בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה
9 בנובמבר 2018
כאן, אנו מתארים שני שלפוחית חוץ-תאית בידוד םילוקוטורפ אולטראפילטרציה צנטריפוגה, ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, לבודד שלפוחית חוץ-תאית מדגימות נוזלים שטיפה bronchoalveolar מאתר. השלפוחיות המוגלתיות חוץ-תאית נגזר נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar על ידי שתי השיטות לכמת, מאופיין.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות הקשורות היעילות, תשואת התאוששות, וטוהר של נוזל lavage ברונכואלוולרית נגזר יבולים חוץ תאיים באמצעות גישה צנטריפוגה אולטרה סינון. השווינו ישירות טכניקה זו לטכניקת טיהור הדרגתית אולטרה-מרכזית וצפיפות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה פשוט, יעיל, ומתאים דגימות נפח קטן כגון נוזל lavage ברונכואלוולאר מורין.
חשוב מכך, הוא מספק טוהר גבוה ומדרגיות גבוהה משמעותית בהשוואה לשיטת בידוד אולטרה-מרכזית. הדגמת ההליך תהיה מר נורמן גארט השלישי, עמית מחקר במעבדה שלי. כדי להתחיל, להכניס אנגיוקטר מד 22 לתוך קנה הנשימה של עכבר המתת דמה.
חבר מזרק אינסולין עם מיליליטר אחד של DPBS סטרילי קר כקרח, ולהחדיר מיליליטר אחד לשתי הריאות. לאט למשוך את הבוכנה מזרק כדי לאחזר נוזל lavage bronchoalveolar, או נוזל BAL. ולחלק את נוזל BAL לתוך צינור חרוט על קרח.
לאחר מכן, למשוך נוזל BAL מ 25 עכברים ולחלק אותו לשתי קבוצות שוות. צנטריפוגה נוזל BAL ב 400 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant ו צנטריפוגה זה ב 15, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאחר מכן לאסוף את supernatant ולהמשיך את צעדי בידוד EV מיד. ראשית, לסנן את natant סופר באמצעות מסנן מזרק סטרילי מיקרומטר 0.2. לאחר מכן, יש לצייד את יחידת הסינון הצנטריפוגלית ב- DPBS סטרילי למשך 10 דקות.
ואז צנטריפוגה יחידת הצנטריפוגלי ב 15, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מלא את המסנן עם 15 מיליליטר של נוזל BAL. וצנטריפוגה זה ב3, 000 G של במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, לשטוף את retentate עם 14 מיליליטר של DPBS סטרילי על ידי צינורות בעדינות שוב ושוב. צנטריפוגה יחידת המסנן ב 3, 000 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להסיר את DPBS ולרכז את retentate. כדי לאסוף את נוזל BAL מרוכז נגזר EV של, להכניס pipetter לתוך החלק התחתון של יחידת המסנן, ולמשוך את המדגם באמצעות תנועה גורפת מצד לצד.
ואז aliquot נוזל BAL נגזר EV של ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. לחלופין, התחל בהעברת העל-טבעי הקודם שנרכש לצינור אולטרה-מרכזי. וצנטריפוגה זה ב10, 000 G של במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
ואז לאסוף את העל טבעי צנטריפוגה. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת ה-EV ב-200 מיקרוליטרים של DPBS. לאחר מכן, לערבב את ההשעיה EV עם 300 microliters של 50% יודקסנול פתרון עבודה.
ולהעביר אותו לצינור אולטרהצנטריפוגה 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסף פתרון מאגר בהתאם לפרוטוקול הטקסט כדי ליצור שיפוע צפיפות ציפה, וצנטריפוג אותו ב 100, 000 G של במשך שלוש שעות ו 50 דקות. לאסוף את 15%ואת שברי iodixanol 25%, ולדלל אותם DPBS להביא את עוצמת הקול עד 15 מיליליטר.
מעבירים את השברים לצינור אולטרהצנטריפוגה חדש וצנטריפוגה ב 100, 000 G של בארבע מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את כדורי ה- EV ב- 50 מיקרוליטרים של DPBS סטרילי. כדי להתחיל ניתוח מעקב חלקיקי ננו, לדלל את מדגם EV במיליליטר אחד של DPBS.
ותטען את הדגימה למזרק אינסולין. לאחר מכן, לצרף את המזרק למשאבת מזרק, ולמדוד את מספרי החלקיק ואת גודל. הגדר את רמת המצלמה ל- 14 ואת סף הזיהוי לאחד.
