שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביוכימיה והביולוגיה המבנית של חלבונים מופרשים, כגון קביעת מבנה החלבון של, על ידי קריסטלוגרפיה וקריו-EM. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת כמות גדולה של חלבונים המופרשים רקומביננטיים בעלות נמוכה יחסית לקביעת מבנה החלבון. ראשית, סנתז מקטע DNA המכיל אתר חיתוך BglII של חמישה ראשוניים, רצף אותות ההפרשה המעניין באתר מרובה שיבוטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, עכל ארבעה מיקרוגרם של ה-DNA עם BglII ו-X1, וארבעה מיקרוגרם של DNA וקטור ביטוי עם BamH1 ו-X1. מערבבים 10 יחידות של כל אנזים הגבלה עם ה-DNA במאגר תגובה בריכוז 1X. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת תגובת קשירה המכילה 1X T4 DNA מאגר תגובה ליגאז וחמש יחידות של T4 DNA Ligase לצינור אפנדורף טרי של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף 100 ננוגרם של ה-DNA הווקטורי הליניארי ו-400 ננוגרם של שבר ה-DNA המעוכל. דגירה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. הפוך חמישה מיקרוליטר מתערובת הקשירה ל-100 מיקרוליטר של תאים מוכשרים DH5 אלפא ובחר את המושבות המתקבלות על צלחת אגר Ampicillin LB כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

בחר בין חמש ל -10 מושבות והעביר כל אחת לשני מיליליטר של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. גדל את המושבות הללו באינקובטור רועד ב-220 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. לאחר מכן, השתמש בערכת DNA Miniprep כדי לחלץ כל DNA פלסמיד.

אשר את השיבוטים על ידי ריצוף DNA עם פריימר רצף קדימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. באמצעות 100 ננוגרם של פלסמיד הבנייה, הפוך 40 מיקרוליטר של תאים מוכשרים DH10Bac כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דגרו על לוחות הטרנספורמציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

הרם שתי מושבות לבנות מכל צלחת טרנספורמציה וחסן כל מושבה בשני מיליליטר של מדיום LB המכיל קנמיצין, גנטמיצין וטטרציקלין. חלץ ואמת את ה-DNA של bacmid כמתואר בפרוטוקול הטקסט. יש לחלק כל DNA לשני צינורות כאשר 20 מיקרוליטר מועברים לכל צינור.

לאחר מכן אחסן את הצינורות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להמשיך. יש לבצע את כל השלבים הבאים באופן אספטי. בצלחת של שש בארות, גדל שכבה אחת של תאי Sf9 במצע התרבית עם סרום בקר עוברי של 10%, ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין במפגש של 27 מעלות צלזיוס עד 80%.

עבור כל טרנספקציה, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים Sf9 ללא תוספת ללא אנטיביוטיקה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מדללים 20 מיקרוליטר של DNA בקמיד לכל צינור ומעבירים בעדינות לערבב. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים Sf9 ללא תוספת ללא אנטיביוטיקה לצינור של 1.5 מיליליטר עבור כל טרנספקציה.

מדללים שמונה מיקרוליטרים של מגיב העברת שומנים לכל צינור, ומערבבים על ידי פיפטינג יסודי למעלה ולמטה שש פעמים. שלבו את שתי התמיסות הללו וערבבו אותן על ידי פיפטינג איטי למעלה ולמטה שלוש פעמים. דוגרים במשך 20 עד 40 דקות בטמפרטורת החדר.

שטפו כל באר של צלחת התרבות פעמיים באמצעות שלושה מיליליטר של מדיום תרבית Sf9 ללא תוספת ללא אנטיביוטיקה לכל שטיפה. לאחר מכן, הוסף 0.8 מיליליטר של מדיום תרבית תאים Sf9 ללא תוספת ללא אנטיביוטיקה לכל צינור המכיל את תערובת ה-DNA השומנית. מזלפים לאט למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לערבב.

שאפו את אמצעי הכביסה מהצלחות, וכסו את הדגימות בתערובת הטרנספקציה. דגרו על הצלחת המועברת למשך חמש שעות בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החלף את אמצעי הטרנספקציה במדיום תרבית התאים השלם Sf9 המכיל 10% FBS, ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין.

דגירה בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט בצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. סובב ב -1, 010 פעמים גרם למשך חמש דקות כדי להסיר את פסולת התאים.

השליכו את הגלולה, ושפכו את הסופרנטנט לצינור נקי. יש לאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שנה או עד שמוכן לשימוש. כדי להגביר כל נגיף רקומביננטי, יש לגדל תחילה שכבה אחת של תאי Sf9 על צלחת של 150 מילימטר עד למפגש של 80%.

לאחר מכן שאפו את המדיום, והוסיפו שני מיליליטר של נגיף P0 לכל באר. דגרו במשך שעה באינקובטור של 27 מעלות צלזיוס, נדנדו את הצלחת כל 15 דקות כדי לערבב את המדיום עם התאים. לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר של Grace's Media שלם המכיל 10% FBS, ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין.

דגרו את הצלחת למשך שלושה ימים באינקובטור של 27 מעלות צלזיוס כדי להשיג את נגיף המעבר P1. לאחר מכן, אסוף את הסופרנטנט בצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר. סובב ב -1, 010 פעמים גרם למשך חמש דקות כדי להסיר את פסולת התאים.

שפכו את הסופרנטנט לצינור נקי, ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שנה או עד שיהיה מוכן לשימוש. כדי להגביר את הנגיף ממעבר P1 ל-P2, יש לגדל תחילה שכבה אחת של תאי Sf9 על צלחת של 150 מילימטר עד למפגש של 90%. לאחר שמגיעים למפגש הרצוי, שאפו את המדיום.

הוסיפו שני מיליליטר של נגיף P1 ודגרו במשך שעה באינקובטור של 27 מעלות צלזיוס. חזור על שלבי ההגברה כדי להשיג את מעברי ה-P2 וה-P3 של הנגיף. במחקר זה, שני וקטורי ביטוי pFastBac1 baculovirus מותאמים משמשים לביטוי החלבונים המופרשים עם רצף אותות ה-gp67 או המולין על ידי החלפת רצף האותות הפנימי של גן המטרה.

ה-PBEC gp67 מנוצל בהצלחה כדי לבטא את התחומים החוץ-תאיים של קולטן a-thal-leano TDR. בעוד שההמולין PBEC1 מנוצל בהצלחה כדי לבטא את התחום החוץ-תאי PRK3. לאחר מכן, החלבונים המטוהרים מרוכזים לחמישה מיליגרם למיליליטר, ועוברים בדיקת התגבשות.

התנאים שהניבו גבישים ראשוניים לכל חלבון מותאמים עד שנצפו גבישי חלבון גדולים מ-20 מיקרומטר. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהם בוחנים את איכות החלבונים לפי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, פיזור אור רב-זוויתי ובדיקות אחרות למצב אי-צבירה של החלבון הרקומביננטי. אל תשכח, לבדוק את טוהר החלבון גם על ידי כתם כסף.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ו-cryo-EM על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו המבנים התלת-ממדיים של החלבון המיוצר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המבנית לחקור את התכונות המבניות, התפקודיות והביוכימיות של חלבונים המופרשים מצמחים וביונקים. אל תשכח שעבודה עם אור אולטרה סגול כדי לדמיין את רצועות ה-DNA על ג'ל האגרוז עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת הגנות UV, מגן פנים, משקפי מגן, מעיל מעבדה, בעת ביצוע הליך זה.

כמו כן, בעת הכנת חוצצים, היזהר בעת טיפול בחומצות ובסיסים חזקים.