Name: Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: למד זיהוי אימונוהיסטוכימי של 5mC ו-5hmC ברשתית עכברית במהלך התפתחות ובשלב הפוסט-מיטוטי. פרוטוקול זה מאפשר חקר שינויים אפיגנטיים בכרומטין וביולוגיה עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק SBIR (1R44EY027654-01A1).

כל ההליכים עם עכברים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על-ידי החולים אוקלנד המכון לחקר בעלי חיים טיפול ושימוש הוועדה של הילדים, דבקה האגודה למחקר בהצהרת חזון, רפואת עיניים (ארוו) לשימוש חיות אופטלמולוגיות ועל חזון המחקר.
1. רקמות הכנה Immunostaining
<ol><li>המתת חסד C57 BL/6J עכברים ביום עובריים (E) 16, יום לאחר הלידה (P) 0, P15 ו P90 על ידי פחמן דו חמצני (CO2) ואחריו עריפת ראש (עכברים E16, P0).</li>
	<li>עכבר מיד enucleate העיניים ניקב עם המחט 29G 1/2 בצד הגבי של העין. תקופת דגירה של 5 דקות (דקות) ב 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) בבאגירה פוספט תמיסת מלח (1 x PBS) pH 8.0 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כדי להפוך את העין כוסות מן P0, P15 P90, שווייץ קרנית, עדשה עם מספריים אופטלמולוגיות בסדר בעוד העיניים % 4 מחברים. הערה: לדלג על שלב זה עבור העיניים E16 עיניו הם קטנים מדי.</li>
	<li>לתקן את כוסות העין (P0, P15 P90), כל העיניים (E16) ב 4% מחברים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את העין כוסות, עיניו כל פעמיים ב 1 מ"ל של PBS 1 x 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Cryoprotect העין כוסות, כל העיניים ב 1xPBS, pH 8.0 המכיל 10% סוכרוז למשך שעה. לשמור על 20% סוכרוז ב- PBS 1 x 1 שעה וירווה ואז ב- 30% סוכרוז ב- PBS 1 x לילה ב 4 º C.</li>
	<li>למחרת, להטביע את הכוסות עיניים והעיניים כל אופטימלית טמפרטורה תרכובת חיתוך (אוקטובר), (500 µL) ב cryomolds snap-הקפאת באמבט קרח יבש/אתנול, לאחסן ב- 80 ° c</li>
	<li>להסיר את התבניות עם העין מוטבע כוסות ועיניים כל-80 ° C, מאפשרים equilibrate ל-20 ° C עבור שעה אחת לפני cryosectioning.</li>
	<li>לחתוך חתכי רוחב ברשתית (בעובי 12 מיקרומטר) במקביל לציר temporonasal דרך ראש עצב הראייה באמצעות cryostat ב-20 ° C.</li>
	<li>הר מקטעי רשתית על שקופיות מיקרוסקופ53 וחנות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. Immunostaining עם נוגדנים 5-mC, 5-hmC
<ol><li>להקיף את המקטעים ברשתית רכוב על שקופיות עם עט הידרופובי המכשול. העט הידרופובי המכשול מפחיתה את עוצמת הקול של נוגדן הנדרש כדי להכתים את הרקמה.</li>
	<li>לשטוף את המקטעים ברשתית פעם אחת עם 200 µL 1 x PBS למשך 10 דקות.</li>
	<li>Permeabilize הסעיפים ברשתית עם 200 µL של 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS (PBS-T) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Denature מקטעי רשתית למשך 30 דקות עם 200 µL של טריות חומצת מלח (HCl) N 2 ב 1 x PBS ב חממה 37 ° C. הערה: טיטור זהיר של HCl טיפול נחוץ כדי למטב את האות 5mC.</li>
	<li>תמיד כוללים ביולוגי משכפל (3-4) תוך אופטימיזציה 5mC אות54. הערה: עשינו אנטיגן אחזור ב- 4 נקודות זמן (15 דקות, 30 דקות, 1 h ו- 2 h), והוא נמצא 30 דקות הדגירה אופטימלי איתות 5mC. זמן הדגירה עם HCl השתנה המבנה של גרעינים שמוביל לחוסר יכולת לבצע לוקליזציה אות 5mC את הגרעין.</li>
	<li>לאחר דנטורציה, לנטרל סעיפים רשתית על-ידי הוספת µL 100 של 0.1 M טריס-HCl (pH 8.3) על הרשתית מקטעים עבור 10 דקות.</li>
	<li>דגירה בסעיפים 500 µL של חסימת פתרון (5% סרום preimmune עז רגילה ב- 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר בתוך תא לחות.</li>
