Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המתילציה של ה-DNA, כגון שינויים בכרומטין במהלך התפתחות הרשתית ברשתית פוסט-מיטוטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה בצורה חזקה על כל קטע מכל רקמות הרשתית של העכבר הנושאות התפלגות 5-מתילציטוזין, 5-הידרוקסימתילציטוזין המעובדות בגישה דומה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכנת הרקמה והצביעה, מכיוון שאם משתמשים בהכנות היסטולוגיות קפואות, רקמה ארגונית ומקורית יקרת ערך עלולה לאבד.

מי שידגים את שאר ההליך יהיה פבלו דיאז, עמית מחקר מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במחט בגודל 29 אינץ' כדי לנקב את עיניו של עכבר ערוף ראשו שהומת בצד הגבי של העיניים. כדי להשיג כוסות עיניים, יש להוציא מיד את העיניים על ידי חיתוך סביב הסקלרה במספריים עיניים עדינות כדי להסיר את הקרנית והעדשה.

יש לקבע את כוסות העיניים ואת העיניים השלמות E16 ב-4% פרפורמלדהיד או PFA ב-1xPBS pH 8.0 למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים אותם פעמיים במיליליטר אחד של 1xPBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. כדי להגן בהקפאה על כוסות העיניים והעיניים השלמות, יש לדגור אותן ב-1xPBS pH 8.0 עם 10% סוכרוז בטמפרטורת החדר למשך שעה.

ואז ב-20% סוכרוז ב-1xPBS למשך שעה. ולבסוף ב-30% סוכרוז ב-1xPBS ב-4 מעלות צלזיוס בלילה. למחרת, הטמיעו את כוסות העיניים והעיניים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, בתבניות קריו.

לאחר מכן הצמד להקפיא אותם באמבט אתנול קרח יבש ולשמור על 80 מעלות צלזיוס. לפני תחילת ההקפאה, הסר את התבניות עם כוסות עיניים ועיניים מוטמעות מ-80 מעלות צלזיוס. הניחו אותם במחזיק קריוסטט ואפשרו להם להתאזן ל-20 מעלות צלזיוס למשך שעה.

בעזרת קריוסטט בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, חותכים חתכי רשתית בעובי 12 מיקרומטר במקביל לציר הטמפורונאזלי דרך ראש עצב הראייה. הרכיבו את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ ואחסנו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל צביעה חיסונית, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי להקיף את חלקי הרשתית המותקנים על שקופיות.

שטפו את החלקים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1xPBS למשך 10 דקות. חדירה לחלקים עם 200 מיקרוליטר PBST למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דנטור אותם עם 200 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית רגילה 2 טריים בקפידה ב-1xPBS למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לייעל את האות של 5mC.

לאחר דנטורציה יש להוסיף 100 מיקרוליטר של 0.1 Tris-HCl pH 8.3 על חלקי הרשתית, ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל אותם. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת חסימה. ודגרו את החלקים בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך שעה.

הוסף את הנוגדנים המתאימים, מדולל אחד עד 500 בתמיסת חסימה, לחלקים ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את החלקים שלוש פעמים למשך 10 עד 15 דקות כל אחד עם 0.1% PBST. הוסף נוגדנים משניים מתאימים מדוללים 1 עד 1000 בתמיסת חסימה המכילה תמיסת DAPI בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 0.1% PBST למשך 10 דקות כל אחת. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף מדיום הרכבה מימי. מכסים בכיסוי.

ואז המשך במיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר צביעה חיסונית ברשתית ב-E16, אות 5mC היה חזק בכרומומרכזים של גרעיני התא והיה נוכח ברמה נמוכה בהרבה בכל גרעיני התא. צביעת 5hmC נמצאה אך ורק בגרעיני התא ונעדרה מהכרומוזנטרים.

ברשתית P0, אותות 5mC ו-5hmC היו נוכחים בשכבת הנוירובלסטים החיצונית, ובשכבת הנוירובלסטים הפנימית. אות 5mC היה חזק בכרומוזנטרים ובפריפריה הגרעינית של גרעיני התא, וחלש יותר בין הכרומוזנטרים של גרעיני התא. צביעה של 5hmC הוגבלה לגרעין התא.

ברשתית P15, בשכבה הגרעינית החיצונית, זוהה אות 5mC במרכזי הכרומוזנטים של גרעיני התא והפריפריה הגרעינית. ואילו אות 5hmC היה בכל גרעיני התא למעט הכרומוזנטרים. בשכבת התא הגרעיני הפנימי והגנגליון, אות 5mC היה חזק במרכזי הכרומוזיקה של גרעיני התא, וחלש בגרעיני התא השלמים.

ואילו האות 5hmC נמצא בכל גרעיני התא למעט הכרומוזנטרים. בקולטני אור מוטות בוגרים, אות 5mC הוגבל לכרומוסנטר ולפריפריה הגרעינית, בעוד שאות 5hmC הוגבל לפריפריה הגרעינית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בחתכים היסטולוגיים בחשיפה אופטימלית של HCl, שהיא 30 דקות.

אם החשיפה קטנה או יותר, לא ניתן לשחזר תוצאות מיטביות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה, ספקטרומטריית מסה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כימות שינויים במדידת 5-מתילציטוזין ו-5-הידרוקסימתילציטוזין. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההתפתחות העצבית לחקור שינויים אפיגנטיים בכרומטין.

אל תשכח שעבודה עם HCl ו-PFA עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון סילוק נכון, בעת ביצוע הליך זה.