Name: שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: חקור שחזור תנודות מחזור התא בתמציות ביצה של Xenopus laevis ב-microemulsions. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי בקנה מידה רחב של דינמיקת מחזור התא ומנגנוני הרשת המיטוטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לו מדלן על בניית פלסמיד securin-mCherry, הברכיים Man Lee, קנת הו, אלן ליו P לדיונים על יצירת droplet, ג'רמי B. צ'אנג, ג'יימס דגלס פרל ג'וניור למתן ש-GFP-NLS לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (הקריירה המוקדמת מענק #1553031), מכוני הבריאות הלאומיים (מירה #GM119688), מלגת מחקר סלואן.

<ol><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1839804">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li>
<li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li>
<li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdk1-APC%2FC+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed%2C+ultrasensitive+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li>
<li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li>
<li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li>
<li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator%3A+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li>
<li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li>
<li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li>
<li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788(2014).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li>
<li>Yang, Q., Ferrell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdk1-APC%2FC+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed%2C+ultrasensitive+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li>
<li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claspin%2C+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li>
<li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li>
<li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li>
<li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li>
<li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li>
<li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6(2013).</li>
<li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253(2007).</li>
<li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Xenopus+laevis+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, pdb.prot4735 (2007).</li>
<li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li>
<li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+CM+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 91, Academic Press. 236-247 (1983).</li>
<li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li>
<li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li>
<li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+with+poly%28vinyl%29+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689(2017).</li>
<li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li>
</ol>

אין לנו לחשוף.

הוצגו שיטה לפיתוח מערכת תפוקה גבוהה התא המלאכותי הזה מאפשר חוץ גופית בתוך שיחזור ומעקב לטווח ארוך של מחזור התא עצמית מתמשכת תנודות ברמת תא בודד. ישנם מספר שלבים קריטיים, ההופכות שיטה זו מוצלחת. ביצים צפרדע רפואית הראשון, סחוט טרי באיכות טובה, בהשוואה עם ביצים הניח, נוטים לייצר תמציות בפעילות תנודה יותר מתמיד. שנית, כימוס של תמציות בתוך microenvironments מיוצב חומרים פעילי שטח חיוני לשמר את הפעילות תנודה. שלישית, דגירה של טיפות שמן לתוך וביתנו צינורית דקה טיפות בתוך שכבה אחת, ובכך להקל על עיבוד תמונה ומע...

תמציות cytoplasmic להכין מביצים זריזה צפרדע רפואית מייצג אחד המודלים הדומיננטית ביותר לחקר התא מחזורים, נתון הכמות הגדולה של oocytes, את התקדמות מהירה מחזור התא, את היכולת לשחזר הביוכימי אירועים mitotic במבחנה1,2. מערכת זו אפשרה את התגלית הראשונית ואפיון מכניסטית של מחזור התא חיוני הרגולטורים, כמו קידום ההבשלה פקטור (MPF), כמו גם התהליכים mitotic במורד הזרם, כולל ציר סגרגציה הרכבה של כרומוזום1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. תמציות ביצה צפרדע רפואית גם שימשו עבור ניתוח מפורט של רשתות רגולטוריות של מחזור התא שעון8,12,13,14 , מחקרים של נזק לדנ א מחסום /replication15 , פלך mitotic הרכבה מחסום16,17,18.
מחקרים אלה מחזורי תאים באמצעות תמציות ביצה צפרדע רפואית בעיקר התבססו על מדידות בצובר. עם זאת, התגובה בצובר קונבנציונאלי מבחני עשוי לא לחקות התנהגויות תא אמיתי, בהתחשב פער גדול הממדים שלהם, subcellular מידור המרחבי של מולקולות התגובה. יתר על כן, מדידות בכמות גדולה של פעילויות mitotic נוטים לתת מספר מוגבל של מחזורים לפני דעיכת במהירות8. החסרונות של תגובות בצובר למנוע את תמצית למערכת לספק נוסף להבנה של מאפיינים דינאמי שעון מורכבים ופונקציות. מחקרים שנעשו לאחרונה יש אנקפסולציה ללא תא cytostatic בבידוד-פקטור (CSF) צפרדע רפואית תמציות19,20 לתוך מוגדרת על-ידי גודל תא דמוי מדורים, סייעו להבהיר איך לגודל צירים הוא מווסת על ידי נפח cytoplasmic. עם זאת, מערכת זו במבחנה נעצר בשדה מפה של מיוזה II על ידי הפעולה של גורם cytostatic1, מערכת מסוגלת לטווח ארוך מתמשכת תנודות ברמת התא היחיד שנדרש לחקירה נוספת של מחזור התא מתנד.
ללמוד מחזור התא תנודות ברזולוציה של תא בודד, פיתחנו של התא-סולם, מערכת תפוקה גבוהה למפת המדידה בו זמנית מספר תהליכי מתנדנדות עצמית מתמשכת mitotic microemulsion בודדים טיפות. בפרוטוקול זה וידאו מפורט, נדגים על הקמת מערכת תנודה mitotic מלאכותי על ידי לבצע רכיבת אופניים הציטופלסמה ביצה זריזה צפרדע רפואית ב microemulsions בגדלים החל מ 10 מיקרומטר 300. במערכת זו, היו תנודות mitotic כולל כרומוזום עיבוי, דה-עיבוי, התמוטטות מעטפת הגרעין, הרפורמציה, השפלה ואת סינתזה של סובסטרטים "אנאפאזה" (למשל, securin-mCherry ב פרוטוקול זה) בהצלחה מחדש.

