Name: יצירת הומו - ו Heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק לחקר מיקרו Rna קר-תגובה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: למד ליצור הומוגרפטים והטרוגרפטים בין אבטיח לדלעת הבקבוק לחקירת תגובת microRNA לקור. שיטה זו יעילה, ניתנת לשחזור ומספקת שרידות גבוהה של 98% בצמחים המורכבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31772191), פרויקט מחקר ענין לציבור, ג'ה-ג'יאנג (2017C 32027), מפתח המדע הפרוייקט של נעשו בג'ה-ג'יאנג (2016C 02051), התכנית הלאומית התמיכה של אנשי עסקים צעירים מעולה (אל P.X.).

1. עיקור וה נביטת הזרעים
<ol><li>עבור משטח עיקור, משרים את זרעי דלעת הבקבוק בתוך 500-mL מלא מים ב 58 ° C עם ערבוב מדי פעם, עד טמפרטורת המים יורדת ל- 40 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בינתיים, לשים 3 ק ג של אדמת כבול לתוך שקית ניילון, לחטא זה, החיטוי זה 120 ° C/0.5 MPa כעשרים דקות.</li>
	<li>שמור השריית הזרעים דלעת הבקבוק h 4-5 יותר עם אין ערבוב.<ol>
<li>ברגע המים מגיעה לטמפרטורת החדר, יש לשטוף את הזרעים 2 x - x 3 עם מים מזוקקים.</li>
		<li>לנקז את המים העודפים ולאפשר את הזרעים לנבוט בתוך שקית גזה ב 28 מעלות צלזיוס בתוך תא הצמיחה בחושך.</li>
		<li>לאחר נביטה, לזרוע את הזרעים לתוך סירי פלסטיק (6 ס מ קוטר) מלא אדמה כבול מעוקר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר השתילים דלעת הבקבוק פיתחו שני פסיגי הזרע שעברו שיטוח, חזור על השלבים 1.1-1.3 עם גרעיני אבטיח. הערה: ניהול זמן זה מבטיח כי הגודל של נצר, כנות להתאים גם עבור הרכבה מוצלחת.</li>
</ol>2. שתיל הצמיחה ואת הרכבה
<ol><li>גדלים השתילים בתוך תא צמיחה עם מחזור 16-h /8-h אור כהה, שמירה על הטמפרטורה ב- 28 מעלות צלזיוס במהלך היום (אור) וב -22 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (כהה). להשקיית השתילים על-ידי הוספת מים 1 x יום בשעות אחר הצהריים.</li>
	<li>להשתמש בשיטה הרכבה-גזור22 לעשות heterografts השתילים של הדלעת (כנות) הם בשלב עלים אמת אחת ולא פסיגי הזרע של האבטיח (נצר) הופיעו (לא עדיין שעברו שיטוח).<ol>
<li>לחתוך את hypocotyls השתילים אבטיח ב 2-3 ס מ מתחת פסיגי הזרע, ומשאיר העליון של השתילים דלעת הבקבוק באתר מיד מעל האמיתי.</li>
		<li>השתמש קיסם כדי לעשות חור בחלק העליון של השתילים דלעת הבקבוק החתוך. הכנס את השתילים אבטיח החתוך לתוך החורים השתילים דלעת הבקבוק כדי להפוך heterografts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש שיטה דומה כפי שהוצג בשלב 2.2 כדי להפוך homografts. הערה: שילובים הומו -, heterografting צריך תמיד להתבצע בו זמנית (איור 1), אשר, במקרה זה, התוצאות הבאות: דלעת אבטיח/הבקבוק (WB, heterograft), אבטיח/אבטיח (WW, מאותו מין), דלעת הבקבוק /bottle דלעת (BB, מאותו מין).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig1.jpg"> איור 1: איור של הצירופים שתל ולמבנים צמח המושתל. WB = heterografting דלעת אבטיח/בקבוק; WW = אבטיח/אבטיח homografting; BB = דלעת הבקבוק/בקבוק דלעת הומו-הרכבה; WB-S = נצר עלים של heterografts דלעת אבטיח/בקבוק זה היו שנדגמו; WB-R = כנות עלים של heterografts דלעת אבטיח/בקבוק זה היו שנדגמו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
3. ניהול, טיפול קר, postgrafting, דגימה
<ol><li>שלכדו את השתילים המושתל עם שקיות פוליאתילן שקופה כדי לשמור על לחות גבוהה יחסית ולשמור אותם עבור d 7 בתנאים סביבתיים מחזורים 16-h אור/8-h כהה, שמירה על הטמפרטורה ב- 28 מעלות צלזיוס במהלך היום (אור) וב -22 מעלות צלזיוס במהלך לילה (כהה).</li>
	<li>לחשוף את שקיות פוליאתילן שקוף ביום השביעי. תן שהצמחים גדלים במשך 7-10 ימים תחת אותו תנאים נוספים.</li>
