ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד תאי דם לבנים מופעלים, וכיצד מתפתחות אלרגיות לאלרגנים בודדים? היתרון העיקרי של מודל עכבר אלרגיה חזק ובלתי ניתן לשחזור זה הוא שניתן להשתמש בפחות עכברים כדי להניב שונות נמוכה יותר עם אוכלוסייה ניסיונית. חיסונים חדשים לשליטה בתגובות חיסוניות דורשים מודלים חזקים של עכבר כאמצעי ראשוני לבדיקה ביעילות vivo.

לכן, ההשלכות של טכניקה זו להרחיב כלפי אימונותרפיה אלרגיה. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לאלרגיות, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כגון אוטואימוניות שבה תגובות נוגדנים לא רצויים לשחק תפקיד מפתח במחלה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בגלל חוסר ניסיון בעבודה עם חלקיקים liposomal או חוסר ניסיון עם הטכניקות הנדרשות בעבודה העכבר.

התחל על ידי הוספת 2.5 שווה ערך טוחן של crosslinker heterobifunctional לחלבון ומניח את התגובה על שייקר מתנוסס בטמפרטורת החדר במשך כשעה. לאחר דגירה של שעה עם SPDP, התפל את החלבון על עמודה שאובדת באצטט נתרן 100 מ"ל, ולאסוף את השברים. לקבוע את ספיגת 280 ננומטר, ולאסוף את השברים העליונים.

שטפו את העמודה ב-PBS, והוסיפו דיתיותריטול של 25 מילימולרים, או DTT, לשברי החלבון המפולגים למשך 5 עד 10 דקות. לאחר מכן, למדוד את ספיגת 280 ו 343 ננומטר של החלבון כדי לאפשר חישוב של יחס הקישור מבוסס על טוחנות של חלבון ואת הקישור. לאחר מכן, הפעל את שברי הבריכה של העמוד שטוף PBS, ולאסוף את השברים למדידה של 280 ננומטר ואת השבר העליון אוסף כפי שהודגם.

הוסיפו לחלבון את הנפח המתאים של 100x DSPE-PEG2000-Maleimide כדי להשיג ריכוז סופי עודף טוחנת פי 1x ו-10 עם מערבולות עדינות. לאחר מכן, להפעיל את התגובה לילה תחת חנקן בבקבוק אטום עגול תחתון. למחרת, להפעיל את החלבון על עמוד חרוזים ג'ל דקסטרן מקושר, ולאחסן את שברי מאגר הסופי של חלבון הקשורים השומנים בארבע מעלות צלזיוס עד השימוש בהם.

לאחר חישוב הכמות הנכונה של כל שומנים, לשלב את כל השומנים לתוך 12 מיליליטר borosilicate מבחנה זכוכית, ולהשתמש מזרק שלושה מיליליטר צינורות לפוצץ בזהירות את כלורופורם עם חנקן. לאחר מכן, ליופיליזציה הפתרון עם 100 microliters של DMSO לילה. למחרת בבוקר, להוסיף מיליליטר אחד של חלבון הקשורים השומנים לצינור השומנים 12 מיליליטר, ו sonicate הפתרון שלוש עד ארבע פעמים במשך 30 עד 60 שניות לכל sonication באמבט מים sonication עם לפחות חמש דקות מנוחה בין sonications.

לאחר sonication האחרון, לטעון את המדגם לתוך אחד המזרקים extruding להציב לתוך extruder, ולהניח את מזרק extruder לתוך הקצה השני של extruder. המזרק הריק יתמלא כאשר השומנים מובלטים דרך קרום הפוליקרבונט 0.8 מיקרומטר. מניחים את האלט שהורכב במלואו לתוך בלוק חימום, ומדכאים בעדינות את הבוכנה כדי לרוקן את המזרק.

לאחר ההבלטה האחרונה, להעביר את ליפוזומים לתוך בקבוקון נקי, ולהדיר את השומנים דרך פוליקרבונט 0.2 ו 0.1 מיקרומטר ממברנות כפי שהוכח רק. לאחר מכן, לאחסן את ליפוזומים בארבע מעלות צלזיוס. כדי לפקח על תגובת תאי B להפעלת ליפוזום אנטיגני, יש להוסיף 1.5 פעמים 10 לטחול השביעי במאגר טעינת שטף הסידן, ולהוסיף 1.5 מיקרומולרים הודו-1 לתאים, תוך היפוך הפתרון בצינור מספר פעמים כדי לערבב.

לאחר דגירה של 30 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור, להוסיף חמש פעמים את נפח חיץ טעינת שטף סידן, צנטריפוגה תאים הודו-1 שכותרתו. עבור gating B-cell, תאי כתם עם נוגדן אנטי CD5 ואנטי B220 ב 0.5 מיליליטר של חיץ טעינה בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים במאגר טעינת שטף סידן טרי, ו resuspend את גלולה באחת עד פעמיים 10 לתאים השביעי לכל מיליליטר של שטף סידן טרי פועל חיץ לאחסון על קרח, מוגן מפני אור עד ניתוח.

