בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-חומרים, כגון כיצד אינטראקציות מטריצת תאים משפיעות על סולפט. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת את החומר הראשון המשקף במדויק את סביבות המיקרו הביוכימיות המקוריות של קליפת המוח. קו מכסה המנוע של תרבות הרקמות עם כרית מתחת.

מניחים מקור ליטר אחד המכיל בר ערבוב, צלחת תיר רקמה סטרילית 150 מ"מ, ואת הכליה כולה לתוך מכסה המנוע. מלא את השים ב- 500 מיליליטר של פתרון 1%SDS. מניחים את הכליה בצלחת תרבות הרקמה הסטרילית.

הסר את כל השומן התדירני על ידי גילוח קל סביב כמוסת הכליה עם אזמל. לאחר מכן, לעשות חתך רדוד שמונה עד 10 ס"מ על פני הקצה העליון של הכליה, כדי לשבור לפתוח את קפסולת הכליות מבלי לפגוע ברקמת קליפת המוח הבסיסית. השתמש בשני מהדקי המוסטט כדי להסיר את כמוסת הכליה על ידי קילוף אותו הרחק רקמת קליפת המוח.

חצה את הכליה לאורך מישור הכתר באמצעות האזמל לאורך הצד הצדדי של הכליה. לבודד את רקמת קליפת המוח משני החצאים על ידי גילוף את אזור medullar עם אזמל. לאחר מכן, קוביות רקמת קליפת המוח לחתיכות קוביות 0.5 ס"מ, ולהסיר את כל גדול, כלי גלוי.

כדי לבודד מטריצה חוץ-תאית מהכליה, מניחים את רקמת קליפת המוח המחוברת בפקקת המכילה תווי SDS. מכסים את המזימה בנייר אלומיניום אוטוקלאב ומ מניחים אותה על צלחת ערבוב במהירות של כ-400 סל"ד, מחוץ למכסה המנוע של תרבות הרקמה. לאחר 24 שעות של ערבוב, להביא את המקור לתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמה.

הוסף מסננת תאים סטריליים 40 מיקרון עשה עם רשת ניילון. ואז, למלא נפרד 1000 מיליליטר מקור עם 200 מיליליטר של אקונומיקה, ולמקם אותו במכסה המנוע של תרבות הרקמה. להשליך את פתרון SDS דרך מסננת התא, לתוך התוך התוך המקוה המכיל אקונומיקה.

צינור החוצה כל פתרון SDS הנותרים, עד רקמה decellularized ואת מסננת התא להישאר בפקק. השאירו את מסננת התאים בפקק, והוסיפו 500 מיליליטר של תוסף SDS טרי. מכסים את המזימה באותו רדיד אלומיניום, וממקם על צלחת ערבוב באותה מהירות כמו קודם.

לאחר דקלולריזציה וכביסה, להעביר את הרקמה decellularized, המכונה ECM כליות מנקודה זו על, לתוך צינור חרוט עצמאי 30 מיליליטר. ולמלא אותו במים ברמה של תאים, עד שכל הרקמה תצוץ. ראשית, להשתמש homogenizer רקמות כדי הומוגניזציה של ECM הכליה בצינור חרוט במשך שתי דקות, עד פתרון אטום ללא חתיכות גלוי של ECM מתקבל.

לאחר מכן, להטביע את הצינור חרוט המכיל את הכליה ECM בחנקן נוזלי עד רותחים המקיפים את הצינור כבר לא נמשך. אחסן את הכליה ECM במינוס ארבע מעלות צלזיוס לילה. כדי lyophilize את הרקמה decellularized קפוא, מעט לשחרר את מכסה צינור חרוטי כדי לאפשר החלפת גז, ולנחות את הצינור לתוך מכונת ליופיליזציה.

ליופיליזציה של הכליה ECM למשך שלושה ימים, או עד שהיא דומה לאבקה לבנה דקה. כדי לעכל כימית ולבודד את הג'ל, יש להוסיף פפסין קיבה חזירי משוקלל בקפידה, ו-0.01 חומצה הידרוכלורית רגילה לתיעוב נצנוץ המכיל בר ערבוב. מערבבים בערך 500 סל"ד, עד שכל הפפסין מתמוסס.

לאחר מכן, להעביר את הכליה lyophilized ECM כדי scintillation נתעב ולהשאיר את הפתרון על צלחת מערבבים בערך 500 סל"ד במשך שלושה ימים כדי להפוך את הכליה ECM הידרוג'ל. במכסה המנוע של תרבות הרקמה, צינור את הכרכים הנדרשים של מדיה תרבות התא, אחד נורמלי נתרן הידרוקסיד ו M199 תוספת, לתוך צינור חרוט סטרילי 30 מיליליטר עצמאית. מערבבים את פתרון הריג'נט המנטרל עם מרית מיקרו.

השתמש מזרק סטרילי אחד מיליליטר כדי להעביר את הנפח המתאים של הידרוג'ל ECM כליות מלאי לפתרון reagent נטרול. השתמש מרית מיקרו בעדינות לערבב את הפתרון עד הומוגני בצבע, פתרון הידרוג'ל מתקבל. הימנע החדרת בועות אוויר על ידי ערבוב לאט ובעדינות.

כדי לשלב תאים לתוך הידרוג'ל ECM הכליה, resuspend 300,000 תאים ב 10 microliters של מדיום עבור כל הידרוג'ל. Pipet 10 microliters של השעיית תא לתוך ג'ל ECM הכליה הסופי. מערבבים את הפתרון עם מרית מיקרו עד התאים מופצים באופן שווה.

השתמש מזרק מיליליטר אחד כדי למלא את המכשיר הרצוי לתרבות התא עם הידרוג'ל ECM הכליה. אפשר את הג'ל להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת לפני העברת או ציפוי התאים על ECM הכליה במכשיר תרבות התא. ניתוח של רקמת קליפת המוח decellularized על ידי ספקטרומטריית מסה, חשף את נוכחותם של חלבונים הקשורים ללמינה בזיליקום, עם קולגן-IV ו קולגן-אני להיות מיוצג ביותר.

שרשראות קולגן-4, A1 ו-A2, בכל מקום בכל קרום המרתף, היו שמורות. כמו כן אותרו שרשראות קולגן-4, A3 ו-A5, הקיימות רק בממברנות מרתף של הגלומרולוס. צורות iso נפוצות של למינינים וקולאגן-אני זוהו גם.

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של כליות אנושיים, או HKMECs, מתורבתים על קולגן-I, ECM של הכליות וג'ל תערובת 1:1, הראו הבדלים בפנוטיפ. HKMECs בתרבות על קולגן-I, הצג ביטוי CD31 אחיד, לראות באדום. בעוד HKMECs מתורבתים על שני ג'לים המכילים ECM כליות, הציג ביטוי CD31 מופחת בהפצות אחידות.

נראה כי סוג מטריצה לא השפיע על ביטוי VWF, המוצג בירוק. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור הומוגניזציה מלאה של רקמת קליפת המוח של הכליה decellularized. יתר על כן, כאשר מערבבים את הג'ל עם נטרול reagents, למנוע את כניסתה של בועות אוויר.

מערכות מיקרו פיזיולוגיות מאפשרות לחקור את תפקוד האיברים בסביבה מעבדתית מבוקרת. יצירת מערכות כאלה דורשת הטמעה של תאים, מטריצות וגירויים. הידרוג'ל kECM מפוברק כאן, יאפשר לנו ללמוד מערכות כאלה כי לסכם את סביבות מיקרו הכליות.