Name: חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למדו טיהור חלבונים באנאירוביות ואפיון קינטי באמצעות אלקטרודת חמצן. השיטה מדגימה שמירת פעילות אנזים DesB בתנאי חוסר חמצן לחלוטין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות. דר ' קלר קאמי מתה האוניברסיטה לקבלת תמיכה טכנית. תודה פרופסור לינדזי ד Eltis ו ג'נה Capyk ק מ אוניברסיטת בריטיש קולומביה, וכן כריסטיאן וויטמן של אוניברסיטת טקסס באוסטין, מיוחדת על עצתם לגבי שיטות טיהור חלבונים אנאירובית ושימוש של האוריאולס2 -אלקטרודה רגיש.

המחברים יש אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.

השלבים הקריטיים בהשגת חלבון DesB פעיל, מטוהרים לערב היווצרות ושמירה של האתר הפעיל Fe(II) מופחתת של האנזים. ככזה, לתקן ביצועים של אינדוקציה, היטהרות, ריכוז, desalting צעדים חיוניים להשגת בהצלחה אנזים פעיל. גרימת ביטוי חלבון בנוכחות 1 מ"מ ברזלי אמוניום סולפט מבטיחה כי Fe(II) הוא שולב בצורה נכונה האתר הפעיל של DesB. שיטה זו היא בהשראת מחקרים כאלה עם amidohydrolase metalloenzymes, אשר לעיתים קרובות דורשים התוספת של מתכת למדיה הצמיחה כדי לאפשר קיפול נכונה, מתפוסה מלאה של המתכת מחייב האתר6,<s...