לאחר מכן, השתמש בקורא לוחות כדי לכמת את כמות החלבון בדגימה EV באמצעות זיהוי colorimetric. ממיסים כמות שווה של חלבון EV מכל דגימה עם מאגר טעינה סופג ו- DTT. ואז לחמם את הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לטעון את הדגימות לתוך ג'ל ביס-טריס פלוס אקרילאמיד ולהפעיל אלקטרופורזה במשך 35 דקות. לאחר מכן מעבירים את החלבונים לממברנה ניטרוסלולוס בשיטת העברה יבשה. לאחר מכן, לחסום את הממברנה עם חמישה אחוז חלב דל שומן במשך 60 דקות עם נדנדה עדינה.
הדגירה את הממברנה עם נוגדן לסמן חלבון משטח EV בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה לילה. לפתח את הממברנה על ידי דגירה הממברנה עם נוגדן קישור HRP במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה במשך 10 דקות עם חיץ TBST שלוש פעמים.
לבסוף, לפתח את הממברנה עם reagent זיהוי נוגדנים HRP chemiluminescent לפני שתמשיך הדמיה. כדי להתחיל ציטומטריית זרימה, לדלל נוזל BAL נגזר EV של 49 microliters של מאגר כתמי PEB. לאחר מכן מוסיפים שלושה נוגדנים לכל אחת מהדגימות, לפני הדגירה של הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך 60 דקות בחושך.
לבסוף, לדלל את הדגימות עם 40 microliters של מאגר כתמי PEB מסונן קרום ולבצע ניתוח cytometry זרימה. בפרוטוקול זה, EV של היו מבודדים מנוזל BAL העכבר באמצעות UFC ושיטות UC-DGC. נוזל BAL נגזר EV של עכברים רגילים מבודדים על ידי שיטת UFC הציג גדלים קטנים יותר התפלגות גודל אחיד יותר מאשר UC-DGC-EV של.
בטכניקת UFC היו גם ספירת חלקיקים כוללת גבוהה משמעותית בהשוואה לטכניקת UC-DGC. התאוששות החלבון הכוללת שנמדדה במיליגרם של UFC-EV היה גם גבוה יותר מזה של UC-DGC-EV של, המציין כי טכניקת UFC הוא יותר זמן ומאמץ יעיל. לבסוף, נוזל BAL נגזר EV של גם התאפיינו עוד יותר באמצעות ציטומטריה זרימה.
ה-UFC-EV ו-UC-DGC-EV של שניהם מבוטא CD63, CD9, ו CD81. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור rehydrate קרום יחידת אולטרה סינון עם DPBS. לאחר הממברנה הוא hydrated, היחידה צריכה להישמר רטוב בכל עת עד בשימוש.
אחזור ניתוב חוץ-תאי מיחידה סינון יכול להיות מאתגר. ודא כי קצה פיפטה נסחף מצד לצד כדי לשחזר את רוב EV של מיחידה סינון. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום בידוד הגוף החוץ-תאי כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של מליפת ברונכואלוולרית שמקורה בווסקולרים חוץ-תאיים בתנאים נורמליים או פתולוגיים בבעלי חיים קטנים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שני פרוטוקולים לבידוד של שלפוחיות חוץ-תאיות מנוזל שטיפה ברונכואלוולולרי של עכברים: סנטריפוגת אולטרה-פילטרציה וסנטריפוגת אולטרה עם סנטריפוגת מדרג צפיפות. שתי השיטות מושווים מבחינת יעילות, תנובת התשואה והטוהרה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר של שלפוחיות חוץ-תאיות
רקע
- שלפוHיתים חוץ-תאיים ממלאים תפקיד מכריע בתקשורת בין-תאית.
- שיטות בידוד משפיעות על האיכות ועל השyield של השלפוHיתים.
- נוזל שטיפת סימפונות ומכניקה של הנשימה (Bronchoalveolar lavage fluid) הוא מקור בעל ערך למחקר של שלפוHיתים חוץ-תאיים הקשורים לריאות.
- ניתוח השוואתי של טכניקות בידוד יכול לשפר את תוצאות המחקר.
מטרת המחקר
- להערכת היעילות והיכולת להרחבה (scalability) של סנטריפוגציית אולטרהפילטרציה.
- להשוואתה עם שיטות אולטרסנטריפוגציה מסורתיות.
- להערכת רמת הטוהר של שלפוחיות חוץ-תאיות (extracellular vesicles) מבודדות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צנטריפוגציה של אולטרה-פילטרציה לבידוד שלשעות.
- אולטרה-צנטריפוגציה עם מדרג צפיפות לצורך השוואה.
- כימות ואפיון של שלשעות מבודדות.
