Name: הפקת גין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: למדו לייצר מוטנטי מחיקה ב-Escherichia coli באמצעות התמרה חושית של P1 עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה. שיטה מהירה ואמינה לחקר פונקציות גנים במיקרוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

קאיו אוסף זנים התקבלו מפרוייקט BioResource הלאומית (כוש, יפן): e. coli. אנו מודים החיבור דירק (המחלקה של החיים, אוניברסיטת אוסלו) על תמיכתו המתמשכת. עבודה זו מומן על ידי המועצה למחקר של חוקר צעיר נורבגיה גרנט 249793 (כדי ג'ק ג לאו).

<ol><li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unexhausted+potential+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826(2015).</li>
<li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li>
<li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+precise+deletions+and+insertions+in+the+genome+of+wild-type+Escherichia+coli%3A+application+to+open+reading+frame+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization.</a> Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).</li>
<li>Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+in+vivo+genetic+engineering+in+E.+coli%2C+S.+enterica%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond.</a> Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Recombinogenic+engineering--new+options+for+cloning+and+manipulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+Keio+collection+of+Escherichia+coli+single-gene+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants.</a> Molecular Systems Biology. 5, 335(2009).</li>
<li>Baba, T., Huan, H. -C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applications+of+systematic+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutant+collection+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12.</a> Methods in Molecular Biology. 416, Clifton, NJ. 183-194 (2008).</li>
<li>Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyamines+are+not+required+for+aerobic+growth+of+Escherichia+coli%3A+preparation+of+a+strain+with+deletions+in+all+of+the+genes+for+polyamine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).</li>
<li>Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+simvastatin+bioconversion+in+Escherichia+coli+by+deletion+of+bioH%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH.</a> Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).</li>
<li>Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+hydrogenase+3+is+a+reversible+enzyme+possessing+hydrogen+uptake+and+synthesis+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).</li>
<li>Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+disulfide+bond+formation+pathway+is+essential+for+anaerobic+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).</li>
<li>Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+approach+to+identify+the+genes+involved+in+biofilm+formation+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli.</a> DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).</li>
<li>Heinz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+features+in+the+structure%2C+mechanism%2C+and+biogenesis+of+the+inverse+autotransporter+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).</li>
<li>Selkrig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+an+archetypal+protein+transport+system+in+bacterial+outer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).</li>
<li>Stubenrauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+assembly+of+fimbriae+in+Escherichia+coli+depends+on+the+translocation+assembly+module+nanomachine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16064(2016).</li>
<li>Leo, J. C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li>
<li>Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+adhesin+A+%28YadA%29+-+Beauty+%26+beast%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty & beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464(2017).</li>
<li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+in+Escherichia+coli%3A+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li>
<li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), London, UK. 1021-1030 (1993).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+%CE%B2-barrel+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 157-167 (2015).</li>
<li>Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li>
<li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., et al. E. coli genome manipulation by P1 transduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomason%2C+LC+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 1, Unit 1.17 (2007).</li>
<li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0042682269901445">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li>
<li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li>
<li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li>
<li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li>
<li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li>
<li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li>
<li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li>
<li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus%3A+use+for+complementation+and+recombinational+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

התמרה חושית P1 הוא שיטה מהירה, חזקה ואמינה ליצירת ג'ין מחיקות ב e. coli. זה מומחש פה transducing מוטציה מחיקה תמ א של זן התורם קאיו לנמען נגזר BL21. השלבים העיקריים בתהליך התמרה חושית הן את הייצור של transducing lysate, את התמרה חושית עצמה, הכריתה של קלטת ההתנגדות קאן, ואימות של עקום החוצה על ידי ה-PCR. בסך הכל, התהליך לוקח בערך שבוע 1 ודורש אין שיטות בביולוגיה מולקולרית כדי לשמש, מלבד ה-PCR הסופי עבור האימות. לפיכך, התמרה חושית P1 יכול להתחרות המתכלים במאמץ ובזמן עם λ רקומבינציה אדום, הוא מהיר יותר מסו...