	<li>לחלק את השתילים אחיד בריא לשתי קבוצות, אחת לטיפול קר (הדגיש) ואחת עבור פקד (שאינם הדגיש). עבור קבוצת בקרה, לעזוב את השתילים בבית הבליעה צמיחה אותו (ב 28 ° C) במשך שעה 48 נוספים, ואילו עבור הקבוצה הדגיש קר, להעביר את השתילים תא צמיחה עם טמפרטורת חום קבועה ב 6 ° C, עם תנאים/כהה כפי שמתואר בשלב 2.1.</li>
	<li>לטעום את העלים של הנצר, את כנות מ השתלים (איור 1). להקפיא את הדגימות מיד בחנקן נוזלי ואחסן אותם ב-70 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>4. ספריית הכנה ורצף תפוקה גבוהה
<ol><li>להעביר את הדגימות קפוא צינור 2-mL microcentrifuge חנקן נוזלי.</li>
	<li>מוסיפים חרוז מפלדת (5 מ מ קוטר) כל שפופרת המכילה הרקמות.</li>
	<li>Homogenize הרקמות כדי אבקה באמצעות מהמגן מיל חרוז עבור 30 s.</li>
	<li>עבור כל שילוב grafting, לקחת כמויות שוות (0.1 גר') של הקרקע מדגם עשרת השתילים ומערבבים אותם בשפופרת צנטרפוגה 10-mL. להוסיף כמות מספקת של ריאגנט הידרוכלוריד guanidium (טבלה של חומרים) מבוסס על ההצעות של היצרן התואם משקל הרקמה.<ol>
<li>להסיר מציג דנ א גנומי על-ידי הוספת נטולת RNA DNase I U/mL 150 ב 37 ° C עבור 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקבוע את הסכום הכולל כמות ה-RNA על מערכת אלקטרופורזה microcapillary כדי להבטיח את שלמות RNA מספר &gt; 7.0. הערה: רין &gt; 7.0 מבטיח של יושרה גבוהה של הדגימות RNA.</li>
	<li>להכין את ספריות RNA קטנים באמצעות ערכת מסחרי (טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן. השתמש µg 1 של RNA מוחלט בכל דגימה ליזום.<ol>
<li>הפשרה ספריית נורמליזציה ריאגנטים ומתאמי בהתאם להנחיות היצרן. מאתרים ומפסיקים RNAs קטן עם המתאמים יונקות ו 3′ ו elute-לטהר אותם. לאחר מכן, הפוכה לתמלל את יונקות ו 3' מאתרים קטנים RNAs בעקבות הנחיות היצרן.</li>
		<li>לבצע הגברה PCR על פי הפרוטוקול של היצרן. להעריך את האיכות והכמות של ספריות cDNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה microcapillary.</li>
		<li>לטעון µL 1 של ספריית ה-RNA על מערכת אלקטרופורזה microcapillary על מנת להבטיח את רין &gt; 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רצף של ספריות RNA קטנים על מכשיר רצף תפוקה גבוהה כמתואר23.</li>
</ol>5. miRNA ותחזית ג'ין היעד
<ol><li>עבור כל שילוב grafting, השתמש הקוד הפתוח UEA sRNA עבודה, שעליו מונחים גרסה 2.4-צמח24 כדי להסיר רצפים באיכות ירודה לקצץ מתאם רצפים של קריאות raw. למחוק את רצפי קטנות יותר 18 nt או הגדולים מ- 32 nt.</li>
	<li>להשוות את רצפי "נקי" באיכות גבוהה למסד הנתונים של קוד פתוח Rfam 11.0 ' כדי לזהות ולהסיר קריאות של rRNA, tRNA, snoRNA ו snRNAs אחרים.</li>
	<li>יישר את קריאות הנותרים כדי הגנום הפניה באמצעות של הכלי יישור רצף קצר-קריאה25. אין אי התאמה מותר בשלב זה. הערה: מכלול הגנום "97103" אבטיח V126 שימש יישור עם הקריאות מן הנצר, ואת מכלול הגנום "הרץ" דלעת הבקבוק V127 שימש עבור קריאות מן כנות.</li>
	<li>להשוות את קריאות הנותרים נגד miRNAs בוגר ידוע miRBase 22.028קוד פתוח. קריאות כי הם הומולוגיים כדי miRNAs ידוע מסווגים miRNAs ההכפלה.</li>
	<li>להשוות את רצפי להיכשל להתאים את מבשרי miRNA ידוע עם רצף הגנום. השתמש האלגוריתם29 MIREAP כדי לזהות פוטנציאל miRNAs הרומן תחת הגדרות ברירת המחדל.</li>
</ol>6. ביטוי דיפרנציאלי וניתוח אונטולוגיה ג'ין
<ol><li>להשוות את רמות הביטוי של miRNAs בהתבסס על ספירת קריאה שלהם. miRNAs עם P-ערך (מבחן המדויק של פישר) &lt; 0.05 וערך &gt; 2 על2 יומן מוחלטת נחשבים לבוא לידי ביטוי באופן שונה.</li>
	<li>השתמש של antisense oligonucleotide היעד באתר מבחר כלי (TargetFinder)30 לחזות mRNAs משלימים פוטנציאליים (miRNA היעד גנים) miRNAs באופן שונה ביטוי תחת פרמטרים ברירת המחדל.</li>
	<li>השתמש אונטולוגיה של ג'ין (ללכת) כלי אנליטי העשרה31 כדי לחשוף את היעד גנים אונטולוגיה של miRNA (קדימה) תבניות תחת P- ערך הסף של 0.05 מובהקות סטטיסטית.</li>
</ol>

