Name: שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: למדו שיטה חדשנית מבוססת עובש ליצירת רקמות לב תלת-ממדיות ללא גרדום באמצעות ספרואידים. השיטה משתמשת בקרדיומיוציטים, פיברובלסטים ותאי אנדותל ליצירת רקמות פועמות בסנכרון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים להכיר את מקור המימון הבאים: קסם כי ענייני הקרן למחקר קרדיו.

1. הכנת Cardiomyocytes
<ol><li>מעיל טוב 6 צלחות עם קרום המרתף מטריקס ותרבות אנושית-induced גזע pluripotent (hiPSCs) כפי שתואר לעיל17.</li>
	<li>להבדיל hiPSCs אל תוך שימוש בשיטות שתוארו18hiPSC-CMs.</li>
	<li>ב- 16-18 d פוסט-בידול, להשעות את cardiomyocytes בשטיפת בכל טוב עם 2 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ללא סידן או מגנזיום, ואחריו הדגירה 1 מ"ל/טוב של ריאגנט דיסוציאציה של טריפסין או תא-(ראה טבלה של חומרים) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) תא מדיה בתוספת B-27 (מדיה תא RPMI/B-27). פיפטה למעלה ולמטה כדי לשחרר תאים מודבקת.</li>
	<li>לאסוף את cardiomyocytes מושעה עם פיפטה סרולוגית 10-mL ומעבירים אותם אל צינור חרוטי 50-mL.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשיג גלולה התא.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיה תא RPMI/B-27.</li>
	<li>לשלב 20 µL תא השעיה עם כמות שווה של 0.4% Trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.</li>
	<li>השתמש hemocytometer ידני של סופרים ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא.</li>
</ol>2. הכנת Fibroblasts
<ol><li>ליזום תרבות של פיברובלסט הלב האנושי (HCF) (סוג חדרית למבוגרים) קו תא כפי שתואר לעיל16.</li>
	<li>להשעות את HCFs על ידי המקננת בהם עם הכמות המתאימה של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר16. בשביל בקבוקון T175, שימש 10 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא.</li>
	<li>לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של מדיום, ואז להעביר את הדגימה אל צינור חרוטי 50-mL, centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לקבל גלולה.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום הגידול פיברובלסט (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לשלב 20 µL של התליה תא HCF עם כמות שווה של 0.4% trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.</li>
	<li>להשתמש מונה תא אוטומטית או ידנית hemocytometer נחשב ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא חדש.</li>
</ol>3. הכנה של תאי אנדותל
<ol><li>ליזום תרבות של קו תא אנדותל (HUVEC) הוא יפתור כפי שתואר לעיל17. להשעות את HUVECs על ידי המקננת בהם עם הכמות המתאימה של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) למשך 3 דקות על טמפרטורת חדר17. לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של מדיום, ואז להעביר צינור חרוטי 50-mL, centrifuge התליה תא ב 250 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשיג גלולה. הערה: עבור בקבוקון T175, 10 מ של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא שימש.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום הגידול תא אנדותל (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>לשלב 20 µL של ההשעיה HUVEC, את הכתם עם כמות שווה של 0.4% Trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.</li>
	<li>השתמש מונה הניתן תא אוטומטית או hemocytometer ידני של ספור ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא.</li>
</ol>4. יצירה של תלויים טיפה Spheroids
<ol><li>במקום לבלות את המכשיר טיפה אשר מכיל micropores 850 (כל אחד בקוטר של 350 מיקרומטר) לוחות 6-ובכן סטרילי.</li>
	<li>לבודד את שלושת סוגי תאים כמתואר לעיל: hiPSC-CMs, HCFs ו- HUVECs. לשלב אותם ביחס של 70% iPSC-CMs, HCFs 15% 15% HUVECs 50-mL צינור חרוטי עם מדיה תא RPMI/B-27-ריכוז של תאי 2,475,000 מ.</li>
	<li>לוותר על 4 מ"ל של התליה תא (2,475,000 תאים לכל mL) על כל טוב של מצורף נמוך במיוחד תלוי מערכת טיפה (בקוטר micropore של 350 מיקרומטר) לתוך צלחת 6-. טוב.</li>
	<li>Spheroids יהוו באופן ספונטני בתוך 12 שעות של מחלק התליה תא לתוך התליה המכשיר טיפה. נמשכות לתרבות עבור סכום כולל של 72 h (3 יח)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות ההבשלה של spheroids.</li>
	<li>לאחר 72 h של תרבות, לקצור את spheroids דרך הנקבוביות בתחתית התליה להפיל את המערכת על-ידי הצבת המכשיר לתוך קערה בינונית מתערבל אותו בעדינות כדי לשחרר את spheroids מן התליה המכשיר טיפה.</li>
</ol>5. יצירת תיקון תלת-ממדי משתמש בתבנית נטו הרומן
<ol><li>הבסיס, צלחת מרובע התחתון, התחתון נטו, ואת הצד בשכבות 10 רשתות הם התאספו כדי ליצור את התבנית הרומן בסיועם של זוג מלקחיים סטרילי. ראשית, מחסנית ליישר את הבסיס, צלחת מרובע התחתון ו למטה נטו באמצעות ההודעות בפינה. לאחר מכן, מחסנית, שכבה הרשתות בצד 10 מתחלפים כיוונים כדי ליצור רשת של צדדים נירוסטה משובחים.</li>
