ייצור של התקנים השבירה-אינדקס-מתאימים עבור מיקרופלואידיקה ביו
10 בספטמבר 2018
פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של התקנים microfluidic מ- MY133-V2000 כדי לסלק חפצים שעולות לעתים קרובות microchannels עקב המדדים השבירה המאולתר בין מבנים microchannel של תמיסה מימית. פרוטוקול זה משתמש של מחזיק אקרילי כדי לדחוס את המכשיר שעברו אנקפסולציה, שיפור הדבקות הן מבחינה כימית והן מבחינה מכנית.
שיטה זו יכולה לסייע בהתמודדות עם אתגר חשוב בשילוב מיקרוסקופיה עם מיקרופלואידיקה על ידי התאמת מקדם שבירה בין מבנה המיקרו-ערוץ למדיה המימית בתוך התעלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא תואמת לשיטות ייצור המשמשות בדרך כלל ליצירת מכשירים מיקרופלואידיים. יתרון מרכזי נוסף של הגישה שלנו הוא שיטה המשמשת לאיטום מיקרו-תעלות העשויות מחומרים בעלי הידבקות נמוכה, שהיא בעיה נפוצה בקרב פולימרים בעלי מקדם שבירה היטב.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהשלבים לאיטום הערוץ יכולים להיות קשים לביצוע נכון. לדוגמא, חשוב שהמאגרים יהיו ללא הפרעה במהלך ההידוק. התחל הליך זה בייצור של פולידימתילסילוקסן, או PDMS, שלילי, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, מלא את שלילי ה-PDMS ב-400 מיקרוליטר של MY-133-V-2000. יש למלא מעט את הנגטיב. הנח את ה-PDMS השלילי המלא MY-133-V-2000 בתא הוואקום למשך שעתיים כדי להסיר בועות.
לאחר הוצאת ה-MY-133-V-2000 מתא הוואקום, לחץ על שקופית זכוכית כנגד החלק העליון של הנגטיב המלא מעט יתר על המידה כדי ליצור משטח שטוח של MY-133-V-2000 וכדי למנוע מחמצן לעכב פילמור. לאחר מכן, הכנס את ה-MY-133-V-2000 לתנור UV של 400 וואט. הגדר את קרינת ה-UV ל-50% מהעוצמה המקסימלית למשך 300 שניות כדי לרפא את המיקרו-ערוץ.
זהו הספק של כ-4.5 ג'אול לסנטימטר מרובע, בערך כפול מכוח הריפוי המינימלי המומלץ על ידי היצרן. לאחר חיתוך האקריליק כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הניחו שתי טיפות קטנות על קצה האקריליק ולאחר מכן השתמשו בכלי חד פעמי כדי לפזר את הדבק באופן שווה. הניחו את מצע הזכוכית על האקריליק והניחו לדבק להתייבש באמצעות משקל הזכוכית כדי להחזיק אותו במקומו.
מצפים את הזכוכית החשופה ב-100 מיקרוליטר PDMS באמצעות פיפטה תזוזה חיובית. לאחר מכן, הכנס את שכבת הבסיס לציפוי ספין ואקום כדי לצפות את הזכוכית באופן שווה בסרט PDMS בעובי של כ-10 מיקרומטר במהירות של 1500 סל"ד למשך שתי דקות. הסר את שכבת הבסיס מציפוי הסיבוב ונגב בזהירות את כל עודפי ה-PDMS שציפו את האקריליק באצטון ומגבת נייר.
היזהר לא להפריע ל-PDMS שלא נרפא. כעת, אופים את שכבת הבסיס עם ה-PDMS בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לרפא את ה-PDMS. זרקו מיליליטר אחד של PDMS על מגלשת זכוכית ולאחר מכן השתמשו בשקופית זכוכית נוספת כדי לפזר את ה-PDMS באופן שווה עד שהוא מתחיל לזלוג מהצדדים.
רפאו את זה על פלטה חמה בחום של 150 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חותכים את ה-PDMS הנרפא למלבן עם אותם מידות כמו מכשיר MY-133-V-2000. לאחר מכן, השתמשו בשכבת האמצע של האקריליק כתבנית, נקבו חורים למאגר וחתכו חלון צפייה מרובע ב-PDMS כדי ליצור את אטם ה-PDMS.