<ol><li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004243">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://journals.tubitak.gov.tr/havuz/bot-1404-115.pdf">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li>
<li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014116000030">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li>
<li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/43/3/730.full">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li>
<li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/44/7/1978.full">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li>
<li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004115">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li>
<li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11099-012-0002-1">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li>
<li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004462">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li>
<li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+%28N%29+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li>
<li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.actahort.org/books/1086/1086_26.htm">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li>
<li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9759-6">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li>
<li>Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurnbull%2C+CG+%22Plant+Developmental+Biology%22">Plant Developmental Biology</a>. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li>
<li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root%2C+stem%2C+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+%28Solanum+tuberosum+L.%29+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).</li>
<li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li>
<li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li>
<li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li>
<li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13562-015-0334-6">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11738-016-2070-5">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li>
<li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li>
<li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359(2013).</li>
<li>Song, G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/294376070_Development_of_2JC-350_automatic_grafting_machine_with_cut_grafting_method_for_vegetable_seedling">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+%28triticum+aestivum+l.%29+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li>
<li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851(2014).</li>
<li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://sacan.biomed.drexel.edu/cmteditor/program/download?confname=ssdbm2013&pid=k2&file=paper">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li>
<li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+draft+genome+of+watermelon+%28Citrullus+lanatus%29+and+resequencing+of+20+diverse+accessions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gourdbase%3A+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+%28lagenaria+siceraria%29%2C+an+economically+important+cucurbit+crop%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306(2018).</li>
<li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25(2011).</li>
<li>Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://sourceforge.net/projects/mireap/">http://sourceforge.net/projects/mireap/</a> (2008).</li>
<li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TargetFinder%3A+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li>
<li>Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015).</li>
<li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423815303794">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף. הנתונים רצפי RNA קטנים מופקד על GenBank תחת המספר הצטרפותן SRP136842.

ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר בפירוט שיטה יעילה מאוד לשחזור כדי להפוך הומו - heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק. שיטה זו, הדורשים אין ציוד ספציפי, קל מאוד לתפעול וכוללת בדרך כלל שיעור הישרדות מאוד גבוהה של הרכבה. השיטה גם ניתן לבצע שתלים לקבלת cucurbits אחרים, כגון בין אבטיח, מלפפון, דלעת.
ראוי לציין כי הגודל היחסי (גיל) של כנות, נצר הוא קריטי כדי לעשות השתלה מוצלחת (שלב 2.2 פרוטוקול). הבחנו כי אם כנות בשימוש היה גדול מדי בהשוואה הנצר, האיחוד שתל היה קשה יותר לטופס כי הגבעול של הנ...