	<li>לרוקן את הבסיס עם PBS או בינוני כדי להפחית את המתח, אז, העברת כייר שהורכב על גבי הבסיס מילוי המילוי.</li>
	<li>הרטב את חלל עובש רשת PBS או במדיום באותה השיטה. לאט לאט למלא את spheroids לתוך חלל presupposed בגודל הרצוי (2 x 2 x 1 מ מ, 4 x 4 x 1 מ מ, או 6 x 6 x 1 מ מ). הערה: ודא כי 120% נפח הצפויה של spheroids מוזן לתוך החלל כך מצרפי תא יש קשר הדוק, נשאר סטטי.</li>
	<li>להרכיב את העליון נטו ואת הפלטה מרובע על ההודעות בפינה ולאבטח פקקים וצינורות אחזקות כדי למנוע כשלון של spheroids.</li>
	<li>להעביר את המערכת מלא עובש נטו צלחת 6-ובכן עם 6 מ של RPMI/B-27 תא מדיה או לתוך מיכל סטרילי עם מדיום מספיק כדי לכסות את התבנית שהורכב כולו.</li>
	<li>תקופת דגירה לצלחת 6-ובכן עם מערכת מלא עובש על מטרף מתנדנדים של 7-10 ימים ב 3000-4000 x g. הערה: משך הדגירה הוא החליט לפי גודל המדבקות הלב. טלאים גדולים יותר זמן הדגירה צריך להיות מוגברת על תיקון הלב ההבשלה.</li>
</ol>6. הסרת התיקון של העובש נטו הרומן
<ol><li>להסיר את המערכת עובש התקשורת ומניחים אותו על המשטח טיפול סטיריליים בקערה ס מ-10 סטרילי.</li>
	<li>הסר את הצינור אחזקות, פקקים, הפלטה מרובע, הרשת העליונה. החלק בזהירות את הרשתות בשכבות בצד אחד עם זוג מלקחיים סטרילי. לאחר decannulation, תיקון הלב שלם מתקבל על גבי התחתון נטו.</li>
	<li>להרים התחתון נטו עם התיקון באמצעות מלקחיים סטרילי ולהעביר התחתון נטו לתוך תבשיל 35 מ מ 5 מ של RPMI/B27 מדיה. בעדינות שחרר את התיקון מלמטה נטו מאת לאט מתערבל נטו בצלחת, או עם המגרד של התא סטרילי. לאחר ניתוק מלמטה נטו, רקמת הלב יכול להיות מחונן עם RPMI/B27 מדיה</li>
	<li>להמשיך דגירה התיקון לב לתרשים תלת-ממדי בצלחת 35 מ מ. מכות סינכרונית פונקציונלי יכול להיות שנצפו מוקדם ככל 24 שעות לאחר הסרת של העובש.</li>
	<li>לאחר הסרת התיקון כייר נטו, לבחון את צורתה נשמר עם יושרה, את עוצמת המכות סינכרונית גדל עם הזמן. הערה: תלת-ממדי נטו מבוסס-עובש לב המדבקות הציג שילוב חשמלי של רכיב cardiospheres לאחר decannulation. הבחנו תדר הכאה ועד 60 80 פעימות לדקה. זה נמשך יותר מ- 60 יום.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
<li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Microscale+Devices+to+3D+Printing%3A+Advances+in+Fabrication+of+3D+Cardiovascular+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues.</a> Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).</li>
<li>Tandon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+systems+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering.</a> Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).</li>
<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
<li>Lux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+large-scale+cardiac+patches+based+on+a+perfusable+starter+matrix+by+cyclic+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation.</a> Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix%3A+a+new+heart+muscle+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).</li>
<li>Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+seeded+with+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+promoted+the+regeneration+of+host+cardiomyocytes+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).</li>
<li>Caspi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+vascularized+cardiac+muscle+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.</a> Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-Free+Three-Dimensional+Bioprinting+of+Cardiac+Tissue+using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).</li>
<li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">3D culture for cardiac cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).</li>
<li>Langenbach, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+differentiation+of+microtissues+from+multipotent+precursor+cells+for+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture%3A+a+comparative+study+of+growth%2C+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המשמעות של שיטה זו נעוץ הפארמצבטית שלה ואת האפקטיביות של רקמת הלב הנובעת מרובה שכבות. בתחום של הנדסת רקמות הלב, אחת המטרות הנוכחית היא לזהות שיטה לבנות מכות מרובה שכבות, פונקציונלי תיקונים לב תלת-ממדי. . מדווחים שיטה לשחזור ויעילה של יצירת רקמות הלב מרובה שכבות על ידי זריעה ידנית ישירה של spheroids מורכב cardiomyocytes, תאי אנדותל ו fibroblasts לתוך תבנית נטו הרומן. כייר נטו להשתמש בשיטה זו יש מגוון רחב של גדלים שונים ליצירת רקמות 2 x 2 x 1 מ מ ועד 6 x 6 x 1 מ מ. כן, ניתן לשנות את הטכניקות שתיארנו צורות עובש שונים ולמערכ...