לאחר מכן, להוסיף 0.5 מיליליטר של תאים כתרים, חמישה מיליליטר, עגול למטה, צינור פוליסטירן, לחמם את התאים ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאחר שלוש עד חמש דקות, מעבירים את הצינור לתא עם מעילי מים של 37 מעלות צלזיוס המחובר לאמבט מים מקיף, והפעלה של הצינור במעיל המים על ציטומטר הזרימה. לאחר איסוף 5, 000 עד 10,000 אירועים בשנייה, לאפשר לתאים להתייצב במשך 15 עד 30 שניות, וליזוב מחדש את רכישת הנתונים, איסוף הנתונים לפחות 10 שניות כדי ליצור קריאת רקע.

בסימן 10 שניות, להסיר במהירות את הצינור מן ציטומטר הזרימה, ולהוסיף את הריכוז הניסיוני המתאים של ליפוזומים אנטיגניים. לאחר מכן, פולס מערבולת התאים, ולקרוא את הצינור על ציטומטר במשך שלוש עד חמש דקות נוספות. כדי לחוש את בעלי החיים, לספק 200 microliters של תמצית בוטנים המכיל רעלן כולרה באמצעות gavage אוראלי לכל ארבעה עד חמישה שבועות בן BALB / c נקבה עכבר נמען פעם בשבוע במשך שלושה שבועות ו 300 microliters של תמצית בוטנים מדולל בשבוע הרביעי.

ביום 28, להכין תמצית בוטנים לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר ב PBS, ולהשתמש מדחום רקטלי כדי למדוד את טמפרטורת הגוף הבסיסית של כל חיה רגישה. כאשר כל הטמפרטורות נמדדו, לנהל 200 microliters של תמצית בוטנים לכל נמען באמצעות הזרקה תוך-פרטית, ולמדוד את טמפרטורת הגוף עם מדחום רקטלי כל 15 דקות במשך שעה אחת לאחר ההזרקה. טבילה בטמפרטורת הגוף מצביעה על אלרגיה לבוטנים.

לאחר בידוד טשטוש מהעכברים האלרגיים לבוטנים, השתמש במזרק אינסולין של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 27 מד, 5/8 אינץ' להזרקה תוך ורידי פי 1.5 עד השביעי של הטשטוש האלרגי המופק לוורידי הזנב של בעלי חיים נאיביים וחסרי רגישות. יום אחד לאחר העברה מאמצת, להזריק דרך הווריד 200 microliters של Ara h 2 ליפוזומים אנטיגניים לתוך הווריד הזנב של כל עכבר BALB / c שקיבל את הטחול האלרגי. שבועיים לאחר הזרקת ליפוזום, להגביר את העכברים עם i.p.

הזרקה של Ara h 2 מסיס, ואחריו 200 מיקרוליטר Ara h 2 אתגר ביום 61. לאחר מכן, למדוד את טמפרטורות הגוף עם החללית רקטלי כל 15 דקות כפי שהוכח. ניתן להדגים התייחדות חלבונים על ידי הפעלת ג'ל להפחתת משקל מראה עלייה במשקל המולקולרי בהשוואה לחלבון הבלתי משוקם.

כדי להעריך את שטף הסידן B-cell מגרה ליפוזום אנטיגני, שער התאים הבודדים החיים כדי לאפשר בחירה של B220 חיובי CD5 שלילי B תאים. לאחר מכן ניתן לנתח את היחס בין סגול הודו-1 לעומת פלואורסצנטיות כחולה הודו-1 לאורך זמן כדי להעריך את כמות ההפעלה של תאי B הנגרמים על ידי ליפוזום. כימות של Ara h 2 ספציפי IgE ו IgG1 בסרום של עכברים תמצית בוטנים רגישים על ידי ELISA עולה כי עכברים עם רגישות ממוסמר כי הם שיפרו עם Ara h 2 התערוכה מדידה Ara h 2 ספציפי IgE ו IgG1 בסרום שלהם.

טמפרטורות הגוף שנרשמו במהלך אתגר Ara h 2 מגלות כי עכברים אלרגיים מדגימים ירידה בטמפרטורות הגוף בעקבות האתגר, בעוד טמפרטורות הגוף בעכברים נאיביים נשארות עקביות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור בזהירות לעקוב אחר כמות החלבון הקשורים לשומנים המשולבים בליפוזומים, כמו יותר מדי חלבון יכול להפוך את ההבלטה קשה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מעקב ומיון של תאי B ו- T ספציפיים לאלרגן כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו תאים ספציפיים לאלרגן אלה מגיבים לטיפולים.

טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום האלרגיה לחקור immunotherapies חדשים להילחם במחלות אלרגיות באמצעות מודל העכבר הזה. אל תשכח כי עבודה עם רעלן כולרה יכול להיות מסוכן, כי ההנחיות לשימוש בו צריך להיות אחריו על פי תקני הבטיחות הביולוגיים המוסדיים המקומיים שלך.