<table><tbody><tr><td>Xenopus laevis צפרדעים</td><td>Xenopus-I Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני-הכנה לסיבוב QIAprep</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה QIAquick (250)</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלול</td><td>אמביון</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3)-T-1 תא מוכשר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B2935</td><td></td></tr><tr><td>סידן יונופור סיגמא-אולדריץ</td><td>'</td><td>A23187</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>טריכלורו</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>רעיל 448931</td><td>רעיל</td></tr> <tr><td>(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFPE-PEG</td> פעילי שטח <td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare גלוטתיון ספרוז 4B חרוזים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>GE17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>עמודת PD-10</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>צינורות זכוכית חלולים מיניאטוריים VitroCom</td><td></td><td>5012</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס SZ61 מיקרוסקופ סטריאו מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס IX83 מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס FV1200 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>ספקטרופוטומטר אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermofisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0.4 מ"ל Microtubes E</td><td>& K Scientific</td><td>485050-B</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>ThermoFisher (Ambion)</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand מערבולת אנלוגית מערבולת</td><td>מיקסר Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>גרסה 7.3</td><td>תוכנת ניתוח תמונה</td></tr></tbody></table>

שיחזור התנודות מחזור התא ב- microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

בזמן אמת מדידה של תנודות ברמת תא בודד חשוב לחשוף את המנגנונים של שעונים ביולוגיים. למרות תמציות בצובר להכין מביצים צפרדע רפואית זריזה היה חזק בניתוח רשתות הביוכימי שבבסיס את התקדמות מחזור התא, מדידה הממוצע שלהם אנסמבל בדרך כלל מוביל לאי תנודה לח, למרות כל אחד מתנד בודדים עם השיתופן. זאת בשל הקושי של סנכרון מושלם בין מתנדים בודדים במערכות ביולוגיות רועש. כדי לאחזר את הדינמיקה תא בודד של מתנד, פיתחנו מערכת מבוססת-droplet תא מלאכותיים יכולים לשקם מחזורים mitotic בתאים קטנים לבצע רכיבת אופניים cytoplasmic תמציות של צפרדע רפואית זריזה ביצים. תאים פשוטים אלה cytoplasmic בלבד התערוכה תנודות ממושכת מעל 30 מחזורים. כדי לבנות יותר מסובך תאים עם גרעינים, הוספנו demembranated כרומטין הזרע כדי לעורר את הגרעינים הרכבה עצמית במערכת. הבחנו התקדמות תקופתיים של כרומוזום עיבוי/decondensation, גרעינים אופפים התמוטטות/הרפורמציה, כמו תאים אמיתיים. אפשרות זו מציינת כי מתנד mitotic מתפקד בנאמנות להסיע מספר אירועים mitotic במורד הזרם. במקביל איתרנו את הדינמיקה של מתנד mitotic ואת התהליכים במורד הזרם droplets בודדים באמצעות מיקרוסקופ רב ערוצית זריחה זמן לשגות. מערכת מחזור התא המלאכותי מספק מסגרת תפוקה גבוהה עבור מניפולציה כמותיים וניתוח של תנודות mitotic עם רזולוציה מתא בודד, אשר סביר להניח מספק תובנות חשובות מכונות רגולטוריות והפונקציות של השעון.

איור 2, אנו מראים כי פרוטוקול זה מייצרת תנודות mitotic הן פשוטות, ללא גרעיני תאים, כמו גם מסובך תאים עם גרעינים, איפה מתנד כוננים ההתחלפות מחזורית של היווצרות גרעינים, דפורמציה. טיפות ללא גרעינים יוצרות תנודות mitotic למעלה כדי 30 מחזורים undamped מעל משך הזמן של 92 שעות, כפי שמציין את סינתזה תקופתיים והשפלות של קרינה פלואורסצנטית כתב securin-mCherry (איור 2 א). Securin הוא מצע של במחבת הכתומה קידום APC מורכבות/ג ההשפלה של securi...

אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של המערכת, כגון מנגנון הוויסות שמאחורי הרשת המיטוטית והמאפיינים והפונקציות הדינמיים של שעון מחזור התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא תיצור כמות גדולה של טיפות עם מחזורי תאים מרובים בכל אחד, מתן לנו מסגרת תפוקה גבוהה עבור מניפולציה כמותית וניתוח. ראשית, השליכו קבוצות ביצים שיש להן גבולות לא ברורים בין מוטות בעלי חיים וצמחייה או כתמים לבנים לא סדירים על גבי מוטות בעלי חיים.לאחר מכן, בחר קבוצה מתאימה של ביצים מצפרדע אחת, והעבר את הביצים לסקייה של 600 מיליליטר. יוצקים עודף של חיץ MMR 0.2x, ומוסיפים בעדינות ציסטאין במאגר תמצית 1x לביצים. לאחר מכן, לנער את הסלק במרץ ביד כדי להסיר את מעילי ג'לי של הביצים.חזור על שטיפה זו שלוש פעמים עם סך של 800 מיליליטר של חיץ ציסטאין או עד הביצים לצבור להתיישב בתחתית הפוף. לאחר הסרת מעיל הג'לי, לשטוף את הביצים ארבע פעמים בליטר אחד של 0.2x פתרון MMR. השתמש פיפטה זכוכית להרים ולהשליך את הביצים להפוך לבן.יוצקים את מאגר MMR מתוך התוך המק, ומוסיפים 200 מיליליטר של תות תוסף סידן יונופור לתוך הביצים. השתמש פיפטה זכוכית כדי לערבב את הביצים בעדינות עד שהם מופעלים, ולהסיר את פתרון הסידן יונופור. השארת הביצים בתספור סידן יונופור במשך זמן רב מדי תיזום אפופטוזיס.אנחנו מערבבים את הביצים במשך 1.5 דקות ולבדוק את יעילות ההפעלה. אם הם אינם מופעלים, חזור לערבב ובדוק בתדירות גבוהה יותר עד להשגת הפעלה של 90%.. לאחר שהביצים מתיישבות בתחתית הסקילר, בדוק את יעילות ההפעלה.ביצים מופעלות היטב יש כ 25% של מוט החיה ו 75% של מוט הצמחייה. לאחר מכן, לשטוף את הביצים פעמיים עם נפח כולל של 50 מיליליטר של חיץ תמצית בתוספת מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הביצים למיקרו-צינור Snap-cap של 0.4 מיליליטר.צנטריפוגה microtube במשך 60 שניות ב 200 גרם ולאחר מכן ב 600 גרם במשך 30 שניות כדי לארוז את הביצים. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי להסיר את המאגר עודף על גבי הביצים לאחר כל שלב. לאחר מכן, למחוץ את הביצים ב 15, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השתמש סכין גילוח כדי לחתוך את הצינורות כדי להפריד את שלוש שכבות של ביצים כתוש ולשמור על ציטופלסמה גולמית בשכבה האמצעית. לאחר מכן, להעביר את הציטופלסמה הגולמית כדי לנקות צינורות אולטרהצנטריפוגה. להשלים את הציטופלסמה עם מעכבי פרוטאז ו cytochalasin B ב 10 מיקרוגרם למיליליטר כל אחד.צנטריפוגה ציטופלסמה גולמית ב 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הצינור ולשמור את הציטופלסמה בשכבה האמצעית. מניחים את התמציות הטריות המוכנות על קרח.ראשית, להוסיף securin-mCherry mRNA לתמציות מוכנות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של 2%PFPE-PEG פלואורו-פרקטיקה לתערובת תמצית mRNA. השתמש מערבל מערבולת כדי ליצור טיפות, התאמת מהירות המערבולת ומשך לפי הצורך.לאחר מכן, לבדוק חזותית את טיפות כדי להבטיח שהם אחידים בגודל. באמצעות פיפטה 200 מיקרוליטר, להעביר את טיפות צף על גבי נפח שווה של פעילי שטח לצינור PCR. טובלים צינור זכוכית בשכבת טיפה, ומחכים עד שהטפסות ימלאו כ-75% מהצינור.לאחר מכן, לדחוף את הצינור לתוך השכבה פעילי שטח, ולמלא את הצינור לחלוטין. לאחר מכן, מלאו צלחת עם תחתית זכוכית בשמן מינרלי. לאחר מכן, השתמש פינצטה בסדר לטבול את הצינור מלא טיפה בשמן.השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את כל פסולת גלויה או טיפות דלף. כדי למנוע תנועה ודליפת טיפות, צינור הזכוכית מלא טיפות צריך להיות שקוע מתחת לשמן מינרלי בזהירות. אנחנו יכולים גם לדחוף את הצינור בשני הקצוות עם איזון או להוסיף כמה טיפות של שמן מינרלי על קצות הצינור בו זמנית הראשון.לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ epifluorescence המצויד בשלב xy ממונע כדי לדמיין את טיפות. הקלט קטעי וידאו לשגות זמן בשדה הבהיר וערוצי פלואורסצנטיות מרובים כל שש עד תשע דקות עד טיפות לאבד את פעילותם. באמצעות פרוטוקול זה, תנודות מיוטיות בתאים פשוטים, ללא גרעין ותאים מסובכים עם גרעינים יוצרו.טיפות ללא גרעינים יצרו תנודות מיתוטיות עד 30 מחזורים לא מבושלים במשך 92 שעות. כמו כן נבחנה היכולת של מתנד המיטוטי לנהוג במורד הזרם. המתנד המיטוטי המתמשך דחף את השינויים של המורפולוגיה הגרעינית שנצפתה באמצעות שינוי אוטונומי של שלבי מחזור תאים נפרדים.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הזמן בעת ביצוע התמצית, כפי שהוא זמן רגיש, ותמיד לשמור את הביצים לחלץ על קרח. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה לחוקרים בתחום הביולוגיה של המערכת לחקור עקרונות בסיסיים של תכונות שעון מורכבות, כמוtunability ושטוצ'סטיות בקסנופוס לאבס.