- שימוש בדגימות של נוזל שטיפה ברונכואלוולולארית של עכברים.
תוצאות עיקריות
- סבב צנטריפוגציה של אולטרהפילטרציה מספק טוהר גבוה יותר של שלפוחיות חוץ-תאיות.
- שיטה זו ניתנת להרחבה (scalable) בצורה יעילה יותר עבור דגימות בנפח קטן.
- היעילות ותוצר ההשבה השתפרו באופן משמעותי.
- השוואה ישירה מדגישה את היתרונות על פני שיטות מסורתיות.
מסקנות
- צנטריפוגציה של אולטרה-פילטרציה היא חלופה יעילה לבידוד של שלפוחית חוץ-תאית.
- שיטה זו מציעה פשטות ויעילות עבור חוקרים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להרחיב את היישומים של שיטה זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בידוד יעיל וניתן להרחבה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מדגימות ביולוגיות בנפח קטן מהווה צוואר בקבוק קריטי במחקר מוקדם של דרכי הנשימה ושל סמנים ביולוגיים. טכניקת סבוב אולטרה-פילטרציה (UFC) מאפשרת תפוקה וטוהר גבוהים יותר של EVs מנוזל שטיפה ברונכואלוולולרי של עכברים, ובכך תומכת באפיון יסודי של שלבים מאוחרים יותר ובמחקרים תרגומיים. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי ומאיצה את קבלת ההחלטות לגבי תיקי פיתוח בקווי מחקר ופיתוח הממוקדים בדרכי הנשימה ובשלפוחיות חוץ-תאיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בידוד של EV בנשוא גבוה עבור מחקרים מונחי-השערה על מסלולי איתות בריאות.
- משפר את הפחתת הסיכונים הביולוגיים על ידי אספקת אוכלוסיות נקיות יותר של EV לצורך בירור מכניסטי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרה באמצעות השגב (recovery) הדירות של וסיקולות חוץ-תאיות (EV) מדגימות בנפח קטן.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקל על הכנת דגימות EV סטנדרטיות עבור בדיקות כמותיות המשך.
- משפר את שחזוריות הבדיקה על ידי מזעור אובדן דגימות וזיהומים.
- משפר את יכולת ההרחבה (scalability) ואת התפוקה של תהליכי סריקה המשתמשים בחומר ביולוגי מוגבל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי תמיכה במחקרי סמנים ביולוגיים של EV במודלים עכבריים רלוונטיים למחלה.
- מספק בידוד אמין של EV למחקר תרגומי על פתולוגיה של הריאות.
- מפחית את הסיכון בקידום מועמדים לסמנים ביולוגיים מבוססי EV באמצעות איכות דגימה עקבית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ה-UFC משתלבת בממשק שבין הגילוי המוקדם למחקר הפרה-קליני, ומאפשרת בידוד חסון של EV לצורך אנליזות מולקולריות, פרוטאומיות ופונקציונליות בהמשך התהליך.
- ביולוגיית גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובניתוח מסלולים על ידי אספקת EVs ברמת טהרה גבוהה מדגימות בנפח קטן.
- סריקה: מספקת תכשירים כמותיים וניתנים לשחזור של EV לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה מדויקת של ספירת חלקיקי EV, התפלגות גדלים ותוכן חלבונים למחקרים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם גילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים במודלים עכבריים של מחלות ריאה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה ניתנת להרחבה וסטנדרטית לבידוד EV, הניתנת להתאמה בין תוכניות מחקר של מערכות נשימה ושל שלפוחיות חוץ-תאיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים מבוססי EV.
- ערך תפעולי: מייעל את בידוד ה-EV באמצעות שיפור הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability).
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וקידום יעיל של נכסים הקשורים ל-EV מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של תוכניות לסמנים ביולוגיים (biomarkers) של מערכת הנשימה ושל EV.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד EV ובטכניקות אנליטיות המשך, כגון nanoparticle tracking ו-flow cytometry.
- נדרשת גישה ליחידות אולטרה-פילטרציה, צנטריפוגות ומכשור לכימות חלבונים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הטיפול והעיבוד של הדגימות.
- ניתן להתאים את התהליך לנוזלים ביולוגיים אחרים בנפח קטן באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר בממברנה ושחזור דגימה מדויק הם קריטיים למקסום תנובת ה-EV והטוהר שלה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:15
Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Preparation
2:21
Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid
4:56
Extracellular Vesicle Quantification
5:35
Detection of BALF-derived Extracellular Vesicles
7:16
Results: UFC Method Demonstrates Higher Total Particle Counts and Protein Recover
8:25
Conclusion
