בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים שונים של מחקר מחלות מטבוליות על שינויים מולקולריים של אנרגיה כבד וביוסינתזה של חלבון בהשמנת יתר, כבד שומני לא אלכוהולי וסוכרת מסוג 2. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מקלה על הבידוד של hepatocytes עכבר ראשוני פונקציונלי וזיהוי חלבונים בהיפטי המתהווה באמצעות מצע תיוג לא רדיואקטיבי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו שלב חליטה קשה ללמוד בגלל כלי הדם עכבר קטן ודק.

עבור זיוף בכבד, בזהירות להכניס קטטר מד 24 לתוך Vena Cava נחות או IVC רק על bifurcation עם וריד הכליה הנכון. הסר את מחט הקטטר שמירה על המיקום של הצינורית בתוך IVC ולחבר צינור 24 מד עם צינור זיוף באמצעות המחבר. התחל לתפארת הכבד עם HBSS חם מינוס בקצב זרימה קבוע ארבעה מיליליטר במהירות חיתוך וריד הטחול כדי לנקז את הדם הפנימי.

לאחר 10 דקות, לבלבל את הכבד העכבר עם 35 מיליליטר של HBSS בתוספת עם קולגנס סוג X בקצב זרימה של ארבעה מיליליטר לדקה, הידוק וריד הטחול במשך כ 10 שניות כל כמה דקות כדי להקל על הפצה של perfusate ברחבי הכבד. כאשר כל הקולגנס כבר חדור, להעביר את הכבד על רקמת מעבדה לפני עצירת המשאבה, כדי למנוע זרימת דם בחזרה לתוך הכבד. השתמש מדפים כדי להסיר את כיס המרה בעדינות לנגב את הכבד עם רקמת מעבדה טרייה כדי להסיר כל דם.

מניחים את הכבד בצלחת פטרי 100 מילימטר המכיל חמישה מיליליטר של HBSS חם טרי בתוספת קולגן ולהשתמש מטלטולים תועים כדי להסיר בעדינות את כמוסת הכבד. השתמש במלקחיים כדי לפזר בזהירות את הרקמה הפרנצ'ימלית ולהוסיף 15 מיליליטר DMEM קר לצלחת פטרי. לנער את הכבד הקרוע בעדינות כדי לשחרר את התאים parenchymal שיורית לתוך המדיום ולהוסיף עוד 15 מיליליטר של DMEM קר לצלחת לרכוש את שאר התאים.

ואז לסנן את תרחיף הרקמה דרך מסננת תא 100 מיקרון לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. כדי לבודד את hepatocytes העכבר הראשי, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של DMEM טרי. בזהירות שכבת התאים מעל מאגר הדרגתי 40%density עבור הפרדת הדרגתי צפיפות, השלכת התאים מהשכבות העליונות והאמצעיות לאחר צנטריפוגה.

תן מחדש את גלולת ההפטוציט הפרנצ'ימלית העיקרית עם שניים עד שלושה מיליליטר של ה-E הבינוני של וויליאם כדי להימנע מאיסוף תאים מתים מקיר הצינור ולהעביר את התאים לצינור חדש של 50 מיליליטר. מערבבים את התאים עם שבעה עד שמונה מיליליטר נוספים של מדיום E של ויליאם לפני צנטריפוגה מחדש את גלולה ב 10, 20, או 30 מיליליטר של טרי ויליאם בינוני E בהתאם לגודל של גלולה. לאחר הספירה, זרע שש פעמים 10 לתאים החמישיים לכל באר של צלחת שש באר עבור דגירה של שעתיים עד שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, החלף את המדיום ב- DMEM בתוספת 10% סרום בובין עוברי ואנטי אנטי כדי להסיר את התאים המתים והבלתי מחוברים ולהחזיר את התאים לאנקובטור בן לילה. לתיוג חלבונים המתהווה שעבר שינוי אזיד, הוסיפו 20 עד 40 מיקרוגרם של ליסנט תאים ל-50 מיקרוליטר של מאגר תגובה 2X. הביאו את הנפח ל-80 מיקרוליטר עם מים מזוקקים ומערבולת את תווי החלבון למשך חמש שניות.

הוסף חמישה מיקרוליטרים של נחושת סולפט לתאים למערבולת נוספת של חמש שניות, ואחריו חמישה מיקרוליטרים של תוסף חיץ תגובה אחד עם חמש שניות של מערבולת. לאחר דגירה של שלוש דקות, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תוסף מאגר תגובה משוחזר שניים לתאים למערבולת נוספת של חמש שניות וסובבו את המדגם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס במכונה מרובת מסובבים המוגנת מפני אור. בסוף הסיבוב, להוסיף 300 microliters של מתנול לליסט, ואחריו 75 microliters של כלורופורם, ו 200 microliters של מים מזוקקים כפולים.

לאסוף את החלבון שכותרתו על ידי צנטריפוגה ולהוסיף 250 microliters של מתנול טרי גלולה. לאחר מערבולת, צנטריפוגה lysate שוב לכסות את גלולה חשופה עם רקמה ללא מוך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לניתוח PAGE, מנומשים את גלולה מיובשת ב 20 microliters של חיץ טעינה ללא בטא-mercaptoethanol ומערבולת גלולה במשך 10 דקות.

לאחר מכן, מחממים את החלבון בבלוק חום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומטענים את הדגימה על ג'ל דודסיל סולפט 10% לגילוי טתרמתיל-רודאמין. לאחר מכן השתמשו בסורק לייזר במצב משתנה לכמות המדויק של החלבונים המתהווים המסווים ב-AHA. מבחינה היסטולוגית, hepatocytes ראשי חי ומצורף מופיעים בדרך כלל מצולע או משושה בצורת עם גבול קרום קווי המתאר בבירור לאחר 24 שעות של תרבות.

כדי לאשר אם התאים המבודדים הם hepatocytes העיקרי, בניסוי זה, רמות ביטוי חלבון אלבומין הושוו פיברובלסטים עוברי עכבר, קו תא hepatoma העכבר, hepatocytes העכבר הראשי מבודד, וכבדי עכבר. ביטוי חלבון אלבומין זוהה hepatocytes העכבר הראשי וכבדי עכבר, אבל לא היה ניתן לזהות לא פיברובלסטים עובריים עכבר או תאי קו התא hepatoma. טיפול hepatocyte העיקרי עם 10 micromolar רוטנונה במשך ארבע עד שש שעות חשף אינדוקציה חזקה של קינאז חלבון המופעל על ידי AMP בהיפוכיה כפי שזוהה על ידי רמות זרחון מוגברות על חלבון מופעל על ידי AMP בהיפוכיה T172 דומה לאלה שנצפו vivo.

ואכן, חמש שעות של טיפול רוטנונה micromolar 10 היו השפעות מעכבות עמוקות על סינתזת החלבון המתהווה ב hepatocytes העיקרי מטופלים לעומת תאי בקרה מטופלים כפי שהוכח על ידי מוצג תגובת קשירה כימוסאלקטיבית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין מראש את כל הריג'ים והממדיום הנדרשים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור החוקר בתחום הפתופיזיולוגיה המטבולית בהפטית לחקור את המנגנון המולקולרי של ויסות חלבון אנרגיה בהשמנת יתר וסוכרת מסוג 2 בהפטוציטים עכבר ראשוני מבודד.