	<li>לאחר חסימת, להוסיף אנטי-5mC; נוגדנים אנטי-5hmC מדולל שבערך בחסימה לפתרון הסעיפים ברשתית.</li>
	<li>דגירה רשתית מקטעים לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לחות.</li>
	<li>כביסה היום הבא, מקטעי רשתית 3 פעמים (10-15 דקות כל פעם) עם 0.1% PBS-T ואז דגירה בחסימה פתרון עם נוגדנים משניים המתאים (אנטי-ארנב עז, עז העכבר אנטי אג, מדולל; 1:1000), המכיל דאפי (4', 6 - diamidino-2-phenylindole) פתרון (1 µg/mL) בטמפרטורת החדר במשך 1 h בחסימה פתרון. הערה: למנוע ייבוש סעיפים בכל שלבי immunodetection.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות בפעם השלישית עם 1 מ"ל של 0.1% ל- PBS-טי</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה הר הסעיפים מימית הרכבה בינונית תחת coverslip, לאטום עם לק שקוף.</li>
</ol>3. אימונוהיסטוכימיה קונאפוקלית
<ol><li>אוריינט הסעיפים יש את הצד אפיתל הפיגמנט ברשתית של גביע אופטיים פונה תמיד דרך אחת (למשל, למעלה), עקביות.</li>
	<li>לבצע לכידת התמונה סעיפים immunostained רשתית-63 X (הגדלה של עדשת המטרה) עם 2 X או 3 X זום.</li>
	<li>ליצור מספר מקטעים אופטי של כל תמונה שנבחרה (z-ערימות) כל 3 ערוצים (אדום, ירוק וכחול, RGB) באמצעות 0.35 שלב מיקרומטר. הערה: ההגדלה הסופי של הדגימה דמיינו ב- 10-20 X (הגדלה של עדשת המטרה) תהיה 63 X, בהתאמה, כאשר בשילוב עם 10 (בדרך כלל בשימוש) X העדשה הפנימית. דמיינו מחסנית אופטית דחוס כדי לאתר את האות 5mC ו- 5hmC</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מתילציה DNA hydroxymethylation דינמי והפיך DNA השינויים אשר modulatethe מגוון רחב של מנגנונים ביולוגיים מתפתחת גם כמו תאים postmitotic בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. כאן, אנו מתארים שיטה לשחזור לגילוי 5mC ו- 5hmC DNA השינויים בחיי עיר בטכניקת immunohistochemical (באמצעות נוגדנים anti-5mC ו- anti-5hmC) בסעיפים paraformaldehyde-קבוע קפוא של העכבר הרשתית, ולספק הנחיות ולשיפור המתקנות את התוצאות, במיוחד בעת השוואת מספר פרטים שונים. אנחנו קודם לכן השתמשו בשיטה זו על 5mC שינויים ברשתית עכבר עם הרשתית ספציפיים פילוח של Dnmt1, Dnmt3a , Dnmt3b DNA methyltransferase גנים, ודיווח דלדול (הצפויה) של סימני 5mC שלהם קרועות7 .
השלב הקריטי בזיהוי immunohistochemical 5mC הוא אופטימיזציה של טיפול סעיפים היסטולוגית עם HCl: פחות מ 15 דקות רעלני לא צפוי לייצר תוצאות לשחזור, ואילו טיפול מופרז עם HCl הורס את הגרעין ארכיטקטורה. מצאנו את התוצאה הטובה ביותר לאחר דגירה 30 דקות עם HCl. מומלץ תמיד להשתמש HCl טרי מדולל והפתרון PFA טרי 4% עבור קיבוע דנטורציה DNA רקמת רשתית.
כדי לפתור את התוצאות, אנו ממליצים לכלול שלושה או ארבעה ביולוגי משכפל תוך אופטימיזציה 5mC אות. בעוד כל אדם סט של נוגדן עשויה ליצור תוצאות שונות במקצת (אזורים heterochromatic בהיר יותר או פחות), אשר צפויה immunohistochemical בשיטה, 5mC, 5hmC הפצה גרעינית בתוך ערכת בודדים סעיפים צפוי להיות מאוד לשחזור, עבור כל עוד מופיע בפרוטוקול.
טכניקה זו יש גם הגבלה בעקביות הבחנו השתנות בחלוקה 5mC ב גרעינים תא קולט אור בתוך אותו סעיף. . מצאנו כמה גרעינים הראה אות חזק 5mC תוך גרעין התא הסמוך הראה שום אות 5mC... זאת בשל הגבלה ב גם ההומניסטית והאוטונומית אנטיגן 5mC על ידי טיפול HCl בסעיפים קפוא.
המשמעות של טכניקה זו מאפשרת 5mC לוקליזציה ללא טיפול K DNase ו proteinase מובילים יותר לשימור chromocenters. טכניקה זו הוא צפוי לעבוד robustly על כל קטעי כל רקמות בעלי חוליות, 5mC נשיאה, סימני 5hmC, מעובד עם גישה דומה, לא רק העכבר הרשתית, עבור כל עוד מופיע בפרוטוקול.

