצות ביצים שיש להן גבולות לא ברורים בין מוטות בעלי חיים וצמחייה או כתמים לבנים לא סדירים על גבי מוטות בעלי חיים.
לאחר מכן, בחר קבוצה מתאימה של ביצים מצפרדע אחת, והעבר את הביצים לסקייה של 600 מיליליטר. יוצקים עודף של חיץ MMR 0.2x, ומוסיפים בעדינות ציסטאין במאגר תמצית 1x לביצים. לאחר מכן, לנער את הסלק במרץ ביד כדי להסיר את מעילי ג'לי של הביצים.
חזור על שטיפה זו שלוש פעמים עם סך של 800 מיליליטר של חיץ ציסטאין או עד הביצים לצבור להתיישב בתחתית הפוף. לאחר הסרת מעיל הג'לי, לשטוף את הביצים ארבע פעמים בליטר אחד של 0.2x פתרון MMR. השתמש פיפטה זכוכית להרים ולהשליך את הביצים להפוך לבן.
יוצקים את מאגר MMR מתוך התוך המק, ומוסיפים 200 מיליליטר של תות תוסף סידן יונופור לתוך הביצים. השתמש פיפטה זכוכית כדי לערבב את הביצים בעדינות עד שהם מופעלים, ולהסיר את פתרון הסידן יונופור. השארת הביצים בתספור סידן יונופור במשך זמן רב מדי תיזום אפופטוזיס.
אנחנו מערבבים את הביצים במשך 1.5 דקות ולבדוק את יעילות ההפעלה. אם הם אינם מופעלים, חזור לערבב ובדוק בתדירות גבוהה יותר עד להשגת הפעלה של 90%.. לאחר שהביצים מתיישבות בתחתית הסקילר, בדוק את יעילות ההפעלה.
ביצים מופעלות היטב יש כ 25% של מוט החיה ו 75% של מוט הצמחייה. לאחר מכן, לשטוף את הביצים פעמיים עם נפח כולל של 50 מיליליטר של חיץ תמצית בתוספת מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הביצים למיקרו-צינור Snap-cap של 0.4 מיליליטר.
צנטריפוגה microtube במשך 60 שניות ב 200 גרם ולאחר מכן ב 600 גרם במשך 30 שניות כדי לארוז את הביצים. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי להסיר את המאגר עודף על גבי הביצים לאחר כל שלב. לאחר מכן, למחוץ את הביצים ב 15, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השתמש סכין גילוח כדי לחתוך את הצינורות כדי להפריד את שלוש שכבות של ביצים כתוש ולשמור על ציטופלסמה גולמית בשכבה האמצעית. לאחר מכן, להעביר את הציטופלסמה הגולמית כדי לנקות צינורות אולטרהצנטריפוגה. להשלים את הציטופלסמה עם מעכבי פרוטאז ו cytochalasin B ב 10 מיקרוגרם למיליליטר כל אחד.
צנטריפוגה ציטופלסמה גולמית ב 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הצינור ולשמור את הציטופלסמה בשכבה האמצעית. מניחים את התמציות הטריות המוכנות על קרח.
ראשית, להוסיף securin-mCherry mRNA לתמציות מוכנות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של 2%PFPE-PEG פלואורו-פרקטיקה לתערובת תמצית mRNA. השתמש מערבל מערבולת כדי ליצור טיפות, התאמת מהירות המערבולת ומשך לפי הצורך.
לאחר מכן, לבדוק חזותית את טיפות כדי להבטיח שהם אחידים בגודל. באמצעות פיפטה 200 מיקרוליטר, להעביר את טיפות צף על גבי נפח שווה של פעילי שטח לצינור PCR. טובלים צינור זכוכית בשכבת טיפה, ומחכים עד שהטפסות ימלאו כ-75% מהצינור.
לאחר מכן, לדחוף את הצינור לתוך השכבה פעילי שטח, ולמלא את הצינור לחלוטין. לאחר מכן, מלאו צלחת עם תחתית זכוכית בשמן מינרלי. לאחר מכן, השתמש פינצטה בסדר לטבול את הצינור מלא טיפה בשמן.
השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את כל פסולת גלויה או טיפות דלף. כדי למנוע תנועה ודליפת טיפות, צינור הזכוכית מלא טיפות צריך להיות שקוע מתחת לשמן מינרלי בזהירות. אנחנו יכולים גם לדחוף את הצינור בשני הקצוות עם איזון או להוסיף כמה טיפות של שמן מינרלי על קצות הצינור בו זמנית הראשון.
לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ epifluorescence המצויד בשלב xy ממונע כדי לדמיין את טיפות. הקלט קטעי וידאו לשגות זמן בשדה הבהיר וערוצי פלואורסצנטיות מרובים כל שש עד תשע דקות עד טיפות לאבד את פעילותם. באמצעות פרוטוקול זה, תנודות מיוטיות בתאים פשוטים, ללא גרעין ותאים מסובכים עם גרעינים יוצרו.
טיפות ללא גרעינים יצרו תנודות מיתוטיות עד 30 מחזורים לא מבושלים במשך 92 שעות. כמו כן נבחנה היכולת של מתנד המיטוטי לנהוג במורד הזרם. המתנד המיטוטי המתמשך דחף את השינויים של המורפולוגיה הגרעינית שנצפתה באמצעות שינוי אוטונומי של שלבי מחזור תאים נפרדים.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הזמן בעת ביצוע התמצית, כפי שהוא זמן רגיש, ותמיד לשמור את הביצים לחלץ על קרח. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה לחוקרים בתחום הביולוגיה של המערכת לחקור עקרונות בסיסיים של תכונות שעון מורכבות, כמוtunability ושטוצ'סטיות בקסנופוס לאבס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה ליצירת תנודות מיטוטיות בר-קיימא in vitro ברמת התא הבודד, תוך שימוש בתמציות ביצים של Xenopus laevis המעטפות במיקרו-אמולסיות של מים בשמן. טכניקה זו שואפת להעמיק את הבנתנו לגבי הרשת המיטוטית ודינמיקת מחזור התא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של מערכות
- ביופיזיקה
רקע
- הבנת המנגנונים המווסתים את הרשת המיטוטית היא קריטית.