כעת, הסר את ה-MY-133-V-2000 הנרפא מתנור ה-UV והסר את התעלה מהנגטיב והנח אותה על מצע שטוח כשצד התעלה פונה כלפי מעלה. הסר את שכבת הבסיס המכילה את ה-PDMS הנרפא מהתנור של 65 מעלות והנח אותה על המצע. לאחר מכן, הנח את המצע הן עם תעלת MY-133-V-2000 והן עם שכבת הבסיס לתוך מנקה פלזמת החמצן.
הגדר את לחץ הוואקום ל-200 מיליטור ואת רמת תדר הרדיו לגבוהה. המשך לטיפול פני השטח בתעלה ובמצע הזכוכית למשך 30 שניות. פלזמת החמצן צריכה להאיר בכחול כאשר מנקה הפלזמה מופעל.
לאחר 30 שניות, הסר גם את המיקרו-ערוץ וגם את שכבת הבסיס ממנקה הפלזמה. בעזרת מלקחיים, הנח מיד את צד התעלה MY-133-V-2000 כלפי מטה בחתך המלבני של אקריליק שכבת הבסיס, כך שהוא יוצר קשר עם ה- PDMS. כעת, הנח את אטם ה-PDMS על גבי מכשיר MY-133-V-2000, ומיישר את החורים באטם עם המאגרים במכשיר.
השימוש באטם PDMS זה הוא קריטי מכיוון ש-PDMS אלסטי יותר מ-MY-133-V-2000 ולכן ניתן לדחוס אותו יותר. זה מאפשר להעביר את הכוח מהאקריליק למיקרו-ערוץ מבלי לשבור את הזכוכית. בשלב זה, הנח את המכשיר הלא גמור על פלטפורמה מוגבהת מעל הספסל כדי לספק משטח הידוק להרכבת המכשיר.
לאחר מכן, חלץ שלושה מיליליטר של מלט אקרילי באמצעות מזרק. מחלקים מספיק מלט אקרילי על גבי שכבת הבסיס כדי לספק ציפוי דק. הפוך את המעיל לאחיד ככל האפשר ואל תתנו לחומר לחלחל לתעלה.
כעת, הניחו את חתיכת האקריליק בשכבה האמצעית על גבי שכבת הבסיס האקרילית. ודא שהחורים מסתדרים עם המאגרים של ערוץ MY-133-V-2000. מהדקים את השכבה האמצעית כלפי מטה על שכבת הבסיס בצורה הדוקה ככל האפשר ומחזיקים אותה למשך שתי דקות בזמן שהמלט מתקשה כדי לחבר את חתיכות האקריליק יחד.
ודא שהמאגרים אינם חסומים במהלך שלב זה כדי למנוע כליאת אוויר מתחת להתקן MY-133-V-2000. אוויר הכלוא בין ה-MY-133-V-2000 למצע יישאר כלוא אם המאגרים חסומים. זה יגרום לדליפות במכשיר המוגמר.
לכן, זה קריטי שהחורים לא ייחסמו במהלך שלב זה. לאחר שהמלט מתקשה, הסר את הלחץ מהמכשיר. הניחו את המלט האקרילי על שכבת הביניים במקומות המגע הצפויים עם השכבה העליונה של האקריליק.
כעת, הניחו את השכבה העליונה של האקריליק על חתיכת השכבה האמצעית של האקריליק, וודאו שהחורים מיושרים עם המאגרים. הניחו לו לנוח על הספסל למשך שתי דקות בזמן שהמלט האקרילי מתייבש. בדוק את מכשיר MY-133-V-2000 על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של צבע מאכל או מים נטולי יונים לאחד מחורי המאגר כדי לבדוק את ההדבקה והזרימה.
הכנס צינור למאגר הנגדי וחבר את הקצה השני למלכודת ואקום. הפעל את הוואקום כדי למשוך את הצבע או המים דרך התעלה כדי להבטיח שנוצר מכשיר מוצלח. בדוק במיקרוסקופ כדי לוודא שאין נזילות בתעלה או במאגר.
בעזרת הוואקום, הסר את הצבע משני המאגרים. לאחר מכן, שטפו את המאגרים באתנול. מניחים את האתנול במאגר אחד.
משוך את האתנול באמצעות הוואקום. הניחו לאתנול לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מרססים היטב את התעלה באתנול ומכניסים אותה לכלי פוליסטירן סטרילי.
עוטפים אותו היטב עם Parafilm ושומרים עד הצורך. מפת החום המוצגת כאן מייצגת את המסה של תאי MCF-7 דבקים ב-FOD במיקרו-ערוץ. מעט ממצאים נראים סמוך לדפנות המיקרו-תעלה.
