Name: ייצור של אניסוטרופי אנטיגן מלאכותי פולימריים הצגת תאי CD8 + T Cell ההפעלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: למדו לייצר תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים אניסוטרופיים מפולימרים ביודגרדביליים להפעלת תאי T CD8+. שיטה זו מאפשרת שליטה עצמאית בגודל ובצורת החלקיקים ליישומים בתחום האימונותרפיה נגד סרטן ומחלות נוספות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EBA (DGE-1746891), KRR (DGE-1232825) תודה התוכנית NSF מלגת מחקר לתארים מתקדמים לקבלת תמיכה. רם תודה את נבחרת מחקר שירות פרס NIH NCI F31 (F31CA214147), הגמול הישג עבור מכללת אחווה מדענים לקבלת תמיכה. המחברים תודה NIH (R01EB016721 ו- R01CA195503), מחקר כדי למנוע עיוורון ג'יימס ופרס קרול חינם זרז, ו מכון בלומברג-קימל JHU על חיסוני סרטן לקבלת תמיכה.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת ג'ונס הופקינס.
1. ייצור של כדוריות PLGA חלקיקים בגודל Tunable
<ol><li>הכנה של חומרים עבור חלקיקים סינתזה<ol>
<li>להכין תמיסת כוהל פוליוויניל w/w (PVA) 5%.<ol>
<li>להוסיף 500 מ"ל מים (DI) יונים הבקבוק Erlenmeyer עם פס מגנטי מערבבים ומניחים על פלטה קדירות בטמפרטורת 500 סל ד וצג עם מד חום. מכסים את הבקבוק עם נייר כסף כדי למנוע התאיידות.</li>
			<li>כאשר טמפרטורת המים מגיע כ 70 מעלות צלזיוס, להוסיף 25 גרם סך-PVA בקבוצות קטנות לאורך זמן, מחכה PVA להתמוסס לפני הוספת יותר.</li>
			<li>ברגע PVA כל התפרקה (בדרך כלל 30-60 דקות), לתת פתרון סינון מגניב וסטרילי. לאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין סרט פתרון הליהוק של 10% w/w PVA גליצרול w/w 2%.<ol>
<li>להוסיף 500 מ"ל מים DI הבקבוק Erlenmeyer עם פס מגנטי מערבבים. הוסף 8 מ של גליצרול בטמפרטורת החדר, מיקס על ידי trituration.</li>
			<li>מניחים את הבקבוק על פלטה קדירות בטמפרטורת 500 סל ד וצג עם מד חום. מכסים את הבקבוק עם נייר כסף כדי למנוע התאיידות.</li>
			<li>פתרון הטמפרטורה מגיעה כ 70 מעלות צלזיוס, להוסיף 50 גר' סך-PVA בקבוצות קטנות לאורך זמן, מחכה PVA להתמוסס לפני הוספת יותר.</li>
			<li>לאחר כל PVA התפרקה (בדרך כלל 60 דקות), לתת פתרון סטרילי וקריר מסנן באמצעות מערכת מסנן ואקום בקבוק-העליון עם גודל הנקבוביות של 0.22 μm. לאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין פתרון PVA 50 מ ל w/w 1%. להוסיף 40 מ"ל של מים DI ו- 10 מ"ל של 5% PVA פתרון (בוצעו ב 1.1.1) גביע 100-150 מ.</li>
		<li>להכין פתרון PVA w/w 0.5% 100 מ. להוסיף 90 מ של מים DI ו- 10 מ"ל של 5% PVA פתרון גביע 150-250 מ.</li>
		<li>להוסיף פס מגנטי מערבבים הפתרון PVA 0.5% והמקום בשכונה כימי על צלחת מערבבים בטמפרטורת החדר 500 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סינתזה Microparticle<ol>
<li>שוקלים לצאת 100 מ ג של פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PLGA) לתוך המבחנה נצנוץ התמוססות ב 5 מ של דיכלורומתאן (DCM). מערבולת כדי להמיס את PLGA.</li>
		<li>המקום מהמגן בפתרון PVA 1% 50 מ ל, כך מהמגן הוא קרוב לתחתית כשהספל ככל האפשר מבלי לגעת בו. הפעל מהמגן ולהתאים את המהירות הרצויה — 3,200 סל ד עבור 5 μm קוטר חלקיקים, 5,000 סל ד עבור μm 3, במהירות של 15,000 סל ד עבור μm 1 (הגדלת גודל החלקיקים של ירידות מהירות המגון). פעם אחת על המהירות הרצויה, להוסיף את הפתרון PLGA הספל, homogenize במשך דקה אחת.</li>
		<li>לאחר המגון, יוצקים 1% PVA, PLGA microparticle פתרון בתוך 0.5% 100 מ ל תמיסת PVA על צלחת מערבבים ומערבבים במשך לפחות 4 שעות אידוי הממס בשכונה כימי.</li>