Epigenetic רגולציה של פיתוח, postmitotic הומאוסטזיס של רשתית העכבר הוא אזור מרתק של מחקר, אילו הבטחות להביא הבנה של מנגנונים ביולוגיים שליטה retinogenesis ותא גורל נחישות, תאים ייחודיים לסוג פונקציה מטבולית וכן תא פתולוגיות, מוות של תאים, התחדשות1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. כרומטין עובר שינויים דינמיים בשלבי פיתוח, כמו גם בתגובה אותות חיצוניים משתנה בין אם זה הלחץ, מטבולית או בתא המוות גירויים6,14,15, 16 , 17 , 18. ב העכבר גרעינים, כרומטין מחולק euchromatin פעיל והטרוכרומטין לא פעיל6,19,20. בגרעין לאטמוספרה, euchromatin שוכן באזור הפנימי של הגרעין ואילו הטרוכרומטין קווים את הפריפריה הגרעין ואת גרעינון. דפוס זה נקרא קונבנציונאלי והוא מאוד כולו ב פרוקריוטים. לעומת זאת, רוד גרעינים בעלי חיים ליליים כגון עכבר או חולדה יש הפוך דפוס שבו הגרעין מאוכלס על ידי הטרוכרומטין במרכז מוקף euchromatin ויוצרים את המעטפת החיצונית ביותר6,18, 20. בלידה, רוד גרעינים יש אדריכלות גרעיני קונבנציונלי. היפוך של רוד הגרעינים מתרחשת במהלך הפיתוח על ידי שיפוץ לאדריכלות גרעיני קונבנציונלי. במהלך תהליך זה, הטרוכרומטין היקפיים מפריד בין הפריפריה גרעינית, chromocenters להינתך יחד לצורה chromocenter יחיד במרכז של גרעין6,18.
מתילציה DNA גנומי משתתפת שליטה מקומיים כרומטין קונפורמציה21. מתילציה DNA מתרחשת במיקום 5' של ציטוזין שאריות של CpG dinucleotides כי הם מועשרים באזור המקדם של גנים רבים העכבר הגנום22,23,24,25,26 כמו גם intergenic ואזורים אינטרון, הנושאות אלמנטים תקינה27. מתילציה של CpG איים ב21,הפרוקסימלית היזמים24 וחלבונים CpG ג'ין משפרי27,28 חשוב בוויסות המצב הדינאמי של כרומטין טרינארית, המכיל רבים גורמים התפתחותיים גנים/תמלול משחקת תפקיד חשוב בתחום הפיתוח, סרטן להזדקנות29,30,31,32,33,34 . דנ א שלושה methyltransferases (DNMTs) להשתתף מתילציה DNA במהלך פיתוח העכבר35. כל שלושת DNMTs באים לידי ביטוי במהלך פיתוח רשתית העכבר36 , שינויים הספציפיים רשתית ב Dnmt גנים השפעת התפתחות הרשתית2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) הוא מוצר חמצוני של demethylation 5-methylcytosine (5mC). השלושה עשר-11 טרנסלוקציה (ט) אנזימים להשתתף3938,37,demethylation 5mC. Hydroxymethyl-C השינוי מועשר בתמציות היזמים, וגופי ג'ין intergenic רצף גנומית בתוך ג'ין עשיר, אזורים באופן פעיל משועתקים27,40.
יש מגוון של גישות שתואר בקביעת דפוסי מתילציה DNA שינוי של תאים41,42,43,44,45,46, חלקם הפעלת לכימות שינויים כלליים של מתילציה DNA בעוד שאחרים התמקדות מדויק שינויים באזורים עשירים CpG בתוך היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים. שיטות זיהוי, כימות של 5hmC היו גם דווח על47, לרבות על ידי אימונוהיסטוכימיה13. Immunohistochemical טכניקות, אשר מאפשרים ניטור חזקים של שינויים 5mC ו- 5hmC הגרעינים של פיתוח תאים postmitotic, הם מאוד אינפורמטיבי עבור בהתוויית כרומטין dynamics בחיי עיר בתגובה לשינויים חיצוני או פנימי להשפיע על48,4913,4,תאים. עם זאת, גישה זו היא נוטה ממעיט מתילציה DNA ושינויים hydroxymethylation עקב קשיים טכניים, הקשורים בזיהוי שינויים ציטוזין בהכנות היסטולוגית. זה בגלל ה-DNA פולרי בסיסים, כולל 5mC ו- 5hmC-השתנה ציטוזין, מוסתרים בתוך המרכז של סליל ה-DNA גדילי כפול50, וזקוקים חשיפת פרצופו האמיתי. . זה מאתגר במיוחד קפוא ההכנות היסטולוגית, אשר עלול לאבד במהירות ארגון מקיף של הרקמה המקורית כאשר היחס הקשה מוחל.
הרשתית העכבר הוא מודל מצוינת לנתח את התרומה של מתילציה DNA התפתחות עצבית, הומאוסטזיס postmitotic. יש רק 6 סוגים של נוירונים (photoreceptors רוד, קונוס, אמקרין, תאים דו-קוטביים, אופקי וגנגליון), תא גליה אחד (מולר עכשיו, דונלד) וסוג אחד neuroepithelial תא סוג (אפיתל הפיגמנט ברשתית)51. סוגי תאים ברשתית דווחו יש דפוסים ברורים של ה-DNA מתילציה18,19, אשר לאחרונה נחקרה על בסיס יחיד רזולוציה1,5,9,12. לאחרונה דיווחנו ליישום אימונוהיסטוכימיה בהתוויית 5mC דפוס של הפצה בתוך גרעין של תאים ברשתית ושינויים הגרעינים של רשתית העכבר למבוגרים, איפה כל שלושת ה-DNA methyltransferases הוסרו על ידי מיקוד מותנה 7. לעומת מספר דוחות, בו הנוכחות של מתילציה DNA של תאים ברשתית יכולה להיחשב רק חיובי או שלילי האות hypermethylated תאי העובר אפופטוזיס, הגישה שלנו זמין גילוי כרומטין ספציפי סידור בתוך האטומים התא רשתית, אשר אנו, מספר קבוצות דיווח קודם5,6,7,18,19,36 , 52. כאן, אנו מתארים את הטכניקה immunohistochemical (IHC) של גילוי 5mC ו- 5hmC בסעיפים קפוא paraformaldehyde-קבוע היסטולוגית הפרטים כמו גם להדגים את הנתונים, אשר היינו יכולים להתרבות מהדוח המקורי שלנו7 .