גישה ראשונה משותפת ללמוד את הפונקציה של הגן הוא ביצוע מעלף מוטגנזה מכוונת ולבחון את פנוטיפ וכתוצאה מכך. זה נקרא גם גנטיקה הפוכה. חיידק e. coli כבר סוס עבודה של ביולוגיה מולקולרית במשך 70 השנים האחרונות, או אז, בגלל הקלות של culturing שלה, שלה amenability מניפולציה גנטית1. פותחו מספר שיטות כדי לייצר ג'ין מחיקות ב e. coli, כולל סמן exchange מוטגנזה מכוונת2,3 , לאחרונה, recombineering באמצעות λ אדום או Rac ET מערכות4,5 , 6.
במערכת בשימוש נרחב, קידוד רצף של גנים יחידניים מוחלפים קלטת עמידות לאנטיביוטיקה זה אפשר להוציא אחר כך5,של כרומוזום7. רצפי קידוד מוחלפים, למשל קלטת ההתנגדות kanamycin (קאן), אשר מוקף flippase (FLP) זיהוי אתרי היעד (והשפלתם) משני הצדדים. האתרים והשפלתם מזוהים על-ידי recombinase FLP, אשר שמתווכת בייעודי לאתר רקומבינציה בין האתרים והשפלתם שמוביל המחיקה של קלטת קאן. בדרך זו, פעולת מחיקה מלאה של רצף קידוד של גן מסוים יכולה להיות מושגת, משאיר מאחור רק צלקת מינימלית רצף של בסיסי כ-100 זוגות (bp) (איור 1).
רק לפני כעשור, פותחה האוסף קאיו כביכול. זוהי ספרייה חיידקי בהתבסס על מעבדה סטנדרטיים זן K12 e. coli , שבו כמעט כל הגנים שאינם חיוניים נמחקו בנפרד על ידי λ רקומבינציה אדום7,8. בתוך אוסף זה כל שלשיבוטים רצף קידוד אחד הוחלפו קלטת התנגדות ניתן לניתוח קאן. האוסף קאיו הוכיחה להיות כלי שימושי עבור יישומים רבים9. יישום אחד כזה הוא הייצור של מחיקה מוטציות בזנים אחרים e. coli . יכול להיות גייסה בקלטת קאן שיבוט נתון מחיקה מאת בדרך כלל transducing bacteriophages, כגון P110,11,12,13,14. מניה phage שהוכנו בכזה מתח יכול לשמש לאחר מכן להדביק את הנמען e. coli זן של עניין, איפה בתדר נמוך אבל אמין קן אזור המכילים קלטת ניתן לשלב לתוך הגנום הנמען מאת רקומבינציה הומולוגית (איור 2). Transductants ניתן לבחור את הצמיחה על המדיום המכיל קאן. בעקבות זאת, אם הסרת הקלטת עמידות לאנטיביוטיקה היא הרצויה, recombinase FLP יכולות להיות מסופקות המתח transductant טרנס. לאחר ריפוי של פלסמיד המכיל FLP, אשר נושאת סמן ההתנגדות אמפיצילין (אמפר), שיבוטים קאן לבין מגבר רגיש מוקרנים במשך ולאחר הכריתה הנכון של הרצף פראי-סוג קידוד ובקלטת קאן אומתו המושבה PCR.
. הנה, פרוטוקול מפורט מוצג, המתארת את כל השלבים בהפקת זן e. coli בהתבסס על האסטרטגיה שפורטו לעיל את מדהימה. כדוגמה, הוא הפגין מחיקה של הגן בתמ א . תמ א מקודד חלבון β-חבית של הממברנה החיצונית היא חלק של הובלה, הרכבה מודול (TAM), אשר עוסקת להן autotransporter חלבונים מסוימים, pili15,16,17. זן זה מעלף שימש אז כדי לבחון את ההשפעה של המחיקה תמ א על להן של trimeric autotransporter שתי adhesins (תעש), adhesin Yersinia את ידה של אימונוגלובולין e. coli (Ig)-מחייב TAA EibD 18,19.