		<li>לשטוף את החלקיקים 3 פעמים במים DI.<ol>
<li>שופכים את הפתרון של חלקיקים לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 x g למשך 5 דקות. שופכים תגובת שיקוע והוסף כ 20 מ ל מים DI.</li>
			<li>Resuspend חלקיקים על-ידי vortexing. ברגע resuspended, למלא צינורות חרוט 50 מ ל מים DI.</li>
			<li>לשטוף שוב באותה הדרך עוד פעמיים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>ננו-חלקיק סינתזה<ol>
<li>שוקלים לצאת 200 מ ג של PLGA לתוך בקבוקון נצנוץ, להמיס 5 מיליליטר DCM. מערבולת כדי להמיס את PLGA.</li>
		<li>המקום גביע עם 50 מ ל 1% פתרון PVA לתוך מיכל מלא קרח. מניחים את המכשיר sonicator במיכל קרוב לתחתית ככל האפשר מבלי לגעת. להתחיל sonication ולהוסיף מיד PLGA פתרון לתוך הספל. Sonicate עם כוח של 12 W 2 דקות ליצור חלקיקים עם הקוטר המשוער של 200 ננומטר.</li>
		<li>לאחר sonication, יוצקים 1% PVA, PLGA פתרון nanoparticle לתוך פתרון PVA 0.5% 100 מ ב מערבבים בצלחת ומערבבים במשך לפחות 4 שעות אידוי הממס בשכונה כימי.</li>
		<li>שופכים את הפתרון של חלקיקים לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 g x 5 דקות להסיר את microparticles. להסיר את תגובת שיקוע ויוצקים לתוך צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה.</li>
		<li>לשטוף את החלקיקים 3 פעמים עם מים DI. צנטריפוגה ב 40,000 x g במשך 15 דקות. שופכים תגובת שיקוע, resuspend במים DI על-ידי vortexing. לשטוף שוב באותה הדרך עוד פעמיים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ייצור של חלקיקים פולימרים של צורה Tunable
<ol><li>לאחר נטילת PLGA חלקיקים שלוש פעמים, resuspend החלקיקים בכ-1 מ ל מים DI. להוסיף את הפתרון ליהוק הסרט חלקיקים לריכוז החלקיקים הסופי של חלקיקים 2.5 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>Pipette התליה של חלקיקים ב 10 מ"ל aliquots 75 x 50 מ מ מלבני פטרי למתיחת חד-ממדי או aliquots 15 mL 100 100x מ מ מרובע פטרי למתיחת דו-ממדית. להסיר בועות על ידי או פיפטה, או בועות לדחוף הצידה ולתת סרטים לילה יבש בשכונה כימי.</li>
	<li>פעם סרטים התייבשו, להוריד סרטים ממנות פלסטיק עם פינצטה, לחתוך את הקצוות של סרטים עם מספריים. שמור קצוות צינור חרוטי 50 מ ל כדי לשמש חלקיקי כדורית.<ol>
<li>לטעון סרט על גבי הסרט דק אוטומטיות מתיחה התקן על-ידי טעינת סרט על גבי אלומיניום. עבור 1 י מתיחה, הר הסרט על גבי אלומיניום בלוקים של ציר אחד של האלונקה (איור 2) על ידי הצבת שני הקצוות קצר של הסרט בין שני חלקי גומי נאופרן. באמצעות ברגים, בורג אוחז מתכת על גבי גומי כדי להחזיק את הסרט במקום. עבור מתיחה 2D, הר לכל ארבעה קצוות על גבי ארבעה רחובות אלומיניום למתוח על שני הצירים (איור 2).</li>
		<li>למדוד ולהקליט את אורך הסרט בין אלומיניום בלוקים על ציר אחד למתיחת 1 D או שני הצירים למתיחת 2D. לחשב את המרחק נדרש למתוח את הסרט באחד או בשני כיוונים בהתבסס על הרצוי קיפול-מתיחה.</li>
		<li>למקם את המכשיר מתיחה הסרט נטען בתנור ב 90 מעלות צלזיוס ולהביא את הסרט טמפרטורה מעל 10 דקות. מניחים גביע גדול בתנור עם כמות קטנה של מים.</li>
		<li>הסרט למתוח.</li>
		<li>כאשר מתיחה הושלם, להסיר את ההתקן מתיחה מהתנור ומצננים את הסרט לטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
		<li>עבור 1 י מתיחה, חותכים את הסרט שליפת מתיחה בקצוות. עבור מתיחה 2D, חתך למרכז ריבוע של הסרט בצורה אחידה נמתחת ושמור על שני הצירים. במקום סרטים צינורות חרוט עם סרטים 2 למחזור ולהשליך את השאר של הסרט.</li>
		<li>להוסיף כ- 25 מ ל מים DI כל צינור חרוטי ו מערבולת עד הסרטים הם התפרקה.</li>