<table><tbody><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 אולטרה-עדין</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עיניים</td><td>Fine Science Tools, Inc.&nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP עט</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-שקופית Superfrost פלוס</td><td>VWR</td><td>48311-703<</td><td></td></tr><tr><td>חזק>מגיב </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים מדע</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>קורנינג</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek תרכובת חיתוך אופטית (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR אנליטי&nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure עז נמלים ארנב IgG</td><td>ג'קסון Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure עז נמלה עכבר IgG</td><td>ג'קסון Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>להאריך זהב Antifade בינוני</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>תרמו פישר</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemical זיהוי של 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר postmitotic

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

אפיגנטיקה של התפתחות הרשתית הוא שדה מחקר למד היטב, אשר מבטיח מביא רמה חדשה של הבנה לגבי המנגנונים של מגוון מחלות ניוון רשתית האדם והצבע גישות טיפול חדשות. הארכיטקטורה הגרעין של רשתית העכבר מאורגן שני דפוסים שונים: הפוך קונבנציונאלי. דפוס קונבנציונלי הוא אוניברסלי שבו הטרוכרומטין הוא מקומי לפריפריה של הגרעין, בעוד euchromatin פעיל שוכנת על הפנים גרעיני. לעומת זאת, הפוך דפוס גרעיני הוא ייחודי רוד למבוגרים קולט אור התא האטום שבו הטרוכרומטין. רגישה למרכז הגרעין, euchromatin מתגורר באזורי הפריפריה גרעינית. מתילציה DNA נצפית בעיקר ב- chromocenters. מתילציה DNA הוא שינוי דינמי קוולנטיות על משקעי ציטוזין (5-methylcytosine, 5mC) של CpG dinucleotides כי הם מועשרים באזורים המקדם של גנים רבים. שלושה methyltransferases DNA (DNMT1, DNMT3A ו- DNMT3B) להשתתף מתילציה של הדנ א במהלך הפיתוח. גילוי 5mC עם טכניקות immunohistochemical הוא מאוד מאתגר, תורם השתנות בתוצאות, כמו כל DNA בסיסים כולל בסיסים 5mC ששינה ומוסתרים בתוך סליל הדנ א גדילי כפול. אולם, תיחום מפורט של התפלגות 5mC במהלך הפיתוח היא מאוד אינפורמטיבי. כאן, אנו מתארים שיטה לשחזור לגילוי immunohistochemical חזקה של 5mC ושל עוד epigenetic DNA סמן 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), אשר colocalizes עם כרומטין 'פתח', transcriptionally פעיל בפיתוח, רשתית העכבר postmitotic.