המטרה של הנדסת רקמות הלב הנוכחית היא לפתח טיפול כדי להחליף או לתקן את המבנה והתפקוד של רקמת שריר הלב הפצוע1. שיטות ליצירת דגמים תלת-ממדיים ברקמת הלב מפגין המאפיינים כויץ ו אלקטרופיזיולוגיות חשוב של רקמת הלב יליד במהירות הרחבת2,3. מגוון רחב של אסטרטגיות חקר ומשמשת מחקרים4,5. אלה שיטות נע בין שימוש ספציפי טבעיים וסינתטיים ביו hydrogels, כגון ג'לטין, קולגן, פיברין, פפטידים6, ביו-דיו התצהיר טכנולוגיות2 ו- bioprinting טכנולוגיות7.
הוכח, כי שיטות לגרדום ללא יכול לייצר רקמות דומות כמו שיטות מבוססות biomaterial, ללא החסרונות של שילוב חומרים זרים פיגומים8. אורן כספי. et al. הוכיח כי שילוב של סוגים שונים של תאים מאפשרת את הדור של vascularized מאוד אנושי ברקמת הלב מהונדסים9. הסנטר. ואח פיתח שיטה הדפסה תלת-ממדי עבור יצירת תיקון הלב של spheroids. תיקונים וכתוצאה מכך הם מורכב cardiomyocytes fibroblasts, תאי אנדותל יחס 70:15:1510. Spheroids הוכחו להיות יעיל "אבני בניין" הבריאה ברקמת הלב ללא לגרדום, כפי שהם עמידים נגד היפוקסיה ושולט מספיק מכנית השרשה11,12. מחקרים קודמים הדגימו מספר שיטות ייצור ספרואיד הבריאה, כולל השימוש של התליה זרוק שיטה, טווה מבחנות13, microfluidic מערכות14, משטחים שאינם מחסידי תרבות מצופה עם או ללא ציפוי מיקרו-עובש agarose15. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים התליה טיפה התקן, אשר מכיל את micropores עבור עיבוי מאות spheroids בבת אחת.
מחקר זה מציג של הרומן ובאיזו שיטה לגרדום ללא יעיל הבריאה ברקמת הלב, אשר כולל זריעה ידנית את spheroids לתוך חור מרובע עובש המקננת הרקמה על מטרף עבור ההבשלה. בתנאים הרגילים תרבות סטטי, דיפוזיה חמצן מוגבלת להיבטים החיצוניים של הבונה רקמות, וכתוצאה מכך נמק במרכז. עם זאת, עם העובש נטו, כל spheroids נזרע לתבנית שקועים בתקשורת עם תנועה fluidic קבוע, המאפשר פעפוע מוגברת של חומרים מזינים וחמצן. בנוסף, שיטה זו מבוססת על עובש מתיר יצירת סימולטני של רקמות בגדלים שונים מדבקות במינימום מאמץ ידנית, הרקמה הנובעת ניתן להסיר בקלות התבנית. שיטה חדשנית זו מאפשרת יצירת לשחזור ויעילה של מדבקות לב נטולת לגרדום, מרובה שכבות.