אנזימים לנצל ברזל או מתכות אחרות להפעלת חמצן רגישים לעיתים קרובות איון במהלך תהליך טיהור בגלל הוצאתם מן הסביבה תוך צמצום של תא. לכן, חלבונים אלה חייב לשמש תא lysates, יהיה נתון חיצוני צמצום סוכנים או להיטהר anaerobically כדי להבטיח כי יש להם פעילות אנזימטי אופטימלית1,2,3,4. עבור אלו אנזימים הנמצאים חמצן-רגיש (במיוחד ברזל המכיל אנזימים), ביצוע כל הפעולות לטיהור ואפיון תוך שמירה על תנאים אנאירוביים יש צורך לאפיין אותם באופן מלא. זה הוביל החוקרים לפתח המעבדה כולה set-ups בתחומיו של צ'יימברס אנאירובית ללימודים החל ביטוי חלבון באמצעות קריסטלוגרפיה5,6,7,8 .
במסמך זה, אנו מדווחים על שיטות טיהור אנאירובית ואפיון קינטי של האנזים DesB באמצעות מערכת אלקטרודה חמצן. DesB הוא dioxygenase מספר של החיידק Sphingobium sp. זן SYK-6 הקשורה ל- LigAB, dioxygenase protocatecuate מן האורגניזם באותו. שני אנזימים שייך סוג II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily אשר לא בהרחבה נחקרה עד תאריך9, ככל הנראה באופן חלקי בגלל אנזימים של זה superfamily להיות רגישים איון כאשר מטוהר באמצעות תקן אירובי שיטות טיהור חלבונים. מאז חלק אנזימים PCAD להציג את המצע הפקרות ואילו אחרים הם ספציפיים המצע2,10, נוספות אפיון superfamily הזה יש צורך לזהות גורמים ירידה לפרטים. כפי נצפתה מספר אנזימים superfamilies11,12,13,14,15, מולקולות קטנות יכול לשנות את הפעילות באמצעות עיכוב תחרותי ישירה או עקידת מולקולות להפרדה הכיסים allosteric אשר גורמת לעלייה או לירידה בפעילות אנזימטי16. בעוד קינטיקה לבד לא יכול להבדיל בין המיקום מחייב של אפנן, הקובע שסדר הגודל של שינוי פעילות חשוב להבנת ההשפעות. בתור שכזה, שיטות אפיון קינטי של פעילות DesB מקורי, פעילותה בנוכחות 4-nitrocatechol (4NC), תרכובת נפוץ כדי לאפיין ומעכבות dioxygenase אנזימים2,17, 18, מוצגים.
DesB הוא מסוגל לשבור את מספר, ליגנין-derived ארומטי במתחם, דרך לתגובה dioxygenase (אדו) extradiol בטבעת אשר הוא פתיחת מזורז באמצעות חמצן כאחת סובסטרטים10,19. כזאתי אנזימטי מתרחשת בתוך ההקשר של פירוק של ליגנין, heteropolymer ארומטי נמצאו דופן התא בצמחים. יכול להיות depolymerized ליגנין, מניב מגוון של תרכובות ארומטיות אשר ניתן עוד יותר לפרק לתוך מטבוליטים המרכזי3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (אדו) לעודד טבעת פתיחת התגובה על תרכובות ארומטיות dihydroxylated, שבו המחשוף מתרחשת בסמוך diol בתיאום מתכת; לעומת זאת, intradiol dioxygenases קליב תרכובות ארומטיות מקביל בין שתי הקבוצות הידרוקסיל (איור 1). EDOs, כמו metalloenzymes רבים אחרים, יש מרכז מתכת כלט Fe(II) תיאום מורכב של היסטידין שתיים, אחת-carboxylate שילוש9,34,35. אלה metalloenzymes להיות מחומצן, דרך autoxidation או מבוסס על מנגנון איון, ואילו האנזים מעובד אינו פעיל2,36,37,38.
בפרוצדורות ניסיוני תיאר כתב יד זה, אנו מנצלים DesB, חבר superfamily PCAD מן sp. Sphingobium החיידק SYK-6, כדי לעודד התוספת של חמצן על-פני הקשר C4-C5 של מספר (איור 2 א). Regiochemistry של פצילות הזה הוא מקביל LigAB, שהוא protocatechuate-4, 5-dioxygenase (איור 2B). עד כה, חקירות של dioxygenase מספר זה כוללות אין דיווחים על תרכובות המעכבות DesB10,19,39. עם השימוש של שיטות לטיהור אירובי, DesB הציג פעילות משתנה, בעוד עם השימוש בשיטות אנאירובית הצלחנו לקבל באופן עקבי את החלבון עם פעילות לשחזור. המחקרים קינטי המתוארים כאן מלמדים שיטות טיהור אנאירובית של DesB, אפיון קינטי של התגובה של DesB עם מספר, עיכוב של DesB על ידי 4-nitrocatechol (4NC).

<table><tbody><tr><td>איזופרופיל &בטא;-D-1-תיוגלקטופיראנודיז</td><td>גולד ביו טכנולוגיות</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30% אקרילאמיד</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N'tetramethyl-ethylenediamine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>שרף עמילוז זרימה גבוהה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) תאי Escherichia coli מוכשרים</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גאלית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-ניטרוקטכול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>ברזל אמוניום גופרתי</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דיתיוניט</td><td>אלפא Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי סרום וויטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"מ מסנן מזרק Acrodisc PF עם Supor Membrane</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 מ"ל Amicon רכז תאים מעורבבים</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 מ"מ Millipore Ultracel 10 kDa חיתוך מחדש מסנן ממברנת תאית</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 התפלה גסה גל עמוד</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל בקבוקוני לחיצה עליונים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>אוקסיגרף פלוס יחידת</td> <td>בקרת אלקטרודותHansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרודה חמצן</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>דיסק אלקטרודה</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125 מ"מX25 מ"מ) סליל 30 מטר</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי אלקטרודות</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>נייר מרווח</td><td>זיג זג</td><td>זמין בכל תחנת</td><td></td>דלק</tr> תיבת <tr><td>כפפות Dri-Lab מסדרת He-Dri-Lab</td><td>ואקום/אטמוספרות חברת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>ואקום/אטמוספרות חברת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרית נירוסטה מיקרו-מחודדת</td><td>כפולה פישר סיינטיפיק</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK מדעי החיים Kimble Kontes Flex Column כלכלה עמוד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L, דגם 701 N SYR, מלט NDL 26s ga, 2 אינץ', נקודה stlye 2 מזרק</td><td>המילטון</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK מדעי החיים Kimble Kontes Flex Column Economy Column</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex-C5 הומוגנייזר בלחץ גבוה</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-PER מגיב מיצוי חלבון חיידקי שלם</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>ליזוזים מחלבון ביצת עוף</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>טריס הידרוכלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>מלטוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד desb dioxygenase פעילות וניגוד