כדי לקבוע את ההתפלגות של 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) במהלך התפתחות הרשתית, ברשתית postmitotic, אנו immunostained C57BL/6J העכבר ברשתית סעיף E16, P0, P15, P90 עם נוגדנים ספציפיים 5mC, 5hmC.
-E16 ההכתמה 5mC הייתה חזקה ב- chromocenters של גרעינים תא בזמן צביעת חלש נצפתה ב גרעינים התא כולו (איור 1 א'). ההכתמה 5hmC היה מרותק גרעינים תא והיה נעדר מן chromocenters (איור 1b).
ברשתית P0, האות 5mC מקומי את chromocenters של גרעין התא, הגרעין לפריפריה (איור 2a, החצים, חץ). גם הבחנו מכתים חלש של 5mC בין chromocenters של גרעינים התא. האות 5hmC היה מאוד נוכח גרעינים תא חוץ chromocenters (איור 2b). . מצאנו שעוד גרעינים מוכתמים 5mC ו- 5hmC בשכבה הפנימית neuroblast (INBL) (c איור 2, קו מנוקד)
ברשתית P15, מצאנו מכתים חזק של 5mC ושל 5hmC השכבה החיצונית גרעינית (גרת), השכבה הפנימית גרעינית (להיכנס), שכבת תאים גנגליון (שזכתה) (איור 3). גרת (רוד photoreceptors), האות 5mC היה נוכח chromocenters של גרעין התא, הגרעין לפריפריה (דמויות 3a-3 c, 3 g). האות 5hmC נמצאה גרעינים התא כולו למעט chromocenters (דמויות 3d-3f). במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים על הרשתית P15 מציגה את התפלגות של תחומים heterochromatic רוד תא גרעינים דומה לזה נמצא עם האות נוגדן 5mC (דמויות 3 h ו- 3עכשיו).
ההכתמה 5mC להיכנס, שזכתה היה. חזק chromocenters של גרעינים תא, צביעת חלש נצפתה גם בתוך גרעין התא כולו (דמויות 3j-3 l ו- 3r-3t). בניגוד 5mC, האות 5hmC מקומי גרעינים התא כולו למעט chromocenters להיכנס, שזכתה (דמויות 3 מ'-3o ו 3 בגודל 3u-ואט). הבחנו חזקה 5hmC אות על הפריפריה של גרעין התא שזכתה.
ב- photoreceptors רוד למבוגרים, האות 5mC היה מוגבל chromocenter ואת הגרעין לפריפריה של גרעינים תא (דמויות 4a-4 c), ואילו 5hmc האות היה מרותק הפריפריה גרעינית (4 דמויות d-4f).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> איור 1. לוקליזציה של 5-methylcytosine ו- 5-hydroxymethylcytosine ברשתית העכבר מתחלקים היום 16. Immunostaining של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים 5mC (אדום, a) ו- 5hmC (ירוק, b). -E16, 5mC אות היא מאוד חזקה ב- chromocenters של גרעינים תא גם נוכח גרעינים התא כולו ברמה נמוכה יותר. 5hmC מכתים היה באופן בלעדי מוגבלת את גרעין התא. לוח c מייצג 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול, ג). כניסות מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית של תמונות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> באיור 2. נוגדן של 5-methylcytosine, 5-hydroxymethylcytosine ברשתית העכבר ביום כמחנכת 0. Immunolabeling של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים 5mC (אדום, a) ו- 5hmC (ירוק, b). ברשתית P0, 5mC ו 5hmC נוכחים השכבה החיצונית neuroblast (ONBL) והן השכבה הפנימית neuroblast (INBL). a) האות 5mC קיים בחריפות chromocenters (חץ) ואת הגרעין לפריפריה של גרעינים תא (חץ). צביעת חלש של 5mC הוא ציין גם בין chromocenters של גרעין התא. b) 5hmC מכתים מוחזק בתוך גרעין התא, אות חזק נצפית ב- INBL (קו מנוקד לוח ג'). לוח c מייצג 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול, ג). כניסות מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית של תמונות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> איור 3. 