		<li>ברגע הסרטים הם חלקיקי המומס, תשטוף 3 פעמים עם מים DI.<ol>
<li>עבור microparticles, למלא את צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 x g למשך 5 דקות, שופכים תגובת שיקוע, להוסיף כ 20 מ של מים DI ו מערבולת כדי resuspend חלקיקים.</li>
			<li>עבור חלקיקים, העברת חלקיקים מהירות גבוהה צנטריפוגה צינורות, צנטריפוגה ב g 40,000 x ל-15 דקות שופכים תגובת שיקוע, להוסיף כ 20 מ של מים DI ו מערבולת כדי resuspend חלקיקים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאחר לשטוף את השלישי, resuspend חלקיקים בכ-1 מ ל מים DI. להקליט את המשקל של הצינורית microcentrifuge ולהוסיף חלקיקים ברכבת התחתית. להקפיא חלקיקים במקפיא-80 מעלות צלזיוס במשך שעה או להקפיא פלאש בחנקן נוזלי. ברגע קפוא, lyophilize חלקיקים בן לילה.</li>
		<li>לאחר lyophilized, שוקל חלקיקים בצינור microcentrifuge ואת הפחת משקל מוקלטות של הצינור ריק כדי לקבוע את המשקל של חלקיקים lyophilized.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדם ההטיה כדי ליצור מלאכותי אנטיגן הצגת תאים
<ol><li>להכין 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) מאגר. להפוך את פתרון 0.1 M של MES במים ולהתאים את ה-pH עד 6.0 באמצעות טיטור עם 1 מ' הידרוקסיד הנתרן (NaOH).</li>
	<li>Resuspend lyophilized PLGA/PBAE מיקרו/חלקיקים ב 20 μg/mL במאגר MES על-ידי vortexing. למלא את צינור פוליפרופילן microcentrifuge μL 900 MES המאגר ולהוסיף μL 100 של הפתרון של חלקיקים ברכבת התחתית.</li>
	<li>להכין פתרון EDC/NHS. להמיס carbodiimide 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) 40 מ"ג (EDC) ו- 48 מ"ג N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) במאגר MES 1 מ"ל.</li>
	<li>להוסיף 100 μL EDC/NHS פתרון החלקיקים ואת מערבולת לערבב.</li>
	<li>דגירה הצינור על מהפך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
	<li>ספין למטה microparticles ב 5,000 x g עבור 5 דקות או חלקיקים ב 17,000 x g למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל PBS על-ידי vortexing (microparticles) או sonicating ב 2-3 W במשך 5 שניות (חלקיקים).</li>
	<li>עבור microparticles, להוסיף 8 μg של החלבון הרצויה אות 1, ועכבר 10 μg אנטי-CD28 (שיבוט 37.51) החלקיקים. חלקיקים, להוסיף 16 μg אות 1 ו- 20 μg אנטי עכבר CD28. הוסף PBS להביא את עוצמת הקול בצינור 1.1 מ.</li>
	<li>דגירה הצינור על מהפך ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת, לשטוף את החלקיקים. ספין למטה microparticles ב 5,000 x g עבור 5 דקות או חלקיקים ב 17,000 x g למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend חלקיקים ב 1 מ"ל של PBS סטרילי על-ידי vortexing (microparticles) או sonication ב 2-3 W במשך 5 שניות (חלקיקים). חזור על פעמיים.</li>
	<li>Resuspend החלקיקים על הריכוז הרצויה ביותר במדיום תרבות לשימוש מיידי. לאחסון לטווח ארוך, resuspend חלקיקים-10 מ"ג/מ"ל תמיסת סוכרוז 100 מ מ. להקפיא, lyophilize ואחסן את החלקיקים ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. אפיון והערכת aAPC
<ol><li>אפיון aAPC גודל וצורה (איור 3)<ol>
<li>לאפיין בצורה ובגודל microparticle על ידי חלקיקים הדמיה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM). עבור SEM הדמיה, התפשטות חלקיקים lyophilized על גבי קלטת פחמן דבקה אלומיניום להוסיף, להתיז בחוטי זהב-פלדיום.</li>
		<li>לנתח את הגודל ויחס גובה-רוחב של חלקיקים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.</li>
