זיהוי ובידוד של מוות לגופים טוהר גבוהה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לזהות ולבודד גופים אפופטוטיים לטוהר גבוה. גופים אפופטוטיים הם סוג של שלפוחיות חוץ-תאיות הנוצרות כדי לסייע באינדוקציה של המטוזיס. הם הסוג הגדול ביותר של משפחה פיזיקלית חוץ-תאית הנעה בדרך כלל בקוטר של 1 עד 5 מיקרומטר.

כעת מתברר שגופים אפופטוטיים יכולים לסייע לתהליכים תאיים, כגון פינוי תאים אפופטוטיים ותקשורת תוך-תאית. לכן, פיתוח מתודולוגיה מדויקת לזיהוי, כימות ובידוד גופים אפופטוטיים הוא קריטי להתאמה אישית של הפונקציות והמנגנונים שלהם. בסדרת ההכנות הזו אנו הולכים להראות לכם כיצד לזהות ולכמת ולבודד גופים אפופטוטיים מדגימות אפופטוטיות.

חלק א', השראת אפופטוזיס. כדי לגרום לאפופטוזיס בשורות תאים, כגון מונוציטים THB1, התחל תחילה באיסוף התאים. ספור תאים ואסוף כ -10 מיליון תאים או לפי הצורך.

אנו ממליצים על 10 מיליון לניתוח גופים אפופטוטיים. הקצה שני מיליון תאים לבאר של צלחת שש בארות. הסר את המכסה מששת צלחת הבאר ותאי ה-UV באמצעות UV Stratalinker 1800.

מקרין תאים בגודל 150 מילי-ג'ול לסנטימטר מרובע. הקרנה זו אמורה להימשך כ-30 עד 60 שניות. לאחר השלמת ההקרנה, דגרו על תאים למשך שעתיים עד שמונה שעות, תלוי בקו התאים.

בשלב זה, תאים צריכים להפגין מורפולוגיות אפופטוטיות, כגון בלמינג אפופטוטי והיווצרות גוף אפופטוטית. אוספים תאים אפופטוטיים בעזרת פיפטה P1000. אסוף כ-1/10 מהדגימה האפופטוטית עבור כל בקרת הדגימה האפופטוטית.

אסוף גם דגימה לא מטופלת או בת קיימא. צנטריפוגה הן את כל הדגימה האפופטוטית והן את הדגימה הלא מטופלת ב-3,000 גרם למשך שש דקות. השעו מחדש ב-PBS והניחו בצד על קרח.

לבידוד גוף אפופטוטי, המשך לשלב B או C.B, בידוד גוף אפופטוטי באמצעות FACS. צנטריפוגה את הדגימה האפופטוטית הנותרת במשקל של 3,000 גרם למשך שש דקות. הסר את הסופרנטנט מהדגימה האפופטוטית שנותרה.

השעו מחדש את הדגימה האפופטוטית הנותרת בתמיסת צביעה המכילה את הנקסום 550 והטופו שלוש לצביעה למשך 10 דקות, בטמפרטורת החדר, בחושך. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש במאגר FACS ולאחר מכן סננו דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי להבטיח שהתאים מופרדים ביעילות. בצע הגדרה סטנדרטית של מכשיר ה-FACS.

רכוש את כל הדגימה האפופטוטית ושנה את הגדרות המתח כדי להבטיח שכל האירועים נמצאים בתוך הבוטים של FACS וניתן להפריד בקלות אוכלוסיות. הגדר את אסטרטגיית השער כמתואר בסעיף אסטרטגיית שער ציטומטריית זרימה מאוחר יותר. בחר אוכלוסיית גוף אפופטוטית מגודרת ואת המספר הרצוי של גופים אפופטוטיים לאיסוף.

בצע מיון ראשוני כדי לאשר את הגדרות המיון וטוהר הגוף האפופטוטי . לאחר ביצוע מיון, בצע שטיפה שחורה של המערכת ונתח מחדש את הדגימה הממוינת. אם מושגת טוהר גבוה, המשך למיין את המספר הרצוי של גופים אפופטוטיים.

לאחר השלמת המיון, קח חלק קטן מדגימת הגוף האפופטוטית של המיון המקצועי ונתח מחדש כדי לאשר את הטוהר. חלק ג', בידוד גוף אפופטוטי באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. צנטריפוגה את הדגימה האפופטוטית הנותרת ב-300 גרם למשך 10 דקות.

שלב צנטריפוגה זה יפריד בין תאים, כולל תאים אפופטוטיים, תאים ברי קיימא ותאים נמקיים משלפוחיות חוץ-תאיות קטנות, שיישארו בסופרנטנט. בצינור בז חדש, אספו את הסופרנטנט המכיל את השלפוחיות החוץ-תאיות. השעו מחדש את הפלג המועשר באפופטוטיקה ב-PBS והניחו בצד על הקרח עם דגימות האפופטוטיות השלמות והלא מטופלות.