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine והפצה ברשתית העכבר ב 15 יום לאחר הלידה. Immunostaining של C57BL/6J הרשתית עם נוגדנים anti-5mC ו- 5hmC (-g, j-y). בשכבה החיצונית גרעינית (גרת) (רוד photoreceptors), האות 5mC (א) בדרך כלל עולה בקנה אחד עם chromocenters של גרעינים תא (ראש חץ, b), אדום, רגישה גם לפריפריה גרעינית (חץ, b). פאנל b (אדום) ו- c (אפור) מייצג את ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה. האות 5hmC (ירוק, d) מוגבל גרעינים התא כולו למעט chromocenters. לוח אלקטרוני (ירוק), f (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית קולטים תמונת לוח g מייצגת 5mC הממוזג ותמונה 5hmC. הגרעינים הם counterstained עם דאפי. לוח h ואני הם שידור תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים של גרעינים קולט אור-כמחנכת היום 15 בסה כ מציג בחתך תחומים heterochromatic. ראש חץ שחור ב- h לוח מצביע על מוט יחיד קולט אור גרעין בלוח ט ראשי חץ אדום בחלונית שלב לתחומים heterochromatic בתוך מוט קולט אור גרעין בעוד חצים אדומים להצביע הטרוכרומטין בפריפריה גרעינית. להיכנס (j-q), שזכתה תא גרעינים (r-y), האות 5mC (אדום) הוא מקומי כדי chromocenters ההווה בפריפריה, צביעת חלש הוא זוהה גם בשאר חלקי האטום התא. לוח k (אדום) ואני (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתקופה של התמונה. 5hmC ההכתמה (ירוק) בתוך גרעין התא להיכנס, שזכתה מוגבל גרעין התא כולו. שימו לב חזק 5hmC מכתים בפריפריה גרעיני תאי שזכתה. לוח p ו- x מייצגים 5mC הממוזג, 5hmC התמונה בעוד לוח q ו- y מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית תמונה p, x בהתאמה. הגרעינים הם counterstained עם דאפי. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> באיור 4. 5-methylcytosine 5-hydroxymethylcytosine והפצה של רוד קולט אור גרעינים של רשתית העכבר C57BL/6J ביום כמחנכת 90. ההכתמה 5mC (אדום,) בחריפות נוכח chromocenter של גרעין התא, גם המתנה חלש באזורי הפריפריה גרעינית. פאנל b (אדום) ו- c (אפור) מייצג את ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה. 5hmC ההכתמה (ירוק, d) באופן בלעדי מוגבל על e לוח הגרעין לפריפריה (ירוק), f (אפור) מייצגים ההגדלה של האזור המוצג עם כוכבית קולטים תמונת לוח g מייצג 5mC הממוזגים 5hmC תמונה תוך לוח h הוא הגדלה של האזור המוצג עם כוכבית בתמונה שג גרעינים הם counterstained עם דאפי (כחול). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המתילציה של ה-DNA, כגון שינויים בכרומטין במהלך התפתחות הרשתית ברשתית פוסט-מיטוטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה בצורה חזקה על כל קטע מכל רקמות הרשתית של העכבר הנושאות התפלגות 5-מתילציטוזין, 5-הידרוקסימתילציטוזין המעובדות בגישה דומה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכנת הרקמה והצביעה, מכיוון שאם משתמשים בהכנות היסטולוגיות קפואות, רקמה ארגונית ומקורית יקרת ערך עלולה לאבד.מי שידגים את שאר ההליך יהיה פבלו דיאז, עמית מחקר מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במחט בגודל 29 אינץ' כדי לנקב את עיניו של עכבר ערוף ראשו שהומת בצד הגבי של העיניים. כדי להשיג כוסות עיניים, יש להוציא מיד את העיניים על ידי חיתוך סביב הסקלרה במספריים עיניים עדינות כדי להסיר את הקרנית והעדשה.יש לקבע את כוסות העיניים ואת העיניים השלמות E16 ב-4% פרפורמלדהיד או PFA ב-1xPBS pH 8.0 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים אותם פעמיים במיליליטר אחד של 1xPBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. כדי להגן בהקפאה על כוסות העיניים והעיניים השלמות, יש לדגור אותן ב-1xPBS pH 8.0 עם 10% סוכרוז בטמפרטורת החדר למשך שעה.ואז ב-20% סוכרוז ב-1xPBS למשך שעה. ולבסוף ב-30% סוכרוז ב-1xPBS ב-4 מעלות צלזיוס בלילה. למחרת, הטמיעו את כוסות העיניים והעיניים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, בתבניות קריו.