<table><tbody><tr><td>זנים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>זן מסוג בר של אוסף Keio</td></tr><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>זן ביטוי</td></tr><tr><td>E. coli BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>נגזר מ-BL21(DE3)</td></tr><tr><td>E. coli JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC<</td><td>em>tamA מוטציה מחיקה</td></tr><tr><td>P1 vir</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>בדרך כלל מתמר בקטריופאג'</td></tr><tr><td><חזק>פלסמידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>משכפל מותנה עם FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>וקטור ביטוי</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לייצור EibD; פלסמיד זמין לפי בקשה</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>וקטור ביטוי</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לייצור YadA; פלסמיד זמין לפי בקשה</td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים</חומצה חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטית</td><td>ThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד קולגן מסוג I COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>קולגן בקר מסוג I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>די-נתרן מימן פוספט</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>צבע DNA</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>סמן גודל מולקולרי DNA</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP מצע</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG-HRP</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי ארנב IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל תיוגלקטוסיד</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>מנגן כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>N- לאורואיל סרקוזין</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב רזה</td><td>סיגמא</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>tamA פריימר קדימה</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>רצף 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'</td></tr><tr><td>tamA פריימר הפוך</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>רצף 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'Taq</td></tr> <tr><td>DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>טרי-סודיום ציטראט</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</ תא</td> אלקטרופורזה ג'ל חזק><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>מקצף חרוזים</td><td>תרמו</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>קודאק</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>קובטות אלקטרופורציה</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>יחידת אלקטרופורציה</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת ג'ל</td><td>Nippon גנטיקה</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>שייקר דגירה</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>תנור מיקרוגל</td><td>סמסונג</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCR מכונת</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>PCR רצועות</td> <td>PCRAxygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת PVDF ThermoFisher</td><td></td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה SDS-PAG</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>בקמן קולטר</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>יחידת העברה רטובה</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

הפקת ג'ין מחיקות ב- escherichia coli מאת p1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

בגישה הראשונה ללמוד את תפקוד ג'ין לא ידוע של חיידקים היא ליצור את מדהימה של הגן הזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול חזקה ומהירה להעברת מחיקה מוטציות מהמאמץ Escherichia coli אחד למשנהו באמצעות bacteriophage P1 שימוש התמרה חושית מוכללת. שיטה זו דורשת כי המוטציה להיות ניתן לבחירה (למשל, בהתבסס על הפרעות גנטי באמצעות קלטת לאנטיביוטיקה הוספות). קלטות לאנטיביוטיקה כזה יכול להיות גייסה מכל זן התורם מוחדרים זן הנמען עניין במהירות, בקלות ליצור מוטציה מחיקה ג'ין. ניתן לעצב בקלטת לאנטיביוטיקה כדי לכלול flippase זיהוי אתרים המאפשרים הכריתה של הקלטת על ידי recombinase בייעודי לאתר כדי לייצר את מדהימה נקי עם רק צלקת ~ 100-בסיס-זוג-ארוך רצף הגנום. אנו מדגימים את הפרוטוקול על ידי לדפוק את הגן של טאמה קידוד גורם הרכבה מעורב autotransporter להן, לבחון את השפעת הזה מעלף על להן והתפקוד של שני trimeric autotransporter adhesins. למרות המחיקה הגן על ידי התמרה חושית P1 יש מגבלות משלו, קלות ומהירות של יישומה להגיע חלופה אטרקטיבית בשיטות אחרות של ג'ין מחיקה

מהדור תמ א הנוק-אאוט של BL21ΔABCF:
האסטרטגיה שפורטו לעיל בעבר שימש כדי לייצר זן נגזרות של BL21(DE3), זן מעבדה סטנדרטי המשמש לייצור חלבון, אשר אופטימיזציה עבור ייצור החלבון הממברנה החיצונית, שנקרא BL21ΔABCF21. זן זה חסר ארבעה גנים קידוד חלבונים בשפע הממברנה החיצונית, כתוצאה מכך, הוא מסוגל לייצר חלבונים הממברנה החיצונית ביטוי יותר heterologously מאשר המתח פראי-סוג. כדי לבדוק אם TAM מעורב TAA להן, הגן ...