<table><tbody><tr><td>פיברובלסטים לבביים אנושיים (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 מורכב ממדיום בסיסי</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF מדיום תרבית</td></tr> וריד <tr><td>טבורי אנושי (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC מדיום E8 מדיה</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>מדיום תרבית HiPSC</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>טריפסין וריאגנט דיסוציאציה</td></tr><tr><td>של תאים מדיה RPMI</td> מדיה <td>11875093</td> RPMI של <td>Invitrogen</td><td>עם תוסף B-27 היא מדיום תרבית hiPSC-CM</td></tr><tr><td>תוסף B-27 (פי 50)</td> מדיה <td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>RPMI עם תוסף B-27 היא מדיום תרבית hiPSC-CM</td></tr><tr><td>טריפאן כחול פתרון, 0.4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>עובש רשת חדשני&nbsp;</td><td>TissueByNet ושות', בע"מ</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>צלחת טיפה תלויה</td><td>Kuraray ושות', בע"מ</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>6 באר צלחות&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

פרוטוקול זה מתאר של הרומן נטו מבוסס-עובש שיטה קלה ליצירת תלת-ממדיים (3-D) רקמות הלב ללא חומר נוסף לגרדום. Pluripotent אנושית-induced גזע-תא-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), fibroblasts הלב האנושי (HCFs), יפתור תאי אנדותל (HUVECs) הם מבודדים, המשמש ליצירת השעיה התא עם 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, ו- 15% HUVECs. . הם תרבותי משותף במערכת "התלויים טיפה" מצורף נמוך במיוחד, אשר מכיל את micropores עבור עיבוי מאות spheroids בבת אחת. התאים צבירה ויוצרים באופן ספונטני המכות spheroids אחרי 3 ימים של תרבות משותפת. Spheroids שנקטפו, נזרע לתוך החור עובש הרומן, תרבותי על מטרף בחממה. Spheroids להפוך רקמה תפקודית בוגרת כ 7 ימים לאחר זריעה. הרקמות מרובה שכבות הנובעת מורכב מאוחה spheroids עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני. שיטה חדשה זו יש פוטנציאל מבטיח כשיטה לשחזור וחסכונית ליצירת רקמות מהונדסים לטיפול באי ספיקת לב בעתיד.