לאחר מכן הצמד להקפיא אותם באמבט אתנול קרח יבש ולשמור על 80 מעלות צלזיוס. לפני תחילת ההקפאה, הסר את התבניות עם כוסות עיניים ועיניים מוטמעות מ-80 מעלות צלזיוס. הניחו אותם במחזיק קריוסטט ואפשרו להם להתאזן ל-20 מעלות צלזיוס למשך שעה.בעזרת קריוסטט בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, חותכים חתכי רשתית בעובי 12 מיקרומטר במקביל לציר הטמפורונאזלי דרך ראש עצב הראייה. הרכיבו את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ ואחסנו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל צביעה חיסונית, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי להקיף את חלקי הרשתית המותקנים על שקופיות.שטפו את החלקים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1xPBS למשך 10 דקות. חדירה לחלקים עם 200 מיקרוליטר PBST למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דנטור אותם עם 200 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית רגילה 2 טריים בקפידה ב-1xPBS למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לייעל את האות של 5mC.לאחר דנטורציה יש להוסיף 100 מיקרוליטר של 0.1 Tris-HCl pH 8.3 על חלקי הרשתית, ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל אותם. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת חסימה. ודגרו את החלקים בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך שעה.הוסף את הנוגדנים המתאימים, מדולל אחד עד 500 בתמיסת חסימה, לחלקים ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את החלקים שלוש פעמים למשך 10 עד 15 דקות כל אחד עם 0.1% PBST. הוסף נוגדנים משניים מתאימים מדוללים 1 עד 1000 בתמיסת חסימה המכילה תמיסת DAPI בטמפרטורת החדר למשך שעה.לאחר מכן, שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 0.1% PBST למשך 10 דקות כל אחת. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף מדיום הרכבה מימי. מכסים בכיסוי.ואז המשך במיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר צביעה חיסונית ברשתית ב-E16, אות 5mC היה חזק בכרומומרכזים של גרעיני התא והיה נוכח ברמה נמוכה בהרבה בכל גרעיני התא. צביעת 5hmC נמצאה אך ורק בגרעיני התא ונעדרה מהכרומוזנטרים.ברשתית P0, אותות 5mC ו-5hmC היו נוכחים בשכבת הנוירובלסטים החיצונית, ובשכבת הנוירובלסטים הפנימית. אות 5mC היה חזק בכרומוזנטרים ובפריפריה הגרעינית של גרעיני התא, וחלש יותר בין הכרומוזנטרים של גרעיני התא. צביעה של 5hmC הוגבלה לגרעין התא.ברשתית P15, בשכבה הגרעינית החיצונית, זוהה אות 5mC במרכזי הכרומוזנטים של גרעיני התא והפריפריה הגרעינית. ואילו אות 5hmC היה בכל גרעיני התא למעט הכרומוזנטרים. בשכבת התא הגרעיני הפנימי והגנגליון, אות 5mC היה חזק במרכזי הכרומוזיקה של גרעיני התא, וחלש בגרעיני התא השלמים.ואילו האות 5hmC נמצא בכל גרעיני התא למעט הכרומוזנטרים. בקולטני אור מוטות בוגרים, אות 5mC הוגבל לכרומוסנטר ולפריפריה הגרעינית, בעוד שאות 5hmC הוגבל לפריפריה הגרעינית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בחתכים היסטולוגיים בחשיפה אופטימלית של HCl, שהיא 30 דקות.אם החשיפה קטנה או יותר, לא ניתן לשחזר תוצאות מיטביות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה, ספקטרומטריית מסה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כימות שינויים במדידת 5-מתילציטוזין ו-5-הידרוקסימתילציטוזין. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההתפתחות העצבית לחקור שינויים אפיגנטיים בכרומטין.אל תשכח שעבודה עם HCl ו-PFA עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון סילוק נכון, בעת ביצוע הליך זה.