הרכבה זמן כבר מועסקים כ טכניקה חקלאית כדי לשפר את ייצור יבול, עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים1,2,3. במערכות heterografting, כנות האליטה יכול לשפר את ספיגת מים וחומרים מזינים של צמחים לחיזוק עמידות בפני פתוגנים בקרקע, להגביל את ההשפעות השליליות של מתכות רעילות4,5, אשר עשויה לתת השתלים משופרת מרץ צמיחה, עמידות מוגברת בפני לחצים סביבתיים. במקרים רבים, heterografting יכול גם להשפיע איכויות פרי בצמחים הגננות, שמוביל בטעם פירות משופרת ותכניה מוגברת תרכובות הקשורים לבריאות6,7. זה נמצא כי העברת הבינעירוניים phytohormones, RNAs, פפטידים וחלבונים בין את כנות הנצר הוא מנגנון בסיסי להתכוונן את הצמיחה ואת פיתוח התכנות של נצר צמחים8,9 ,10. הרכבה כבר בשימוש נרחב במחקרים של איתות הבינעירוניים ואמצעי התחבורה ביחס הסתגלות סביבתית11. ניסויים הרכבה חזקים במיוחד לצורך זיהוי ברורה וחד משמעית של מולקולות המשודרת בקבלת רקמות או sap כלי הדם, ואת ההפעלה או דיכוי של מטרות מולקולריות עקב אות שידור12.
Non-קידוד RNAs, מחזור גדול של RNA להפעיל פונקציות חשובות תקינה בתאים, דווחו לשחק תפקיד בקידום הצמח ההסתגלות מתח והאביוטיים13. miRNAs הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs של בערך 20-24 nt. מחקרים גילו תפקיד miRNAs בהיבטים שונים של הצמח פעילות תקינה, כגון כמו יורה צמיחה, לרוחב שורש היווצרות14,15,16, ספיגת התזונתי, סולפט מטבוליזם הומאוסטזיס17, ואת התגובות ביוטיים, והאביוטיים להדגיש18. לאחרונה, הביטוי של miRNAs ואת הגנים היעד שלהם היו קשורות מלח מתח סובלנות שתילי מלפפון heterografted19. השתלים intervariety ענבים, התגובות של miRNA ביטוי למתח הבצורת נמצאו תלויי-גנוטיפ20.
ההתפתחות המהירה של הפחתת העלות של הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף סיפקו הזדמנות גדולה עבור המחקר לתקנות miRNA בצמחים אגרונומיים תחת פיקוח הדוק. אבטיח (אבטיח צמיר [Thunb]. Mansf.), של cucurbit חשוב הגידול ברחבי העולם, היא חשופה בטמפרטורות נמוכות. דלעת הבקבוק (Lagenaria siceraria [מולינה] Standl..) כאכארביט יותר. האקלים-גמישים בשימוש נפוץ על ידי חקלאים כדי להשתיל עם אבטיח. המטרה העיקרית של המחקר הנוכחי הוא לבסס סטנדרט, יעיל, ושיטת נוח להכנת heterografts בין אבטיח (אבטיח צמיר [Thunb]. Mansf.) דלעת הבקבוק (StandlLagenaria siceraria [מולינה]). פרוטוקול זה מספק גם ערכה ניסוי מפורט נהלים אנליטיים לחקר ברגולציה של ביטויים miRNA בעקבות השתלת עור, אשר הוא שימושי עבור חשיפת המנגנונים heterografting יתרונות.
החומרים הצמח השתמשו במחקר זה כוללים את הזן אבטיח את צמחי תרבות מסורתיים דלעת הבקבוק. לדבורי אבטיח הוא זנים מסחריים עם תשואה גבוהה אבל רגישים בטמפרטורה נמוכה. צמחי תרבות מסורתיים דלעת הבקבוק הוא ככנה פופולרי עבור הרכבה עם אבטיח, מלפפון, דלעת, עקב שלה עמידות מעולה של טמפרטורות נמוכות21.