בניסויים שלנו, אנחנו מנוצל השעיה תא של 70% iPSC-CMs, HCFs 15% 15% HUVECs בתקשורת תא RPMI/B-27-ריכוז של תאי 2,475,000 מ. לאחר יצירת התליה תא, וויתרנו 4 מ"ל של התליה תא כדי כל טוב של מצורף נמוך במיוחד תלוי במערכת המסירה, כפי שמתואר בשלב 4.3 של הפרוטוקול. השימוש של התליה מערכת טיפה, גרמו היווצרות ספונטנית של מאות להכות spheroids אחרי 3 ימים של תרבות-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות. Spheroids נצפו בקלות כדי להיות פועם תחת מיקרוסקופ אור בבית 4 X 10 X הגדלה עם קוטר ממוצע של מיקרומ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה וקלה מבוססת עובש ליצירת רקמת לב תלת מימדית, המשתמשת בספרואידים ככלי ליצירת רקמת לב ללא פיגומים. בניסויים שלנו בודדו שלושה סוגי תאים, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, פיברובלסטים לבביים אנושיים ותאי אנדותל של וריד הטבור האנושי ושימשו ליצירת תרחיף תאים. עם 70% קרדיומיוציטים, 15% פיברובלסטים ו-15% תאי אנדותל, בצינור חרוטי של 50 מ"ל.לאחר מכן אנו מחלקים את תרחיף התא לכל באר של מערכת טיפות תלויות בחיבור נמוך במיוחד, מה שיביא להיווצרות ספונטנית של מאות ספרואידים פועמים לאחר שלושה ימים. לאחר מכן נקצרים הספרואידים ומושבים בחלל עובש חדש. לאחר מכן הרקמה נשמרת במיכל סטרילי עם מדיום, על שייקר בחממה למשך מספר ימים.העובש מוסר לאחר מכן, וכתוצאה מכך נוצר תיקון רקמות ללא פיגומים עם שלמות מכנית. מכשיר הטיפה התלויה הוא באר חיבור רב-פעמית ונמוכה במיוחד עם 850 נקבוביות מיקרו, כל אחת בקוטר 350 מיקרון. הטיפה התלויה תואמת ללוחות סטנדרטיים של שש בארות.לאחר ביצוע תרחיף התאים אנו מחלקים ארבעה מיליליטר של תרחיף תאים המכילים 10 מיליון תאים, לכל באר של מערכת הטיפה התלויה. המכשירים מתורבתים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות. לאחר 72 שעות נצפתה היווצרות ספונטנית של ספרואידים פועמים, בקוטר ממוצע של 350 מיקרון.הספרואידים נקצרים על ידי הנחת מכשיר הטיפה התלוי בצלחת אחרת עם מדיום, ומערבולת עדינה כדי לשחרר את הספרואידים ולאפשר להם להיסחף דרך הנקבוביות בתחתית מערכת הטיפה התלויה. זהו סכמטי של התבנית החדשה ליצירת רקמת לב תלת מימדית, ללא פיגומים. הוא כולל את שטיח הטיפול, בסיס המילוי והתבנית החדשנית.התבנית החדשנית מורכבת מבסיס, צלחת מרובעת תחתונה, רשת תחתונה, 10 שכבות של רשתות צד העשויות משיני נירוסטה עדינות. רשת עליונה, צלחת מרובעת עליונה, צינורות האחיזה וסיכות פקק. מערכת Novel Mold יכולה ליצור גדלים שונים של רקמות, כולל שניים על שני מילימטרים, ארבעה על ארבעה מילימטרים ושישה על שישה מילימטרים.הצלחת המרובעת התחתונה הבסיסית והרשת התחתונה נערמות ומיושרות באמצעות עמודי הפינה. לאחר מכן נערמות 10 שכבות של רשתות צד בכיוונים מתחלפים ליצירת רשת של שיני נירוסטה עדינות, בעזרת זוג מלקחיים סטריליים. לאחר מכן נשטף בסיס המילוי בתמיסת חיץ פוספט 1X, או PBS, כדי להפחית את מתח הפנים לפני הכנסת הספרואידים לתבנית החדשה.לאחר הרטבת חלל התבנית החדש באותו מתאן, הספרואידים יושבים לתוך החלל המשוער מראש בגודל הרצוי. עם הישיבה המדיום העודף מתנקז דרך תבנית הרשת, ומאפשר לספרואידים למלא וללבוש את צורת החלל שהוגדר מראש. לאחר מכן מורכבים הרשת העליונה והצלחת המרובעת העליונה על עמודי הפינה וסיכות הפקק וצינורות האחיזה קבועים, כדי למנוע שטיפה של הספרואידים.מערכת התבנית החדשה הממולאת מועברת לצלחת של שש בארות, עם שישה מילימטרים של מדיום בתוספת B-27, ולאחר מכן נשמרת בחממה על שייקר מתנדנד במשך שבעה עד עשרה ימים, במהירות של 30 עד 40 סל"ד. ניתן לשנות את משך הדגירה, בהתאם לגודל מדבקת הלב. לאחר הדגירה מוציאים את המערכת ומסירים את צינור האחיזה, הפקקים, הצלחת המרובעת העליונה והרשת העליונה.רשתות הצד השכבות מחליקות בזהירות החוצה אחת אחת, תוך הקפדה לא לשבש את הרקמה. לאחר הסרת כל רשתות הצד, מתקבלת טלאי לב שלם על גבי הרשת התחתונה. פעימות סינכרוניות תפקודיות נצפות תוך 24 שעות.שיטה חדשנית זו המבוססת על עובש היא שיטה יעילה וקלה ליצירת רקמות לב תלת מימדיות ללא פיגומים, במינימום מאמץ ידני. הרקמות הרב-שכבתיות המתקבלות מורכבות מספרואידים מאוחים עם שלמות מבנית משביעת רצון והתנהגות פעימות סינכרונית. שיטה חדשה זו המבוססת על עובש מציגה אלטרנטיבה חסכונית וניתנת להרחבה לשיטות הייצור הביולוגי הנוכחיות של רקמות מהונדסות.