צנטריפוגה הסופרנטנט שנאסף המכיל את הגופים האפופטוטיים במשקל של 3,000 גרם למשך 20 דקות. הסר את הסופרנטנט המכיל את השלפוחיות הקטנות יותר, החוץ-תאיות, והיזהר לא לשבש את הכדור שיכיל את הגופים האפופטוטיים. השעו מחדש את הגופים האפופטוטיים ב-PBS ואספו 100 מיקרוליטר מכל דגימה אפופטוטית שלמה שלא טופלה, התאים האפופטוטיים מועשרים, והגופים האפופטוטיים מועשרים בדגימה ובכתמים בתמיסת הצביעה של נקסום חמש וטופו שלוש.

עמדו בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני ביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה. נתח כמתואר באסטרטגיית השער המפורטת. חלק ד', אסטרטגיית שער ציטומטריית זרימה.

כדי להתחיל בניתוח ציטומטריית זרימה, הפרד את הטופו שלושה תאים נמקיים גבוהים מכל שאר האירועים על ידי השוואת טופו שלוש וארבע יחד. מאירועי אי החדירה, בצע את השער הבא. בחר את אירועי אי-החדירה והשווה פסוק פיזור צדדי לפסוק חמש.

בחר שתי אוכלוסיות, כולל פיזור צד ביניים בגבוה, נקסום חמישה תאים נמוכים עד בינוניים. אוכלוסייה זו היא P1. צור גם אוכלוסייה שנייה כולל כל שאר האירועים. אוכלוסייה זו היא P2. P1 יכיל תאים ברי קיימא ותאים אפופטוטיים מוקדמים.

P2 יכיל את כל האירועים האפופטוטיים והפסולת. בחר P2 לשער נוסף. מ-P2, הסר את כל הפסולת על ידי השוואת טופו שלוש פסוק לנקסום חמש.

בחר את כל חמשת אירועי הביניים והגבוהים. אוכלוסייה זו תכלול כעת את כל הגופים האפופטוטיים והתאים האפופטוטיים. בחר אוכלוסייה זו.

כדי להפריד בין גופים אפופטוטיים לתאים אפופטוטיים, השווה פיזור מלא לנקסום חמש. לבחירת גופים אפופטוטיים, בחר פיזור מלא נמוך. כדי לבחור תאים אפופטוטיים, בחר פיזור מלא אירועי ביניים עד גבוהים.

בעת ביצוע בידוד גוף אפופטוטי על ידי FACS, אנו ממליצים לבצע אסטרטגיית שער סופית אחת על ידי בחירת שבר הגוף האפופטוטי וצפייה בו לפי טופו שלוש, פסוק חמש. בחר את כל האירועים. זה משמש לבחירת אסטרטגיית השער המבוססת על תפרחת ולא על פיזור מלא ומאפייני פיזור צדדי כדי להגביר את הדיוק למיון.

כדי לזהות תאים ברי קיימא, חזור לאוכלוסיית P1. לניתוח תאים כללי בר-קיימא, בחר P1 והשווה את הפיזור המלא לנקסום חמש. בחירת כל תאי הביניים עד הגבוהים של פיזור מלא.

זה יכלול את כל התאים הקיימאים, ויסיר את כל הפסולת שנותרה. לחלופין, לניתוח אפופטוזיס מעמיק יותר, ניתן להפריד בין תאים אפופטוטיים ברי קיימא ומוקדמים. לשם כך, השווה פיזור מלא של שלושה פסוקים.

תאים ברי קיימא יהיו טופו שלושה נמוכים, פיזור מלא בינוני עד גבוה. תאים אפופטוטיים מוקדמים מכילים צביעת טופו שלוש ביניים. לאחר מכן ניתן ליישם את כל אסטרטגיית השער הזו על כל הדגימות המנותחות.

לדוגמה, עבור הגופים האפופטוטיים שבודדו לאחר FACS. החל את אסטרטגיית השער על כל הדגימות. לאחר מכן ניתן להכין טוהר גוף אפופטוטי.

לדוגמה, על ידי בחירת חמש האוכלוסיות החיוביות בלבד, השוואה בין פיזור מלא לבין נקסום חמש. לכן זה מדגים את הגופים האפופטוטיים לאחר הבידוד. תוצאות מייצגות.

ניתוח ציטומטריית זרימה בוצע כדי לאשר את השראת האפופטוזיס. אסטרטגיית שער זו מאפשרת זיהוי של תאים ברי קיימא, תאים אפופטוטיים מוקדמים, תאים אפופטוטיים מאוחרים ותאים נמקיים בדגימה המוקרנת ב-UV. מתודולוגיה זו הדגימה את בידודם של גופים אפופטוטיים בשתי גישות.

ראשית, גישה מבוססת FACS, שבה גופים אפופטוטיים הועשרו לטוהר של 99% וגישת צנטריפוגה דיפרנציאלית שבה גופים אפופטוטיים בודדו לטוהר של 97%. זה אושר על ידי זרימה ציטומטרית שבה גופים אפופטוטיים הופרדו על ידי תאים, כולל תאים ברי קיימא, תאים אפופטוטיים ונמקים. מסקנה. הגישה שלנו עשויה לספק כלי חדש לאפופטוזיס ולמחקר גוף אפופטוטי.

לכן תורמים להתקדמותם בהתאמה אישית של מנגנונים אלה ולסייע ביצירת פיתוחים חדשים בהתמקדות בתהליכים אלה.