Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביוכימיה של PCSK9 כגון אילו תרופות או שינויים גנטיים משפיעים על התפקוד הפרוטאוליטי של PCSK9. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת קריאה מהירה וניתנת להגברה של אירוע ביוכימי בתדר נמוך באופן מהותי. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מחלת לב טרשת עורקים מכיוון שתפקוד פרוטאוליטי PCSK9 נדרש להשפעתו הסופית על רמות הכולסטרול בסרום.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי PCSK9 עצמו, ניתן ליישם אותה גם על מערכות ביוכימיות אחרות כגון פרוטאזות אחרות עם פעילות פרוטאוליטית נמוכה באופן מהותי. כדי להתחיל, שאפו מדיום מכל תאי HEK293 T. יש לשטוף עם PBS, ולטפל בנפח מינימלי של 0.5% טריפסין-EDTA.

ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות כדי לנתק את התאים מבקבוק האב. הוסף שני כרכים של DMEM בתוספת 10%FBS כדי להשבית את ה-Trypsin-EDTA. לאחר מכן פיפטה את הנוזל בבקבוק למעלה ולמטה מספר פעמים, עקור את התאים הדבקים והעביר את התאים לצינור סטרילי.

לאחר מכן, הסר כמות קטנה של תאים. צבעו בנפח שווה של טריפן כחול והעבירו את התאים המוכתמים לשקופית, והשתמשו במונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים. צנטריפוגה של הצינור ב-500 פעמים G למשך חמש דקות כדי לשחזר את התאים.

לאחר מכן, שאפו את המדיום והרכיבו מחדש את התאים ואת מדיום התרבות לריכוז הרצוי. בעזרת פיפטה רב-ערוצית ושוקת סטרילית, העבירו 100 מיקרומטר מהתאים בכל באר לצלחת לבנה של 96 בארות. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.

לאחר מכן, הכן את צלחת הפלסמידים לריכוז הרצוי לטרנספקציה, כולל ארבע בארות כל אחת עבור פלסמיד בקרה חיובית, פלסמיד בקרה שלילית ומאגר ללא פלסמיד. ראשית, הכינו תערובת מאסטר של מגיב טרנספקציה ליפידים מדולל ותערובת מאסטר של מגיב קדם-קומפלקס DNA. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב-ערוצית ושוקת סטרילית, יש להוציא 16.8 מיקרוליטר של מגיב קדם-קומפלקסציה של DNA מדולל לכל באר של צלחת באר עמוקה.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי להעביר 3.2 מיקרוליטר מכל פלסמיד מהצלחת הראשית לכל באר של צלחת הבאר העמוקה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להוסיף 20 מיקרוליטר מתערובת ריאגנט טרנספקציה ליפידים מדולל לכל באר של הצלחת ולערבב היטב. מכסים את הצלחות ונותנים להן לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות ליצירת קומפלקסים של DNA שומנים.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי להסיר בעדינות את המדיום מ-293 תאי ה-T בצלחת 96 הבארות. לאחר מכן, החלף את המדיום ב-95 מיקרוליטר DMEM בתוספת 10% FBS. לאחר מכן, השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי להוסיף 10 מיקרוליטר מתערובת הטרנספקציה לכל באר מתאימה.

לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. ראשית, הכינו את פתרונות המלאי הנדרשים לייצור מגיב בדיקת קולנטרזין בעל חוזק כפול, כולל שלושה נתרן אסקורבט מולרי ב-PBS, חמישה נתרן כלורי מולרי במים מזוקקים, 10 מיליגרם למיליליטר BSA ב-PBS, ושני מיליגרם קולנטרזין מולרי במתנול מחומצן. לאחר מכן, הכינו מספיק ריאגנטים של קולנטרזין לקריאת לוציפראז.

עם מגיב נפרד לכל אחד מהתאים במדיום. לאחר מכן, מערבבים את כל הריאגנטים הצפויים ל-Coelenterazine. מסננים את התערובת דרך פילטר מזרק של 0.22 מיקרומטר.

ואז לאחר הסינון, מוסיפים את ה-Coelenterazine. הסר את התאים מהחממה 24 שעות לאחר הטרנספקציה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי להעביר 50 מיקרוליטר של מדיום ממוזג מכל באר לצלחת לבנה טרייה של 96 בארות.

השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי להוסיף 50 מיקרוליטר של מגיב קולנטרזין לא ליטי בעל חוזק כפול לצלחת המכילה מדיום מותנה בלבד. לאחר מכן, נערו בעדינות את הצלחת בחושך למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חזור על שלב זה על ידי הוספת המגיב הליטי קולנטרזין בעל חוזק כפול לצלחת המכילה את התאים.

לאחר הדגירה, מדוד את הזוהר של הלוח הבינוני בלבד והצלחת המכילה את התא בקורא צלחות. לבסוף, השליכו את הלוחות ושמרו את הקבצים להמשך ניתוח נתונים. חשוב לדגור את המגיב לוציפראז עם הלוח הבינוני בלבד והצלחת המכילה תאים למשך אותו פרק זמן מכיוון שהנתונים עבור לוחות אלה מושווים ישירות.

בפרוטוקול זה, ספציפיות רצף המחשוף של פרוטאז PCSK9 באתרי מצע P6 עד P6 Prime הוערכה על ידי בדיקת לוציפראז. השינויים ברצף המחשוף במיקומים P6 ו-P4 עד P1 Prime נסבלים בצורה גרועה על ידי הפרוטאז. אבל הפוזיציות P5 ו-P2 Prime עד P6 Prime גמישות יותר לשינוי.

בנוסף, התוצאות מראות שרצפי המחשוף האופטימליים זהים במהותם לרצף מסוג Wild. פעילות המחשוף היחסית של ספריית חיתוכים שגויים שנמצאה במרפאה הושוותה לפרוטאז מסוג פראי. מתוך 84 הצלפים שהוערכו, יותר ממחציתם הראו שינויים משמעותיים בפעילות בהשוואה לפרוטאז מסוג פראי, מה שמצביע על כך ששינויים בפעילות הפרוטאז נצפים לעתים קרובות באוכלוסייה הקלינית.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון זרימה ציטומטרית או מבחני ספיגת כולסטרול בהפטוציטים כדי להעריך שינויים ביכולת הפרוטאוליטית של PCSK9 על השפעת PCSK9 על קולטן ה-LDL.