		<li>כדי לקבוע את גודל החלקיקים, להגדיר באמצעות סרגל קנה מידה ומדידת קוטר של חלקיקים. חזור על-100 חלקיקי לקבוע את הקוטר החלקיקים הממוצע ולהפיק היסטוגרמה של גודל החלקיקים.</li>
		<li>כדי לקבוע יחס גובה-רוחב, למדוד את המרחק על פני ציר זמן, הציר הקצר של חלקיקים ולחלק ציר זמן קצר הציר. חזור על-50 חלקיקים של כל צורה כדי לקבוע יחס הגובה-רוחב החלקיקים הממוצע עבור כל צורה ולהפיק היסטוגרמות.</li>
		<li>לאפיין בצורה ובגודל ננו-חלקיק על ידי הדמיה חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הילוכים (TEM). לנתח את הגודל ויחס גובה-רוחב של חלקיקים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כפי שמתואר 5.1.2. לחלופין, למדוד גודל כדורית nanoparticle באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS) או nanoparticle מעקב ניתוח (נ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>יעילות ההטיה חלבון<ol>
<li>להכין aAPC על פי שיטות 1-3, אבל ב- 3.7 צעד להשתמש fluorescently שכותרתו אות 1 חלבון ו- CD28 אנטי עכבר. לאחר ההטיה, כביסה, resuspend את aAPC ב 1 מ"ל PBS עבור ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל aAPC.</li>
		<li>הכנת סטנדרטים חלבון microplate 96-ובכן פוליסטירן שחור. להוסיף 5 μg של האות fluorescently שכותרתו 1 חלבון PBS בהבאר הראשונה של הצלחת ולעשות 10 דילולים 1:2 ב- PBS לרוחב השורה של הצלחת. להשאיר ריק טוב אתמול. חזור על שלב זה כדי ליצור קבוצה נוספת של סטנדרטים עם אנטי fluorescently שכותרתו-CD28.</li>
		<li>פיפטה μL 100 של הפתרון aAPC לתוך בארות שכפל microplate פוליסטירן שחור דולר.</li>
		<li>קרא את זריחה על קורא צלחת פלורסצנטיות באורכי המתאים. להשתמש את קריאות קרינה פלואורסצנטית מכל הסטנדרטים חלבון כדי ליצור עקומות סטנדרטי עבור כל נוגדן פלורסנט. באמצעות עקומת סטנדרטי, לחשב את ריכוזי אות 1 אנטי-CD28 היטב כל דגימה, ואז לחשב את כמות הדם ויעילות ההטיה (איור 4A, 5A איור).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הערכה של aAPC לגירוי במבחנה של CD8 + T תאים<ol>
<li>להכין המדיה ב' (בינוני RPMI בתוספת L גלוטמין, 10% FBS, פתרון חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1% נתרן פירובט, 1% פתרון MEM ויטמין, 92 μM β-mercaptoethanol, 10 ננוגרם למ"ל ציפרופלוקסאצין ו 30 U/mL il-2.</li>
		<li>אקריב עכבר שחור 6 בעזרת חשיפה פחמן דו-חמצני.</li>
		<li>הקציר הטחול מהעכבר לפי פרוטוקול שנקבעו קודם16. לאסוף את הטחול צינור חרוטי 50 מ עם 10 - 15 מ"ל PBS. באמצעות כבעלי, מועכים הטחול דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי 50 מ. במהלך רסוק, לשטוף את מסננת עם 40 מ"ל PBS.</li>
		<li>לסובב את splenocytes ב 300 x g למשך 5 דקות. יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend את splenocytes ב 4 מיליליטר Ack Lysing מאגר כדי lyse כדוריות דם אדומות. לאפשר את הצינור לשבת ללא הפרעה במשך דקה אחת, ולאחר מכן להוסיף PBS להביא את עוצמת הקול בצינור 20 מ.</li>
		<li>לסובב את התאים ב 300 x g למשך 5 דקות. יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל ל- PBS. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
		<li>לסובב את התאים ב 300 x g למשך 5 דקות, resuspend באמצעי האחסון הרצוי תא ההפרדה המאגר. בידוד תאי CD8 + T מן התליה תא בודד באמצעות CD8 + שלילי מבחר תא T בידוד ערכת, ע פ הפרוטוקול של היצרן.</li>
		<li>בעקבות הפרדה מגנטית, ספין תאי CD8 + T-g 300 x במשך חמש דקות ולהסיר את המאגר ההפרדה תא. Resuspend תאים 1 מ"ל של PBS ולספור את התאים. תווית תאים עם אסתר succinyl carboxyfluorescein (CFSE) על פי הפרוטוקול של היצרן.</li>