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

EpiMark 5-5-HMC ו MC ערכת ניתוח יכול לשמש כדי לנתח לכמת 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד spe cific. הערכה מבדיל 5-MC מתוך 5-HMC על ידי תוספת של גלוקוז אל קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC דרך התגובה האנזימטית ניצול β-glucosyltransferase (T4-BGT). כאשר 5-HMC מתרחשת בהקשר של CCGG, שינוי זה ממיר אתר cleavable MspI לאתר הלא cleavable.

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

תאר הוא תהליך תיוג שני שלבי שימוש (β-GT) β-glucosyltransferase להעביר תזיד-גלוקוז ל5-HMC, ואחרי לחץ כימיה להעביר מקשר ביוטין להעשרה קלה וצפיפות בלתי תלויה. שיטת תיוג יעילה וספציפית זו מאפשרת העשרה של 5-HMC עם רקע נמוך ביותר ומיפוי epigenomic תפוקה גבוהה באמצעות רצף של הדור הבא.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

סרטון זה מתאר את הטכניקה של כתם נקודה כדי לקבוע את רמת המתילציה של DNA בכונדרוציטים אנושיים במבחנה באמצעות כתם של דגימות DNA על קרום ניילון וההדמיה שלאחר מכן באמצעות נוגדנים חד שבטיים. זה עוזר לקבוע את הפנוטיפ של כונדרוציטים בשלבים שונים בתרבית.

5-מתילציטוזין נקודה כתם כדי לקבוע את מידת מתילציה DNA

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

כאן אנו מתארים שיטה אימונוכימית רגישה למיפוי ההתפלגות המרחבית של נגזרות חמצון 5mC המבוססת על שימוש בנוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז והגברת אות טירמיד.

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים ורקמות המוח, ניצול immunofluorescence כתמים ושיטות כתמי נקודה DNA.

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה שלמים.

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

מתואר פרוטוקול להכנת הקפאות רשתית של עכברים וביצוע צביעה חיסונית על קולטני אור. מאמר זה מאפשר לחוקרים לייצר באופן עקבי חלקים קפואים ברשתית של עכברים עם מורפולוגיה שמורה היטב ותוצאות צביעה חיסונית באיכות גבוהה.

הקפאה וצביעה חיסונית של רשתית העכבר

למד זיהוי אימונוהיסטוכימי של 5mC ו-5hmC ברשתית עכברית במהלך התפתחות ובשלב הפוסט-מיטוטי. פרוטוקול זה מאפשר חקר שינויים אפיגנטיים בכרומטין וביולוגיה עצבית.

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

גלה סרטונים נוספים