reconstitution-cell-cycle-oscillations-microemulsions-cell-free

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

גולמי ו מופרדים תמציות Xenopus ביצה יכול לשמש כדי לספק חומרי ומשחזר תהליכים תאיים לניתוח מורפולוגיים ביוכימיים. תמוגה ביצה צנטריפוגה ההפרש משמשים להכנת תמצית גולמי אשר בתורו בתוך המשמשים להכנת תמציות מופרדים וההכנות קרום אור.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

אנו מתארים את האוסף של...

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

שיטה מתוארת לניתוח פירוק חלבונים באמצעות רדיואקטיבי וחלבונים לוציפראז-Fusion בתמצית ביצי Xenopus והתאמת להקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה קטנים של פירוק חלבונים.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

המנגנונים המולקולריים של דה-קונדנסטציה של כרומטין מיטוטי דחוס מאוד אינם מוגדרים כהלכה. אנו מציגים בדיקה נטולת תאים המבוססת על אשכולות כרומטין מיטוטיים שבודדו מתאי HeLa ותמצית ביצי Xenopus laevis המשחזרת נאמנה את תהליך העיבוי במבחנה.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

מנגנונים של קנה מידה תאי ותוך-תאי נותרו חמקמקים. השימוש בתמציות עוברי קסנופוס הפך נפוץ יותר ויותר כדי להבהיר מנגנונים של ויסות גודל האברונים. שיטה זו מתארת הכנת תמצית עובר ובדיקת קנה מידה גרעינית חדשה שבאמצעותה ניתן לזהות מנגנונים של ויסות גודל גרעיני.

Assay חינם-נייד באמצעות<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברי מחלץ לחקור מנגנונים של תקנת גודל גרעינית

ההרכבה והמיקום של הציר המיטוטי תלויים בכוחות המשולבים הנוצרים על ידי דינמיקת מיקרו-צינורות, חלבונים מוטוריים ומקשרים צולבים. כאן אנו מציגים את השיטות שפותחו לאחרונה בהן הכליאה הגיאומטרית של טיפות אמולסיה כדוריות משמשת לבנייה מחדש מלמטה למעלה של צירים מיטוטיים בסיסיים.

כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

אנו מדווחים על שני פרוטוקולים של סינכרון תאים המספקים הקשר ללימוד אירועים הקשורים לשלבים ספציפיים של מחזור התא. אנו מראים כי גישה זו שימושית לניתוח הרגולציה של גנים ספציפיים במחזור תאים לא מופרע או בחשיפה לסוכנים המשפיעים על מחזור התא.

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

פרוטוקול לתרבות ומניפולציה של רקמת עובר עכבר על שבב microfluidic מסופק. על ידי החלת פולסים של אפננים מסלול, מערכת זו יכולה לשמש כדי לשלוט חיצונית תנודות איתות לחקירה פונקציונלית של סמיטוגנזה עכבר.

גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה

חקור שחזור תנודות מחזור התא בתמציות ביצה של Xenopus laevis ב-microemulsions. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי בקנה מידה רחב של דינמיקת מחזור התא ומנגנוני הרשת המיטוטית.

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

גלה סרטונים נוספים