a-net-mold-based-method-scaffold-free-three-dimensional-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים ייצור של שכבות תרבית תאי לב ביומימטיות העשויות משני חומרים פולימריים נפרדים באמצעות ליתוגרפיה של כוח נימי.  השיטות המתוארות מספקות טכניקה ניתנת להרחבה וחסכונית להנדסת המבנה והתפקוד של רקמות לב מקרוסקופיות ליישומי in vitro ו-in vivo.

נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב

הדור של רקמת שריר לב מיושר הוא דרישת מפתח להתאמת ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע למטרות שימושיות מבחינה קלינית. להלן נתאר גישת הדפסת microcontact לשליטה המדויקת של צורת תא ותפקודו. שימוש באוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי גזע עובריים מופקים אבות לב, אז אנחנו מייצרים רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי.

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

במחקרים אלה, אנו מספקים מתודולוגיה חדשנית, בילוד, פיגומי לב בעכברים לשימוש במחקרים רגנרטיבית.

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

מודלים ספציפיים למטופל משפרים את הביטחון של המנתחים ואת המנתחים בעת פיתוח או למידה של תוכניות כירורגיות. מדפסות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) מפיקות פרטים מתאימים להכנה כירורגית, אך אינן מצליחות לשכפל אמינות הפטית של רקמות. מוצג פרוטוקול המפרט את יצירתם של מודלים לב סיליקון ספציפיים למטופל, המשלבים דיוק הדפסה תלת-ממדי עם רקמת סיליקון מדומה.

יצירת מודלים לב סיליקון ספציפיים למטופל עם יישומים בתוכניות טרום ניתוחיות והכשרה מעשית

מוצגת שיטה הניתנת לשחזור ליצירת רקמות שריר הלב תלת מימדיות המשלבות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס (MEW), פיגומי פוליקפרולקטון (PCL) והידרוג'לים פיברין עם קרדיומיוציטים ופיברובלסטים שמקורם ב-hiPSC. טכניקה זו מציעה שליטה מדויקת על ארכיטקטורת הפיגומים וניתן ליישם אותה בבדיקות תרופות פרה-קליניות ובמודלים של מחלות לב.

יצירת רקמת שריר הלב האנושית בתלת מימד באמצעות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס של פיגומי פוליקפרולקטון ותאי לב שמקורם ב-hiPSC

למדו שיטה חדשנית מבוססת עובש ליצירת רקמות לב תלת-ממדיות ללא גרדום באמצעות ספרואידים. השיטה משתמשת בקרדיומיוציטים, פיברובלסטים ותאי אנדותל ליצירת רקמות פועמות בסנכרון.

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

גלה סרטונים נוספים