במדידה זו, ניתן לראות תא MCF-7 אדרן יחיד בקצה המיקרו-ערוץ ליד הקיר. היעדר ממצאים בקרבת הקיר מאפשר לקבל מדידות כמותיות מדויקות, גם כאשר התאים קרובים לדופן התעלה. האיור הסופי הזה מראה זוג תאי MCF-7 יושבים ליד דופן המיקרו-ערוץ.
ניתן למדוד במדויק את המסה של תאים אלה בכל פיקסל באמצעות מיקרוסקופ פאזה כמותית. תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לא לחסום את המאגרים בעת הידוק המכשיר בזמן שהמלט האקרילי מתייבש. חסימת החורים לוכדת אוויר בין ה-MY-133-V-2000 למצע.
זה יגרום לדליפות בתעלה במהלך הזרימה. השימוש ב-MY-133-V-2000 כחומר ייצור למכשירים מיקרופלואידיים מספק יתרון מובהק על פני חומרים מסורתיים על ידי הפחתה משמעותית של חפצים ליד קירות מיקרו-ערוצים. זה מאפשר לבצע מדידות כמותיות בסמיכות למבני מיקרו-ערוצים.
מכשירים המיוצרים בפרוטוקול זה תואמים לכל טכניקת מיקרוסקופיה נפוצה. פרוטוקול זה מבוסס על פתוגרפיה של תאים ולכן הוא תואם לטכניקות מיקרופלואידיות מתקדמות אחרות כגון ממייני תאים או מחוללי שיפוע לחקר התנהגות התא. בסך הכל, טכניקה זו מציידת את החוקרים בכלי חדש לבדיקות מיקרופלואידיות ביו-רפואיות המבוססות על מיקרוסקופיה.
לדיוק הנוסף שהוא מעניק למדידות כמותיות במיקרו-ערוצים יש יישומים חשובים בתחומים רבים, כולל גילוי תרופות וניתוח תאים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור התקני מיקרופלואידיקה באמצעות MY133-V2000 כדי לצמצם ארטיפקטים הנגרמים מחוסר התאמה במקדם השבירה. השימוש במחזיק אקרילי משפר את ההידבקות של ההתקן המעטוף, ובכך נותן מענה לאתגרים נפוצים במיקרופלואידיקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרופלואידיקה
- ייצור התקנים
- הנדסה אופטית
רקע
- התאמת מקדם השבירה היא קריטית ביישומים מיקרופלואידיים.
- הדבקה נמוכה באיטום מיקרו-תעלות היא בעיה נפוצה.
- הדגמות חזותיות הן חיוניות להבנת תהליך האיטום.
- שיטות ייצור נפוצות כוללות שימוש ב-PDMS.
מטרת המחקר
- לשיפור התאימות של התקני מיקרופלואידיקה למיקרוסקופיה.
- לשיפור שיטות האיטום עבור חומרים בעלי היצמדות נמוכה.
- לספק פרוטוקול ברור לייצור ההתקן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור תבניות שליליות מ-PDMS.
- שימוש במחזיקי אקריל לדחיסת ההתקן.
- טכניקות איטום עבור מיקרו-ערוצים.
- הדגמות ויזואליות של תהליך האיטום.
תוצאות עיקריות
- הפחתה מוצלחת של ארטיפקטים בערוצים מיקרוסקופיים.
- שיפור ההידבקות של התקני מיקרופלואידיקה.
- שיפור התאימות לטכניקות מיקרוסקופיה.
- שלבי פרוטוקול ברורים למעבדה.
מסקנות
- הפרוטוקול מעניק מענה יעיל לאתגרי מדד השבירה.
- הוא מספק שיטה מהימנה לאטימה של מיקרו-ערוצים.