		<li>דגירה 8,333 CD8 + T תאים, 0.0833 mg (או במינון הרצוי) של aAPC בתקשורת ב' μL 150 היטב כל של 96 ובכן U-תרביות רקמה שטופלו הצלחת התחתונה.</li>
		<li>דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים. לאחר 3-4 ימים, רענן המדיום תרבות על-ידי הוספת 75 μL בינוני טריים מכל קידוח.</li>
		<li>לאחר 3 ימי דגירה, לנתח CFSE מתויג לתאים cytometer זרימה כדי להעריך את התפשטות. כל שיא על ההיסטוגרמה CFSE cytometry זרימה מייצג דור של תאים עקב דילול CFSE עם כל חלוקת התא רצופים.</li>
		<li>לאחר 7 ימים, להשתמש hemocytometer כדי לספור את מספר התאים היטב בכל. לפני ספירה, כתם תאים מתים עם פתרון Trypan Blue. אל תכלול תאים מתים ספירת הסופי. לנרמל את הריכוז הסופי תא לריכוז הראשונית כדי לחשב את הקיפול-הרחבת (איור 4 , איור 5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+efficient+cancer+immunotherapy%3A+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li>
<li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li>
<li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li>
<li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li>
<li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li>
<li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li>
<li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li>
<li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li>
<li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+immunogenicity%3A+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li>
<li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape+dependence+of+CD8%2B+T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li>
<li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li>
<li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape%3A+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li>
<li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li>
<li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00657391">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li>
<li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li>
<li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li>
<li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+protein-based%2C+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li>
<li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striped%2C+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li>
<li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2011/sc/c0sc00596g">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li>
<li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse%2C+shape-specific+nanobiomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li>
<li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מפרט שיטה רב-תכליתי לדור מדויק של חלקיקים פולימרים אנאיזוטרופי. הסרט דק מותח בטכניקה המתוארת כאן היא מדרגית, לשחזור וזולה מאוד. טכניקות חלופיות ליצירת חלקיקים אניסוטרופי סובלים מגבלות רבות, כולל עלות גבוהה, תפוקה נמוכה, גודל החלקיקים מוגבלת. הסרט דק מותח הגישה גם יתרון כי החלקיקים משתנים כדי להתאים אניסוטרופי לאחר הסינתזה, כתוצאה מכך, הוא תואם עם מגוון רחב של גודל החלקיקים וטכניקות סינתזה. איור 1 מפרט את ההתקנה של המכשיר מתיחה אוטומטית דו מימדי. מכשיר זה יכול לשמש גם ללא הרכיבים ...