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ללא RNA DNase I</td><td>Takara</td><td>D2270A</td><td></td></tr><tr><td>Truseq ערכת הכנת דגימת RNA קטנה Illumina</td><td></td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bionalyser</td><td>Agilent</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>DNA פולימראז</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>UEA sRNA שולחן עבודה 2.4 גרסת צמח&nbsp; (תוכנה)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td></tr> <tr><td>מסד נתונים Rfam 11.0&nbsp;( website)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://rfam.janelia.org</td></tr><tr><td>miRBase 22.0&nbsp;( אתר אינטרנט)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://www.mirbase.org/</td></tr> <tr><td>MIREAP(תוכנה)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td></tr> <tr><td>TargetFinder&nbsp;( תוכנה)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://targetfinder.org/</td></tr></tbody></table>

יצירת הומו - ו heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק לחקר מיקרו rna קר-תגובה

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Rna (miRNAs) הם אנדוגני קטן ללא קידוד RNAs של בערך 20-24 nt, ידוע תפקיד חשוב ב מפעל פיתוח והתאמה. ראיות המצטבר מראה כי הביטויים של miRNAs מסוימים הם שינו בעת השתלת עור, תרגול החקלאי בשימוש נפוץ על ידי חקלאים לשיפור יבול עמידות בפני לחצים ביוטיים, והאביוטיים. דלעת הבקבוק הוא חיתוך גמיש מטבעו האקלים לעומת רבים אחרים הגדולות cucurbits, לרבות אבטיח, טיוח זה לאחד כנות הנפוצה ביותר עבור האחרון. לקידום טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה האחרונות סיפקה הזדמנויות גדולות לחקור miRNAs קר מגיב ותרומתם יתרונות heterograft; ובכל זאת, שגרות ניסיוני נאותה הן תנאי הכרחי למטרה זו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת ביעילות הומו - ו heterografts בין אבטיח קר, רגישים את הדלעת בקבוק קר-סובלנית, בנוסף לשיטות של דגימה רקמה, דור נתונים, ניתוח נתונים. השיטות הציג שימושיים גם למערכות אחרות מפעל הרכבה, לחקור miRNA תקנות תחת לחצים סביבתיים שונים, כגון חום, יובש, מליחות.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> איור 2: פנוטיפים שתלי שונים-בטמפרטורת החדר ותנאים הדגיש קר. () לוח זה מראה הומו - שתילים heterografted בטמפרטורת החדר של הפקד. (b) לוח זה מראה הומו - שתילים heterografted לאחר 48 שעות של טיפול קר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<p class="...

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת ביעילות הומו - ו heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק, בנוסף לשיטות של דגימה רקמה, דור נתונים, ניתוח נתונים, עבור החקירה של הקור מגיבים מיקרו Rna.

יצירת הומו - ו Heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק לחקר מיקרו Rna קר-תגובה