- גישה זו עשויה להקל על מחקרי מיקרו-פלואידיקה בעתיד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חוסר התאמה במקדם השבירה בין חומרי התקני מיקרופלואידיקה לבין מדיה ביולוגית מימית גורם לארטיפקטים אופטיים הפוגעים בדיוק של דימוי כמותי בתהליכי גילוי תרופות וניתוח תאים בודדים. ייצור התקנים מפולימרים בעלי מקדם שבירה נמוך, כגון MY133-V2000, מאפשר תאימות ישירה למיקרוסקופיה, ובכך מפחית את אי-הוודאות במדידה ומשפר את מהימנות הנתונים בזרימות עבודה של תיקוף מטרות בשלבים מוקדמים וסריקה פנוטיפית. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבטחה שהתגובות התאיות שנצפו אינן מושפעות מארטיפקטים הנגרמים על ידי הפלטפורמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה מדויקת של היפותזות טיפוליות על ידי ביטול ארטיפקטים של מקדם שבירה שעלולים לעוות את קריאות הפנוטיפ התאי בקרבת דפנות התעלות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות בסביבות מיקרופלואידיות שבהן נדרש בקרת מרחב מדויקת של ביו-מולקולות ותאים לצורך הבהרת מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקות המשך על ידי הבטחה שמדידות של מיקרוסקופיה פאזית כמותית משקפות התפלגות מסה תאית אמיתית ולא עיוותים אופטיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה על ידי מזעור השונות בין בארות הנגרמת מאפקטי שוליים במכשירים קונבנציונליים מבוססי PDMS.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רלוונטיות למחלה באמצעות תאימות לבדיקות תאים דבקים חיים, מה שמאפשר ניטור רציף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני ללא הכנסת הטיות במדידה.
- ערך תפעולי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים על ידי אספקת נתונים אמינים ונקיים מארטיפקטים, אשר משפרים את הביטחון החזוי ביעילות ובפרופילי רעילות של תרכובות מובילות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי על ידי שיפור דיוק המדידה במהלך סריקה ביולוגית מוקדמת, שבה כימות מדויק של פנוטיפים תאיים חיוני לזיהוי מובילים (leads) ולהתקדמות פרה-קלינית.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן רזולוציה מרחבית מדויקת של תגובות תאיים בערוצים מיקרופלואידיים, ללא הפרעות אופטיות הנובעות מחוסר התאמה בין החומר למדיה.
- סריקה: מבטיח מוכנות ושחזור של הבדיקה באמצעות הפחתת ארטיפקטים אופטיים, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות בפורמטים מיקרופלואידיים המשמשים לבדיקת מעורבות מטרה (target engagement) וסריקה פנוטיפית.
- אנליטיקה: מספק פלטים של מיקרוסקופיית מופע (phase microscopy) כמותית, המעניקים מדידות מבוססות מסה ללא סימון (label-free), החיוניות להשוואת שינויים תאיים מושרי-תרופה בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלב הגילוי לרצף פרה-קליני על ידי שמירה על יושרה של המדידה בבדיקות מבוססות תאים המדמות פתופיזיולוגיה אנושית.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת פלטפורמה לשימוש חוזר התואמת את זרימות העבודה הקיימות של ליתוגרפיה רכה, ומאפשרת סטנדרטיזציה על פני מספר פרויקטים ותחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית הנובעת מארטפקטים אופטיים ספציפיים לפלטפורמה במדידות מיקרופלואידיות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה באמצעות תאימות לטכניקות ייצור מבוססות ולפלטפורמות מיקרוסקופיה נפוצות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות יעילה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי שיפור איכות הנתונים בסריקה ראשונית, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים וחוסר יעילות של הון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות מותאם סיכון באמצעות נתונים פרה-קליניים ברמת דיוק גבוהה יותר, המשקפים באופן מדויק יותר את הפעילות הביולוגית האמיתית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בליתוגרפיה רכה, טיפול בפולימרים וטיפול פלזמה של חמצן במשטחים לצורך הרכבה מוצלחת של ההתקן.
- תלוי בגישה לציוד פילוס UV, תאי ואקום וכלי דיספנסینگ (dispensing) מדויקים לייצור ואיטום של תעלות מיקרופלואידיות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין קבוצות הייצור, הדימוג ופיתוח הבדיקות (assays) על מנת להבטיח ביצועים עקביים של ההתקן.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול לסוגי תאים שונים או לגאומטריות מיקרופלואידיות שונות, במיוחד בנוגע לעיצוב המאגר (reservoir) וללחץ ההידוק.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון הצורך בניהול קפדני של המאגר במהלך ההרכבה למניעת כליאת אוויר ודליפה מההתקן, כפי שצוין בפרוטוקול.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Fabrication of the MY133 Microchannel
6:50
Testing and Use of the MY133-V2000 Device
7:57
Results: Few if any Artifacts are Observed Near the Microchannel-solution Interface with or without Cells in Close Proximity to the Channel Wall
8:45
Conclusion
