נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

שיטה זו תאפשר לך ליצור תמונות היסטולוגיות תלת מימדיות מדגימות בקנה מידה מילימטרי קטן, כולל אורגניזמים מודל קטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהדגימות המוטבעות יציבות מאוד, ומאפשרות לך לשמור את הדגימות לפרקי זמן ארוכים ודמיין אותן מספר פעמים, למשל בשיטות הדמיה שונות לאורך שנים. התפוקה של שיטה זו תהיה שימושית מאוד עבור פנומיקה מערכת מודל תפוקה גבוהה, טוקסיקולוגיה, ואולי אפילו אבחון רקמות אנושיות.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי הדגימות קטנות יחסית וקשה לכוון או לתמרן. הדגמה חזותית היא קריטית מכיוון שנדרשת תשומת לב כדי למנוע נזק לדוגמה. עבור זברה-דגי זברה צעירים או מבוגרים יותר, הרעיב אותם במשך 24 שעות לפחות על מנת להפחית את נפח תוכן המעיים לפני קיבעון.

מעבירים 10% פורמלין חיץ ניטרלי או NBF ו 2x Tricaine-S מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס על קרח. הכפל את נפח מי הדגים עם MS-222 מקורר 2x עבור המתת חסד מהירה ואנושית. 60 שניות לאחר שהדגים הפסיקו לנוע, לאחר המתת חסד הומנית, מניחים את הדגים בתווית 10%NBF צוננת בבקבוקוני זכוכית שטוחי תחתית בטמפרטורת החדר, ומקבעים אותם בן לילה.

ביום השני, לשטוף את דגימות דגים קבוע שלוש פעמים 1x PBS pH 7.4 במשך 10 דקות כל אחד. לאחר הכביסה, מטביעים את הדגימות ב-35% אתנול ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה. לאחר מכן חזור על שלב זה עם 50%אתנול.

הדגירה את הדגימות בחומצה 0.3% זרחן מוכן טרי או פתרון PTA לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה כדי להכתים אותם. התחל את היום השלישי על-ידי הכנת תערובת נפח אחר נפח של 100%אתנול ו- LR שרף אקריליק לבן. שוטפים את הדגימות שלוש פעמים ב-70% אתנול למשך 10 דקות כל אחת, ואז דוגרים את הדגימות ב-90% אתנול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בתסיסה עדינה.

חזור על הדגירה באותם תנאים אבל 95% אתנול ולאחר מכן פעמיים נוספות עם 100% אתנול. בסוף, להטביע את הדגימות בתערובת שרף אתנול אחד לאחד LR לבן אקריליק, ודגירה בטמפרטורת החדר לילה עם תסיסה עדינה. ביום הרביעי, להסיר את התערובת מן הבקבוקון, ולהוסיף 100%LR שרף לבן כדי להפוך את הדגימות.

דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. לאחר שעתיים, החליפו את שרף שרף לבן טרי 100%LR, ודגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה. כדי להרכיב את מנגנון ההטבעה, השתמש צינורות MI פולי עם קוטר של לפחות 0.1 מילימטרים גדול יותר מאשר קוטר הדגימה, לחתוך אותו לאורך סטנדרטי של 30 מילימטרים.

לאחר מכן חבר ראש צינור מיקרו P1000 לקצה הלבן של מתאם ההטבעה והכנס את צינורות ה- MI לסוף הצר שלו. לאחר הדגימות יש דגירה במשך שעה אחת ב 100% שרף לבן LR, להעביר אותם לסירת שקילה קטנה להטביע אותם באופן מלא 100% שרף לבן LR. כוונו את הצינורות של מנגנון ההטמיע בקצה הרחב של המדגם הקבוע, או לכיוון הראש, והצינור את הדגימה לאט לתוך הצינור.

מקם את המדגם באמצע הצינור, לוודא כי צינורות מעל ומתחת לדגימה מלא שף. מיד לאחר מכן, כדי לאטום את הקצה הפתוח של הצינורות, לשטח חתיכת חימר דוגמנות רך על בסיס שמן לתוך גיליון על מילימטר אחד עבה לייצב את הצינור בין האצבעות האינדקס והאצבעות האמצעיות. ואז לאט ללחוץ על החימר על קצה הצינור עם אגודל, ולהסיר כל חימר עודף.

הסר את מנגנון ההטבעה מראש המיקרו-צינור. משוך את הצינורות על ידי סיבוב עדין. תוך החזקת אצבע על הקצה האטום כדי למנוע את פליטת החימר, לאט לדחוף את הקצה החתום של הצינור לתוך החימר.

מניחים את הצינור אופקית על מתלה צינור, ולאפשר את שרף לפולימר במשך 24 שעות ב 65 מעלות צלזיוס בתנור. בסוף היום שלמחר, לאסוף את הדגימות לרכישת תמונה. זחל זברה מוטבע בהצלחה אין בועות אוויר לכודים.

אם האוויר נלכד במהלך תהליך ההטבעה, הוא יכול לנוע לכיוון הדגימה אם הדגימה אינה ממוקמת אופקית במהלך הפולימריזציה, מה שיכול לפגיעה באיכות התמונה. פרוטוקול זה הצליח להטמיע אורגניזמים מודל שונים. כגון זברהפיש, דרוסופילה, דפניה ועובר עכבר.

ניתן להציג את ההטבעה המוצלחת עם עיבודים תלת-ממדיים משוחזרים, המדמיינים בסריקת מיקרו-CT עבור זברה-פיש, דפניה ודרוסופילה. ניתן לראות את שף ההטבעה בכל הסריקות מחוץ לדגימה, אך אינו מפריע לדגימה עצמה. דגימות אלה ניתן לאחסן לתקופה ממושכת של זמן לשימוש חוזר עבור הפעלות הדמיה מרובות, כפי שמוצג עם זחל זברה 2011.

ואז שוב בשנת 2013. תכונות אנטומיות נשמרות לאחר האחסון, כפי שניתן לראות על תקריבים של השרירים משתי הסריקות. יתר על כן, פרופילי אינטנסיביות מנורמלים לממוצעים המתאימים להם לאורך קווים מקולחים, מציגים שיאים מקומיים תואמים מרחבית בשתי הסריקות.

ערכי העוצמה הממוצעת עבור אזורים נבחרים בשתי הסריקות חולקו בממוצע לרקע והשתמשו בהם ליצירת יחסי אות לרעש, שהתכתבו היטב בין הסריקות. בעת ניסיון שיטה זו, חשוב לעבוד בעדינות כדי למנוע נזק לדוגמה ולעבוד בזהירות כדי למנוע כניסתה של בועות אוויר. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כגון היסטולוגיה או מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשתמש על מנת ללמוד דפוסים של ביטוי חלבון, או להשיג רזולוציה גבוהה יותר של אזורים מעניינים 2D.

תקוותנו היא כי פרסום זה יעזור לך לגשת לעוצמה של מיקרו-CT רקמות ברזולוציה גבוהה.