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

שיטה זו שימושית בתחום המיקרוביולוגיה, כגון גילוי התפקודים של גנים ספציפיים. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שמדובר בדרך מהירה ואמינה ליצירת מוטציות נוקאאוט של E.Coli. מי שידגים את ההליך הזה יהיה תומאס טראנק, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להדביק זן תורם המכיל מחיקת גנים המבוססת על קלטת אנטיביוטיקה הניתנת לכריתה, ראשית, יש לגדל את החיידקים בחמישה מיליליטר של מרק ליזוגני, או LB, עם עשרה מילי-מולרי סידן כלורי, ואופציונלי, עם 25 מיקרוגרם למיליליטר של קנמיצין, לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של כ-1.0. הכינו סדרת דילול של מלאי פאג'ים P1 קיים במדיום LB, וערבבו 200 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים עם 100 מיקרוליטר כל דילול פאג'ים בצינורות צנטריפוגה בודדים של 15 מיליליטר. דגרו את הצינורות באופן סטטי למשך 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.בתום הדגירה מוסיפים לצינורות כשלושה מיליליטר אגר עליון מותך, בתוספת עשרה מילי-מולרי סידן כלורי. מערבבים את התוכן על ידי מערבולת, ויוצקים את התערובות על צלחות LB מחוממות מראש ליצירת שכבות אחידות. לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.למחרת בבוקר, בחר צלחת עם גידול חצי קונפלונטי של פלאק פאג'ים והשתמש בלולאת חיסון כדי לגרד את שכבת האגר העליונה לתוך צינור צנטריפוגה. מתחת למכסה האדים, הוסף מיליליטר אחד עד שניים של LB וטיפה של כלורופורם לצינור, וסוב

producing-gene-deletions-escherichia-coli-p1-transduction-with

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ"א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

שיטה יעילה הגנום בודדה גן מוטציה כבר נקבעה...

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

מקור: Valentine, M. E., et al. יצירת מוטציות של מחיקת גנים בתוך המסגרת ב-Pseudomonas aeruginosa ובדיקת הנחתת אלימות במודל עכבר פשוט של זיהום. J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים את הדור של רקומביננטים מוצלבים כפולים ב-Pseudomonas aeruginosa באמצעות אסטרטגיית מחיקת גנים מבוססת פלסמיד. התהליך כולל בחירת חיידקים המכילים פלסמיד שאינו משכפל המשולב בגנום באמצעות הצלבה בודדת ולאחר מכן גרימת אירוע רקומבינציה שני תחת בחירת סוכרוז כדי לכרות את הפלסמיד. רקומבינציה מוצלחת של הצלבה כפולה מאושרת על ידי אובדן...

יצירת רקומביננטים מוצלבים כפולים של Pseudomonas aeruginosa למחיקת גנים ממוקדת

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

כאן נציג של השיטה הניסיונית כדי לבחון את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומשתנה של מודל העכבר של זיהום כדי להעריך את הנחת של זנים מהונדסים גנטית של הפסאודומונס aeruginosa בהשוואה לארצות הברית מינהל המזון והתרופות (FDA)-מאושר es, האנציכיה ליישומים מסחריים.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

למדו לייצר מוטנטי מחיקה ב-Escherichia coli באמצעות התמרה חושית של P1 עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה. שיטה מהירה ואמינה לחקר פונקציות גנים במיקרוביולוגיה.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

גלה סרטונים נוספים