תאים המציג אנטיגן מלאכותית (aAPC) הראו הבטחה כסוכני immunomodulatory כי הם יכולים ליצור תגובה חזקה תא T אנטיגן ספציפי. אתרי פלטפורמות אלו הן את היכולת שלהם ביעילות להציג אותות חיוני להפעלת תא T. Acellular aAPC הם חלופה אטרקטיבית מבוססת-תא aAPC כי הם קלים יותר ויקרות פחות לפברק בפני אתגרים פחות במהלך הסולם ותרגום, להקל על סיכונים הקשורים טיפולים מבוססי תאים. Acellular aAPC מאפשרים גם רמה גבוהה של שליטה על שידור מצגת פרמטרים ומאפיינים פיזיים של השטח, מה ממשק עם T תאים1.
aAPC חייב מסכם את הדברים מינימום של שני אותות חיוניים עבור הפעלת תא T. אות 1 מספק זיהוי אנטיגן, מתרחשת כאשר הקולטן תא T (TCR) מזהה ועוסק עם מחלקה MHC I או II הנושאת אנטיגן cognate שלה, שהגיעה לשיאה ב איתות באמצעות TCR מורכבות. כדי לעקוף את הדרישה ירידה לפרטים אנטיגן, מערכות aAPC לעיתים קרובות נושאים נוגדנים חד-שבטיים היתה ללא-חת כנגד הקולטן CD3, אשר nonspecifically מעוררת את המתחם TCR. צורות רקומביננטי של MHC, במיוחד MHC multimers, גם שימשו על פני השטח של aAPC כדי לספק אנטיגן ירידה לפרטים2,3. אות 2 הוא סימן costimulatory מנחה את תא T פעילות. כדי לספק את costimulation הדרוש להפעלת תא T, הקולטן CD28 מגורה באופן כללי עם נוגדן היתה ללא-חת הציגו על פני השטח aAPC, למרות קולטנים costimulatory אחרים כגון 4-1BB היה יישוב בהצלחה4. אות 1 ו-2 חלבונים ללא יכולת תנועה הם בדרך כלל על פני השטח של חלקיקים נוקשה לסנתז aAPC. מבחינה היסטורית, aAPC היה מפוברק ממגוון רחב של חומרים, כולל פוליסטירן4,5 ו ברזל לתוספי6. מערכות חדשות לנצל פולימרים מתכלים כמו פוליפוני (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PLGA) כדי ליצור aAPC זה יכול להיות משולב בקלות כדי לאותת חלבונים מתאימים עבור ניהול ישיר ויוו, יכול להקל על שחרורו מתמשכת של אנקפסולציה ציטוקינים או גורמים מסיסים להעצמת תא T-הפעלה-7,-8.