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבונים חמצן רגישים, כולל לאנזימים אשר מנצלים חמצן כמו מצע, יכול הפחיתו יציבות כאשר מטוהר בשיטות מסורתיות טיהור אירובי. כתב יד זה ממחיש את הפרטים הטכניים מעורב בתהליך טיהור אנאירובית, כולל הכנת מאגרי, ריאגנטים, השיטות עבור עמודה כרומטוגרפיה תא הכפפות, וכן את desalting של החלבון לפני קינטיקה. גם המתוארים הם השיטות להכנה של באמצעות אלקטרודה חמצן כדי לבצע אפיון קינטי של אנזים ניצול חמצן. שיטות אלו מומחשים באמצעות האנזים dioxygenase DesB, dioxygenase מספר של החיידק Sphingobium sp. זן SYK-6.

המוצג הוא ניתוח ג'ל מרחביות-דף של שברים בודדים מטיהור של הבונה פיוז'ן (איור 3) חלבון (MBP) מחייב DesB-מלטוז. הג'ל מגלה כי החלבון הוא טהור (MW = 91.22 kDa), למעט הנוכחות של DesB (MW = 49.22 kDa) ובתחום MBP חלבון (42 kDa) ביקע אחד מהשני. שברים E2 ו- E3 נבחרו ריכוז (שלב 4.2).
תוצאות מבחני קינטי DesB לשחזור תלויות הרכבה נכונה, כיול, טכניקה חדשה וניסיונית. זה הכרחי קלט את טמפרטורת הסביבה הנכונה ואת הלחץ,...

כאן אנו מציגים עבור טיהור חלבון אנאירובית, ריכוז חלבון אנאירובית, ואפיון עוקבות קינטי משתמש במערכת אלקטרודה חמצן פרוטוקול. השיטה מומחש באמצעות האנזים DesB, אנזים dioxygenase אשר פעיל כאשר מטוהרים ומאוחסנים בסביבה אנאירובית ויציבה יותר.