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתגובה miRNA ליכולת להדגיש שתלים צמחיים כגון איך miRNA מוסדרים תחת לחץ קר שתלי דעת בקבוק אבטיח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי היא שיטה יעילה מאוד לשחזור לעשות הומו הטרוגרפטים. זה לא דורש ציוד ספציפי, זה קל מאוד לבצע, ובדרך כלל תוצאות שיעור הישרדות גבוה מאוד של השתלה.באמצעות שיטה זו, יכול לספק תובנה לתוך תגובת miRNA ללחץ קר במערכת שתלי הדם בקבוק אבטיח. זה יכול להיות מיושם גם על אורגניזמים מודרניים אחרים לחשיפת המנגנונים של תחבורה miRNA מקומית למרחקים ארוכים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו שלבי השתלה קשה ללמוד.שלב זה דרש מיומנויות מתקדמות והם המפתח להישרדותם של הצמחים המושתלים. כדי להתחיל, להשרות זרעי דלעת בקבוק ב 500 מיליליטר מקור של 58 מעלות צלזיוס מים. מערבבים את הזרעים מדי פעם עד טמפרטורת המים יורדת ל 40 מעלות צלזיוס.בזמן שהמים מתקררים, מכניסים שלושה קילוגרמים של אדמת כבול לשקית ניילון ומקלים אותה באופן אוטומטי. ברגע שהמים מגיעים לטמפרטורת החדר, שוטפים את הזרעים פעמיים עד שלוש פעמים במים מזוקקים ומנקזים את המים העודפים. אפשר לזרעים לנבוט בשקית גזה ב 28 מעלות צלזיוס בתא הצמיחה הכהה.לאחר הנביטה, לזרוע את הזרעים לתוך סירי פלסטיק מלא באדמת כבול מעקר. כאשר שתילי דלעת הבקבוק לפתח שני cotyledons שטוח, לחזור על תהליך זה עם זרעי אבטיח. לגדל את דליע הבקבוק שתילי אבטיח בתא צמיחה.מוסיפים מים השתילים פעם ביום אחר הצהריים. לאחר מכן, חותכים את ההיפוקוטילים של שתילי האבטיח שניים עד שלושה סנטימטרים מתחת לקוטילדון. חותכים את החלק העליון של שתילי דלעות הבקבוק בצד, מיד מעל הקוטילדונים.לאחר מכן השתמש בקיסם כדי לעשות חור בחלק העליון של שתילי דליע בקבוק גזוז. הכנס את שתילי האבטיח הגזוזים לתוך החור כדי להפוך את הטרוגרפטים. לאחר מכן, להכין הומוגרפטים באמצעות השיטה שתוארה קודם לכן.ראשית, לעטוף את השתילים מושתלים בשקיות פוליאתילן שקופות כדי לשמור על לחות גבוהה יחסית. לאחר מכן לשמור על שתילים עטופים בתא צמיחה במשך שבעה ימים. לאחר היום השביעי, להסיר את השקיות ולאפשר לצמחים לגדול באותם תנאים במשך שבעה עד 10 ימים.מחלקים את השתילים לשתי קבוצות, אחת לטיפולים קרים והן לשליטה. להחזיר את שתילי הבקרה לאותם תנאים סביבתיים. מניחים את השתילים המטופלים בקור בתא גדילה שנקבע לשש מעלות צלזיוס עם אותם תנאים כהים בהירים כמו קבוצת הביקורת.לאחר 48 שעות, להשאיר את הדגימות של scion ו rootstocks מן השתלים. להקפיא את הדגימות מיד בחנקן נוזלי ולאחסן אותם במינוס 70 מעלות צלזיוס. מעבירים את הדגימה הקפואה לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר בחנקן נוזלי.מוסיפים חרוז נירוסטה לכל צינור מדגם ומדגימים את הרקמות לאבקה דקה. עבור כל שילוב השתלה, לקחת כמויות שוות של מדגם הקרקע מ 10 שתילים ומערבבים אותם בצינור צנטריפוגה 10 מיליליטר. הוסף כמות מתאימה של גואנידיום הידרוכלוריד רגנט.לאחר מכן, מוסיפים DNase ללא RNA 1 עד 150 יחידות למיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן לקבוע את כמות RNA הכוללת על מערכת אלקטרופורזה מיקרו-קפילארית. לאחר מכן, הפשר את רייגנטים ומתאמים לנורמליזציה של הספרייה.לאחר מכן ligate RNase קטן עם חמישה מתאמים ראשוניים ושלושה עיקריים, ולחמק ולטהר אותם. הפוך לתמלל את חמש ראשי ושלושה RNase קטן מגרתיים מגרתיים בעקבות הנחיות היצרן. לאחר מכן, בצע הגברה של PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן.לאחר מכן השתמש במערכת האלקטרופורזה המיקרו-קילרית כדי להבטיח שמספר תקינות ה-RNA גדול משבע. טען מיקרוליטר אחד של ספריית RNA במערכת האלקטרופורזה המיקרו-קפילרית כדי להבטיח שמספר תקינות ה-RNA גדול משבע. לבסוף, רצף ספריות RNA קטנות על מכשיר ריצוף תפוקה גבוהה.באמצעות פרוטוקול זה, שיעור הישרדות של 98% עבור השתלה ואת פנוטיפים עבור טמפרטורת החדר ותנאי מתח קר הושגו. sRNAs של 24 נוקלאוטידים היוו את המחלקה הגדולה ביותר של sRNAs בכל שילוב השתלות, ללא קשר לטיפול בטמפרטורה. לאחר 48 שעות של טיפול קר, 30 ו 268 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה.בעלים של scion בהטרוגרפטים, לעומת זאת, בעלים של rootstock, 31 ו 12 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה. בהומוגרפטים אבטיח אבטיח, 64 ו 83 microRNAs היו למעלה ולמטה מוסדר, בהתאמה. זה הראה כי הטרוגרפטינג גרם לתכנות מחדש עמוק של ביטויי microRNA.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הגודל והגיל היחסיים של גבעול הבת ואת scion הוא קריטי להכנת שתל מוצלח. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו רצף lncRNA, פרופיל proteomic יכול להתבצע על מנת לחקור את הרגולציה של lncRNA וחלבון ואת מערכת הקידוד במערכת השתלה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום הסובלנות abiotic הצמח לחקור את המנגנון של יתרון השתלת צמחים Cucurbitaceae ומעבר.אל תשכח כי עבודה עם guanidine הידרוכלוריד יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות מתאים תמיד יש לנקוט עם ביצוע הליך זה.