- שעוני מחזור התא ממלאים תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים.
- נדרשות טכניקות בעלות תפוקה גבוהה לצורך ניתוח כמותי.
- ביצי *Xenopus laevis* מהוות מודל לחקר תהליכים אלו.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת תנודות מיטוטיות (mitotic oscillations) במעבדה (in vitro).
- הס facilitar של ניתוח בסביבת תפוקה גבוהה (high-throughput) של דינמיקת מחזור התא.
- בחינה של מנגנוני הבקרה של הרשת המיטוטית.
שיטות שהוכנסו לשימוש
- כמיסה של תמריות ביצים של Xenopus laevis במיקרו-אמולסיות.
- הכנת ביצים על ידי הסרת מעטפות הג'לי.
- שימוש בבופר MMR בריכוז 0.2x ובציסטאין בתהליך המיצוי.
- ניעור חזק להבטחת מיצוי וכמיסה תקינים.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של טיפות המכילות מספר מחזורי תאים.
- ביסוס תשתית בעלת תפוקה גבוהה לצורך ניתוח.
- השגת תובנות לגבי התכונות הדינמיות של השעון של מחזור התא.
- יישומים פוטנציאליים בחקר הבקרה של מחזור התא.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חדשנית לחקר תנודות מי abbreviatedיות (mitotic oscillations).
- היא מאפשרת מניפולציה כמותית וניתוח של מחזורי תאים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לחקור ביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכת תאיים מלאכותיים מבוססת טיפות זו מאפשרת ניתוח ברזולוציה של תא בודד ובסריקה רחבה (high-throughput) של תנודות מיעוטיות, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית של בדיקות תמציות במסה (bulk extract assays) הסובלות מחוסר סנכרון ומאותות דועכים. על ידי שימור התנודות למשך למעלה מ-30 מחזורים בתאים של תמצית ביצי Xenopus laevis, השיטה מספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור למניפולציה כמותית של דינמיקת מחזור התא. דבר זה תומך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי קישור תפקוד המתנודד לאירועים מיעוטיים המשכיים, כגון דינמיקת המעטפת הגרעינית ועיבוי כרומוזומים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור פעילות של מתנד מיטוטי למדדי פנוטיפ במורד המסלול במערכת מבוקרת וניתנת לכיוון.
- ערך תפעולי: מספק תנודות סינכרוניות מתמשכות באלפי טיפות, מה שמפחית רעשים ומגביר את העוצמה הסטטיסטית למחקרי מעורבות של מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות ורב-ערוציות של תהליכי מתתנים ותהליכים במורד הזרימה, מה שמאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות לצורך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: תומך בפורמטים מבוססי טיפות בעלי יכולת הרחבה, התואמים לאוטומציה ולניטור בזמן אמת של הפרעות במחזור התא.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על נאמנות המערכת הרלוונטית למחלה על ידי שחזור מחזורי הרכבה ופירוק של הגרעין, ובכך תומך בהלימה של סממנים ביולוגיים (biomarkers) עם ההתקדמות המיטוטית.
- ערך תפעולי: מקל על רציפות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות למעקב אורך של תפקוד האוסילטור ושל אירועים מיטוטים במדורים בודדים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי אספקת קריאה כמותית וניתנת להרחבה של תפקוד המתמר המיטוטי, המנחה החלטות לגבי זיהוי מולקולות מובילות והקדמה פרה-קלינית באמצעות נתונים דינמיים ברזולוציה של תא בודד.
- ביולוגיית גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כך שמאפשרת קורלציה בזמן אמת בין שלב האוסילטור לבין שינויים במורפולוגיה הגרעינית.
- סריקה (Screening): מספקת מערכות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה, בעלות פלט אוסילטורי מתמשך המתאים לסריקת ספריות תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות רב-פרמטריות בשיטת time-lapse של אמפליטודת האוסילטור, המחזוריות והסנכרון לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני באמצעות שחזור נאמן של אירועי מיטוזה המתרחשים במורד זרימה מהאוסילטור.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה מיקרופלואידית הניתנת לשימוש חוזר לצורך אופטימיזציה איטרטיבית של תרכובות המווסתות את מחזור התא בפרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפרדת התנהגות מתנדים ברמה של תא בודד מארטפקטים של ממוצע אוכלוסייה.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות אחידות טיפות והרכב תמצית מבוקר.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי קישור מודולציה של המטרה לפלטים פנוטיפיים דינמיים בפורמט של תפוקה גבוהה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון על ידי כימות השפעות של תרכובות על יציבות המתנדים והתקדמות מיטוטית במורד הזרם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת תמצית ביצי Xenopus וביצירת טיפות מיקרופלואידיות.
- תלוי בגישה למערבלי vortex, מיקרוסקופי פלואורסצנציה עם במות ממוטורות ויכולות דימוי רב-ערוציות.
- מחייב סטנדרטיזציה של איכות התמצית וריכוזי החומרים הפעילים שטחית (surfactants) בין סדרות שונות להשגת תנודות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בעת שילוב גרעינים או רכיבים תת-תאיים אחרים למידול מורכבות מוגברת.
- מוגבל על ידי האופי הרגיש לזמן של פעילות התמצית והצורך לשמור על הדגימות על קרח כדי לשמר את התפקוד.