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

שיטה זו נועדה לענות על שאלות מפתח בתחום הביוכימיה האנורגנית, על איך לשמור על פעילות אנזימים בחלבונים המכילים מתכות רגישות לחמצן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה עוזר לך לדמיין דרכים שבהן אתה יכול לשמור על המתכת של חלבון במצב מופחת שלה. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו כי קשה לשמור על חומרים בריאגנטים להיות אנאירובי לחלוטין.24 שעות לאחר גרימת ביטוי חלבון, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, ו resuspend גלולת התא החיידקי ב 20 מיליליטר של מאגר עמודת amylose לכל 1.5 ליטר של צמיחה. מוסיפים מיליגרם אחד של lysozyme להשעיית התא, ומערבבים את התאים במשך 20 דקות על קרח. בסוף הדגירה, lyse פתרון התא resuspended באמצעות הומוגניזציה בלחץ גבוה עם שלושה עד חמישה עובר בערך 15, 000 psi, ולהעביר את החלבון לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.לשטוף את מרחב הראש עם חנקן במשך דקה אחת, צנטריפוגה התא ליסאט כדי להסיר את הפסולת מסיסים. מעבירים את העל-טבעי לצינור אחד של 50 מיליליטר לפחות, ומכסים את ה"ליזאט" במ מחיצת גומי. באמצעות מחט 20-מד, לאט בועה גז חנקן דרך הפתרון במשך שתי דקות כדי לעקור את החמצן.לאחר מכן, לעטוף את מחיצה עם סרט פרפין, לאבטח את Parafilm עם חוט נחושת, ולמקם את supernatant לתוך תא הכפפות עם חומרי העמוד. כאשר הממס נמצא ממש מעל מיטת הרף, בעמוד אמילוס שהוכן בעבר, לטעון 50 מיליליטר של חלבון על גבי העמוד, איסוף זרימה דרך שברים חמישה מיליליטר תחת חנקן בלחץ בינוני בערך חמישה מיליליטר לדקה. כאשר כל הזרימה-דרך כבר eluted, לשטוף את העמודה עם עוד שלושה כרכים עמודות של מאגר עמודה amylose.הוסף חמישה קורות חיים של מאגר אלוטיון, ולאחר מכן לאסוף באופן ידני שברים שלושה מיליליטר במבחנות זכוכית תחת חנקן בלחץ בינוני. בדוק את הפתרונות לנוכחות חמצן עם אמוניום גופרתי ברזלי ודיתיותריתול. הפתרון יהפוך לכחול כהה או שחור אם קיים חמצן, כמו הצינור מימין.נוכחות של חמצן תגרום חלבון מטוהר עם פעילות קטליטית נמוכה. פתרונות עם כמות חמצן מינימלית יהיו צבע שקוף לבנדר או כחול בהיר, כמו הצינור בצד שמאל. לאחר מכן, השתמש בקו חנקן חיצוני כדי ללחוץ על תא התאים המעורר, ולרכז את החלבון ל-50 מיליליטר במהירות ערבוב מתונה פעמיים.לאחר מכן, לרכז את החלבון ל 10 מיליליטר, ולסנן את החלבון מרוכז באמצעות מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר-נקבובית. Aliquot 150 microliters של חלבון לתוך צינורות תגובת שרשרת פולימראז 200 מיקרוליטר בודדים. לאחר מכן, להסיר את aliquots כתרים מתיבת הכפפות להקפאת הבזק מיידית בחנקן נוזלי ואחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.להתפלת DesB, הוסיפו תחילה שלושה מיליליטר של ג'ל התפלה גס Sephadex G-25 לעמוד בורוזיליקט של תשעה מיליליטר, ושטפו את העמודה בשני כרכים של מאגר התפלה מנוכה. כאשר DesB יש להפשיר, לטעון את החלבון המטוהר על העמוד באמצעות תהליך מבוקר כבידה, ולהשליך את הזרימה דרך לפני eluting שלוש טיפות חלבון לתוך כל אחד 12 בקבוקונים, עם כחמישה מיליליטר של חיץ התפלה. כדי להכין את אלקטרודות החמצן, השתמש במספריים כדי לחתוך אחד בערך 1.5 אינץ 'ריבוע של נייר רווח, לחתוך משולשים קטנים על כל פנים של הריבוע, עם חריצים בפינות כדי לסייע בעטיפה של האלקטרודה.