העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγ^null מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

עניינים אלה יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר HIV / איידס, כגון המנגנון המולקולרי ואת הפרוגנוזה של הידבקות ב- HIV, וכיצד והיכן הוקם מאגר ההשהיה. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא אינה פולשנית, והקימה עכברי הו-NSG שחייבים לטפל בהתפתחות רב-שושלתית על פני תאי גזע אנושיים מושתלים הרגישים לזיהום ב- HIV והם פתוחים ל- cART. התחל על ידי סינון מתעכל, אדם, עובר, רקמת כבד, דגימת תרחיף באמצעות סטרילי, 70 מיקרומטר, ניילון, מסננת רשת כדי לקבל השעיה תא יחיד, ולהעשיר עבור CD34 + HSCs על ידי מיון תאים מופעל מגנטי על פי הוראות היצרן.

לאחר הספירה, להשעות מחדש את HSC ב פעמיים עשר עד השביעי תאים קיימא לכל ריכוז מיליליטר ב DPBS טרי על קרח. במקום הבא כלוב הקרנה אנושי יילודים שלם NOD / SCID / גמא או NSG עכבר לתוך סטרילי, בצורת עוגה, כלוב הקרנה, ולטפל בבעלי החיים עם 200 עד 250 סנטימטרים של קרן גמא ממקור קרינה צסיום-137. לאחר מכן לטעון את התאים לתוך מותאם אישית, המילטון 80508 50 מיקרוליטר מזרק מצויד מחט 30-מד, ולהזריק כל חיה יילודים ישירות לתוך הכבד עם חמש פעמים עשר עד החמישי קיימא CD34 + HSCs ו 25 microliters של DPBS.

עשרה עד שתים עשרה שבועות לאחר זיהום, ספין למטה רטרו מסלולית, היקפי, דגימות דם מכל עכבר על ידי צנטריפוגה, ולהעביר את supernates פלזמה צינורות microcentrifuge עבור אחסון שלילי 80 מעלות צלזיוס כמתאים באופן ניסיוני. עבור אימות חריטה HSC, להשעות מחדש את כדורי עם 200 microliters של חיץ תמוגה תא דם אדום, ולמשוך את מתלי התא בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מילימטר עבור דגירה של עשר דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לאסוף את תאי הדם הלבנים הנותרים על ידי צנטריפוגה עבור שתי שטיפות ב 0.5 מיליליטר של טרי, 0.01 אחוז אלבומין סרום בקר, או BSA, ב DPBS לכל לשטוף.

לאחר הכביסה השנייה, לחסום את התאים עם 100 microliters של חסימת קוקטייל במשך עשרים דקות ב 4 מעלות צלזיוס ואחריו תיוג עם קוקטייל אנטי גוף המתאים של עניין ב 2 microliters של אנטי גוף לריכוז תאים חד פעמיים עד שישית. לאחר 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים פעמיים DPBS טרי בתוספת BSA, ולהעריך את דגימות הדם ההיקפיות על ידי cytometry זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים כדי לכמת את אחוז אנושי CD45 + CD3 + CD14 + או CD19 + תאים לכל מדגם. לאחר מכן לחשב את היחס של CD4 + ל-CD8 + T תאים, ולהעריך את העומס ויראלי עם בדגימות פלזמה על פי רגיל, כמותי, תעתיק הפוך, פרוטוקולי PCR.

כדי להעריך את ההשפעות של הידבקות ב- HIV, לספק וירוס HIV bale כדי הרדמה, אדם, עכברי NSG עם יותר מ 20 אחוז אנושי CD45 + אוכלוסיית תאים בדם ההיקפי שלהם, ב 200 ננוגרם של P24 לכל ריכוז העכבר באמצעות ממשל תוך-פרטי, איסוף דגימות דם באמצעות דימום רטרו-מסלולית כל שבועיים, ולנתח הן את יחס CD4-ל-CD8 ואת עומס פלזמה ויראלי כפי שהוכח. עבור אימות דיכוי ויראלי לספק את נגועים, בעלי חיים NSG אנושי עם טרי, קומבינטורית, טיפול אנטי רטרו-ויראלי, או cART, במים ממותקים כל שבוע במשך 4 שבועות, איסוף דגימות דם באמצעות דימום רטרו מסלולית כל שבועיים ולנתח הן את יחס CD4-ל-CD8 ואת העומס נגיפי פלזמה כפי שהודגם. כדי התחת ריבאונד ויראלי כאשר העומסים נגיפי פלזמה הם מתחת למגבלת הזיהוי ואת יחס CD4-ל-CD8 משוחזר בין 1.5 ו 2.5 לאסוף דגימות דם היקפיות באמצעות דימום רטרו-מסלולית כל 2 שבועות לאחר נסיגת cART ולהעריך את הדגימות כפי שהוכח.

במהלך אימות חריטה ראשוני, ספירת תאים CD45 + אנושי צריך לנוע בין 20 ל 80 אחוזים, ואת קבוצות המשנה של לויקוציטים אנושיים צריך להופיע כמו אוכלוסיות דיסקרטיות על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה. היחס בין תאים CD4+ל-CD8+נשאר בין 1.5 ל-2.5 אצל אנשים בריאים, בעוד דלדול משמעותי של תאי CD4+T נצפה בדרך כלל על זיהום ויראלי. יש לציין, היחס הבריא משוחזר בתגובה לטיפול cART.

זיהוי של עומסים נגיפיים פלזמה על ידי PCR RT כמותי לאורך כל הזיהום ואת משטר cART ניתן לתכנן ושמש כדי להעריך את היעילות של משלוח ויראלי ואת הטיפול האנטי ויראלי, בהתאמה. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך HIV / איידס וירולוגיה מחקרים ופיתוח טיפולי, זה יכול להיות מיושם גם על מחקרים אחרים הקשורים למחלות אנושיות, כגון סרטן, סוכרת, ומחלות אוטואימוניות. פיתוח מודל העכבר hu-NSG סלל את הדרך לחוקרים באימונולוגיה ובאונקולוגיה לחקור תפקוד לקוי ופתולוגיה חדשים בבני אדם, במיוחד מחקרים מכניים וטיפוליים המכוונים לזיהום כרוני ב- HIV ומאגר ההשהיה.