generating-homo-heterografts-between-watermelon-bottle-gourd-for

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

סרטון זה מתאר מיקרו-הזרקה, שיטה נפוצה ליצירת זני C. elegans טרנסגניים. בדוגמה נראה מיקרו-הזרקה המשמשת להחדרת קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי קריספר.

Gonad Microinjection: שיטה של העברת תרכובות ישירות לתוך הנבט של C. elegans

באמצעות הרכבת DNA, וקטורי CRISPR מרובים ניתן לבנות במקביל לתגובת שיבוט יחידה, מה שהופך את הבנייה של מספר רב של CRISPR וקטורי משימה פשוטה. עגבניות שורשי שעירים מהווים מערכת מודל מצוינת כדי לאמת וקטורי CRISPR וליצור חומרי מוטציה.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לשיבוט מספר רב של מדריך RNAs לתוך אחד וקטור RNA concatmer מדריך, שהוא שימוש מיוחד ביצירת נוק-אאוט רב גנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR / Cas9. הדור של נוקאאוטס כפול באורגנואידים במעיים מוצג כיישום אפשרי של שיטה זו.

פרוטוקול של נוקאוט גנים מרובים עכבר קטן Organoids באמצעות CISPR-concatemer

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

מטרה זו של פרוטוקול זה היא לייצר כימאריק axo, עם פלואידי forelimbs נגזר מרקמת תורם Cas9-מוטוניים באמצעות שיטות השתלת רקמות עובריים.

הדור של כימאריק אקאוללס עם הגפיים הספאוזהות באמצעות השתלה עובריים

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור וירוס תפוחי אדמה X (PVX)מבוסס microRNA השתקת מערכת (VbMS) כדי לאפיין פונקציונלית microRNAs אנדוגני (miRNAs) בתפוח אדמה. מולקולות חיקוי מטרה (TM) של miRNA של עניין משולבות בווקטור PVX ומתבטאות באופן חולף בתפוח אדמה כדי להשתיק את משפחת ה- miRNA או miRNA היעד.

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

פרוטוקול הזרקה מבוסס אגרובקטריום (אגרובקטריה) מוצג לחיסון של וירוס פסיפס זנב שועל ווירוסי פסיפס קני סוכר לשתילי תירס. חיסון באופן זה מוביל לזיהום ויראלי, השתקת גנים הנגרמת על ידי וירוס של גנים סמן, ו overexpression ויראלי של GFP.

אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo לעריכת גנום בתיווך קריספר מוגבלת אזורית באובידוקט העכבר.

מודלים של עכברים מהונדסים בגנום סומטי המשתמשים במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה של Vivo

מחקר זה פיתח תהליך עבודה ליצירה ותחזוקה של קווי מוטנטים יציבים עבור חילזון תפוח מים מתוקים, Pomacea canaliculata. הפרוטוקולים כוללים איסוף זיגוטים, הזרקת מיקרו עם רכיבי מערכת CRISPR/Cas9 לביצוע עריכת גנום, תרבית עוברים מחוץ לביציות , וגנוטיפינג לאחר הכלאות מבוקרות.

חילזון התפוח הזהוב Pomacea canaliculata: מזיגוטים ועד קווי מוטנטים יציבים

למד ליצור הומוגרפטים והטרוגרפטים בין אבטיח לדלעת הבקבוק לחקירת תגובת microRNA לקור. שיטה זו יעילה, ניתנת לשחזור ומספקת שרידות גבוהה של 98% בצמחים המורכבים.

יצירת הומו - ו Heterografts בין אבטיח דלעת הבקבוק לחקר מיקרו Rna קר-תגובה

גלה סרטונים נוספים