הוסף חמש טיפות של תספורת כלוריד אשלגן 50% על חריץ אנודה כסף של האלקטרודה, ולחבר את הטיפות כך שהם יוצרים טבעת רציפה של פתרון. מוסיפים שתי טיפות של תספורת האשלגן כלורי לחלק העליון של אלקטרודה פלטינה, בזהירות למקם את נייר החלל על גבי אלקטרודה פלטינה, מחליק את נייר החלל כך שאין בועות אוויר. חותכים חתיכה באורך של כ-2 אינץ' של קרום S4 30m PTFE, וממקמים אותו על גבי נייר החלל, מסירים את קצות הממברנה כך שהם מיושרים עם הטבעת החיצונית של האלקטרודה.באמצעות מוליך O-ring, לדחוף O-טבעת קטנה מעל האלקטרודה כדי לאבטח את נייר החלל ואת הממברנה על האלקטרודה, ולהציב O-ring גדול יותר על החריץ המעגלי של האלקטרודה, דואג כי אין קרום מתחת. החלק את התא העליון של האלקטרודה אל הבסיס, ולבורג את שני החלקים יחד. מניחים את האלקטרודה שהורכבה על בסיסה, ולחבר את האלקטרודה למערכת הניטור.כדי לקבוע את קצב התגובה האנזימטית, השתמש באלקטרודה מסוג קלארק הרגישה לחמצן, עם אינטגרציה ממוחשבת כדי למדוד את צריכת החמצן באמצעות יחידת בקרת האלקטרודה. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ טריס בנפח המתאים של המצע לתא האלקטרודה, ומערבבים את הפתרון במשך 10 שניות. לאחר 10 שניות, לאט לאט לאט לאט את התא עם הבוכנה, ולבורג את החלק העליון למטה.השתמשו ברקמה נקייה כדי לספוג את הנוזל העודף שנעקרו מהתא, ולאפשר לאלקטרודה לצייד היכן שהיא יכולה לייצר מדידה יציבה של ריכוז החמצן בתסרון למשך דקה אחת לפחות. לאחר מכן, השתמש במזרק 10 מיקרוליטר הדוק לגז כדי להוסיף כמיקרוליטר אחד של אנזים לתא האלקטרודה דרך הבוכנה, ולאסוף את נתוני הקצב. כאשר נאסף כל הקצב לריכוז מצע נתון, השתמש בצינור פלסטיק המחובר לבקבוק ואקום זרוע צדדית כדי לרוקן את תא האלקטרודה, ושטף שוב ושוב את התא במשך ארבעה עד שישה מחזורים במים.לאחר מכן, להגדיר את הפתרון באלקטרודה כפי שהוכח רק, באמצעות ריכוז מצע חדש. ניתוח ג'ל SDS-PAGE של שברים בודדים וטיהור מבנה חלבון מחייב DesB-maltose חושף את הבידוד של מוצר חלבון טהור, מלבד נוכחותם של מוצרי דומיין חלבון מחייב DesB ומלטוז שנבלבו זה מזה. לאחר כל המדידות הקינטיות נלקחו, הפעילות של DesB עם gallate, למשל, ניתן להשיג על ידי מדידת קצב צריכת החמצן בריכוזי גאלט משתנים.לעומת זאת, שיעור העיכוב של DesB עם ארבעה nitrocatechol ניתן לקבוע על ידי התבוננות בירידה בקצב צריכת החמצן של DesB עם gallate מילימולר אחד בנוכחות ריכוזים משתנים של ארבעה nitrocatechol, המציין, למשל, כי ארבעה nitrocatechol מעכב את צריכת החמצן ובכך את תגובת DesB. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לחקר אנזימי dioxygenase תלוי ברזל, זה יכול להיות מיושם על מערכות אחרות, כגון metalloenzymes אחרים. אל תשכח כי עבודה בתוך תא כפפות יכול להיות מאתגר, אז לדאוג לא למהר בעת ביצוע טכניקה זו.

anaerobic-protein-purification-kinetic-analysis-via-oxygen-electrode

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים את השימוש של המכשיר הפסיקה זרימת לחקור הן את רדוקטיביים ו חמצוני חצאי...

מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

מקור: Tokunou, Y., et al, זיהוי אלקטרוכימי של השפעת איזוטופ קינטי של דאוטריום על הובלת אלקטרונים חוץ-תאית ב - Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים שיטה אלקטרוכימית של תא שלם כדי להעריך כיצד העברת פרוטונים משפיעה על הובלת אלקטרונים חוץ-תאית (EET) בחיידקים אלקטרואקטיביים. על ידי החלפת פרוטונים בדאוטרונים באמצעות תחמוצת דאוטריום, השיטה מודדת שינויים בזרם כדי לחשוף אפקט איזוטופ קינטי, ומדגישה את תפקיד תנועת הפרוטונים בוויסות זרימת האלקטרונים.

מדידת השפעת האיזוטופ הקינטי על הובלת אלקטרונים מיקרוביאלית באמצעות תחמוצת דאוטריום

כמו המיטוכונדריה הם רק אחוז קטן של תא צמח, הם צריכים טיהור למגוון רחב של מחקרים. המיטוכונדריה ניתן לבודד מתוך מגוון איברי הצמח על ידי המגון, ואחריו דיפרנציאלית וצפיפות צנטריפוגה מעבר צבע כדי לקבל חלק מיטוכונדריאלי נקיים במיוחד.

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

המיטוכונדריה מכילה מספר אנזימים תלויי-פלווין שיכול לייצר מינים חמצן תגובתי (ROS). ניטור ROS שחרור שאתרים בתוך המיטוכונדריה הוא מאתגר עקב תגובות לוואי לא רצויות. אנו מציגים שיטה קלה, זולה עבור הערכה ישירה של המחירים יליד לשחרור ROS באמצעות מטוהרים flavoenzymes ו- microplate fluorometry.

מדידה סימולטני של סופראוקסיד/מימן על-חמצני ו- NADH הייצור על ידי המכילות פלווין Dehydrogenases מיטוכונדריאלי

כאן אנו מציגים פרוטוקול של כל תא אלקטרוכימי ניסויים ללמוד את התרומה של פרוטון תחבורה לקצב התחבורה אלקטרון חוץ-תאית באמצעות cytochromes הממברנה החיצונית מתחם Shewanella oneidensis מר-1.

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

כאן נציג של פרוטוקול benchtop ותשמרו זיקה מתכת כרומטוגרפיה לטיהור ודה למפת עוקבות polyhistidine מתויג, ברזל heme שאינו מחייב dioxygenase מתאים המעבדה הוראה לתואר ראשון.

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

Protocatechuate 3, 4-דיחמצן (PCD) ניתן להסיר בחינם חמצן diאטומית ממערכת מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (PCD). פרוטוקול זה מתאר את הביטוי, הטיהור וניתוח הפעילות של אנזים ניקוי החמצן.

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

פיתחנו פרוטוקול מעשי וגישה אנליטית להערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי ויכולת העברת אלקטרונים בהומוגנטים של גידול טרי. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לסקור פונקציות מיטוכונדריאליות שונות התורמות ייזום סרטן, התקדמות, תגובה לטיפול.

קביעה אנליטית של תפקוד מיטוכונדריאלי של הומוגנטים של גידול מוצק מובחר

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

מחקר זה מציג מתודולוגיה לחקר השפעות קסנוביוטיות על תפקוד המיטוכונדריה באמצעות בדיקות ספירומטריות ואנזימטיות. הוא בוחן אפנון שרשרת הובלת אלקטרונים במינים שונים, ומציע תובנות לפיתוח ממוקד של חומרי הדברה ביולוגיים נגד מחלות המועברות על ידי וקטורים של חרקים.

חשיפת הובלה קסנוביוטית והשפעות במיטוכונדריה מבודדת: תובנות מבדיקות רספירומטריות ואנזימטיות

פרוטוקול זה מפרט את הסינתזה, עטיפת ההמוגלובין ו-PEGylation פני השטח של ננו-חלקיקי UiO-66 הנקבוביים היררכית המיועדים לאספקת חמצן. ההליך משלב הנדסת פגמים עם קונוגציה ביאורתוגונלית מעודדת על ידי עיוות, ליצירת נשאים חדירים ויציבים פיזיולוגית המתאימים ליישומים ביורפואיים.

סינתזה, קיפוזציה של המוגלובין ו-PEGylation ביאורתוגונלית בננו-חלקיקי UiO-66 היררכיים נקבוביים ליישומי אספקת חמצן

למדו טיהור חלבונים באנאירוביות ואפיון קינטי באמצעות אלקטרודת חמצן. השיטה מדגימה שמירת פעילות אנזים DesB בתנאי חוסר חמצן לחלוטין.

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

גלה סרטונים נוספים