בנוסף נוכחותם של חלבונים הדרושים אות, אירוסין קולטן על פני שטח גדול מספיק במהלך האינטראקציה תא aAPC/T חיוני להפעלת תא T. לפיכך, פרמטרים פיזיים של aAPC כגון גודל וצורה באופן דרסטי לשנות תחום הקשר הזמינים, להשפיע על יכולתם לעורר תאי T. AAPC בגודל מיקרון הוכחו להיות יעילים יותר על תאי T מגרה מאשר שלהם הננומטרי עמיתיהם9,10. עם זאת, ננו-aAPC יכול להיות מעולה biodistribution ניקוז טוב יותר אל בלוטות הלימפה עשוי המשפרים את ביצועי ויוו מיקרו-aAPC11. צורה זו היא משתנה אחר עניין במערכות aAPC מבוסס חלקיק. AAPC אניסוטרופי לאחרונה הוכחו להיות יעיל יותר מאשר חלקיקים איזוטרופיות על תאי T מגרה, בעיקר עקב אינטראקציה משופרת עם תאי המטרה בשילוב עם תאים שאינם ספציפיים מופחתת ספיגת. תאים מעדיפים לאגד לציר הארוך של חלקיקים אליפסואידי, ולאפשר רדיוס גדול יותר של עקמומיות, משטח שטוח יותר קשר בין aAPC לבין תא T12. לציר הארוך של חלקיקים אליפסואידי מרתיעה גם phagocytosis, וכתוצאה מכך זמן מחזור הדם מוגברת בהשוואה חלקיקי כדורית בעקבות ויוו המינהל12,13. בגלל יתרונות אלה, חלקיקים אליפסואידי לתווך הרחבה יותר של אנטיגן ספציפי T תאים במבחנה וב ויוו בהשוואה חלקיקי כדורית, אפקט נצפו על מיקרו והן nanoscales12, 13. ישנן אסטרטגיות שונות כדי לבדות חלקיקים אנאיזוטרופי, אבל סרט דק מתיחה היא שיטה פשוטה, נפוצה ומקובלת המשמש ליצירת מגוון צורות מגוונות של חלקיקים14. בעקבות סינתזה, חלקיקים הם הטלת לסרטים, נמתח בממדים אחד או שניים בטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר זכוכית של החומר חלקיקים. הסרט ואז התפרקה כדי לאחזר את החלקיקים. למרות גוברת ההתעניינות חלקיקים אנאיזוטרופי, לגישות עבור aAPC מבוסס חלקיק שמפברק מוגבלים בעיקר למערכות איזוטרופיות, שיטות של שינוי צורה חלקיק יכול להיות קשה ליישום, תואם מסוימים סינתזה aAPC אסטרטגיות, חוסר דיוק, הפארמצבטית15. הטכניקה מתיחה שלנו סרט דק ניתן לבצע באופן ידני או באופן אוטומטי ליצירת חלקיקים אניסוטרופי מסונתז ממגוון רחב של פולימרים מתכלים במהירות, נמתח יחס רוחב-גובה הרצויה ממדים של אחד או שניים-15.
בהתבסס על העבודות הקודמות שלנו, פיתחנו בגישה מבוסס חלקיק חומר מתכלה בשילוב עם טכנולוגיה מדרגיים של מתיחה סרט דק כדי ליצור במהירות aAPC עם tunable גודל וצורה בצורה סטנדרטית עבור תא T הרחבה שמחוץ או ויוו. האסטרטגיה שלנו ההטיה חלבון יכול לשמש זוג protein(s) בכל עניין לקבוצות carboxyl על פני השטח של חלקיקים-צפיפות הרצוי, נותן את המערכת aAPC רמה גבוהה של גמישות. אנו מתארים גם שיטות כדי לאפיין את גודל, מורפולוגיה, ואת התוכן של aAPC הדם, וכן להעריך את הפונקציונליות במבחנה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות להרחיב תאים חיסוניים שמחוץ או ויוו למגוון רחב של יישומים immunotherapeutic.

<table><tbody><tr><td>פולי (אלכוהול ויניל), MW 25000, 88% הידרוליזה</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02975-500</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>מדחום דיגיטלי</td><td>Fluke</td><td>N / A</td><td>שם דגם: Fluke 52 II</td></tr><tr><td>בדיקת טמפרטורת טבילה</td><td>Fluke N</td><td>/ A</td><td>שם דגם: Fluke 80PK 22</td></tr><tr><td>פלטה דיגיטלית & Stirrer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H3760-HS</td><td></td></tr><tr><td>בוחש רב-נקודתי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50093538</td><td></td></tr><tr><td>רסומר RG 504 H, פולי(D,L-לקטיד-קו-גליקוליד)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>719900</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td>IKA</td><td>&nbsp; </td><td></td>0003725001</tr><tr><td>סוניקטור</td><td>סוניקס & חומרים, בע"מ</td><td>מספר</td><td>דגם: VC 505</td></tr><tr><td>Sonicator מארז הפחתת רעש</td><td>Sonics & חומרים, בע"מ</td><td>לא ישים</td><td>מספר חלק: 630-0427</td></tr><tr><td>בדיקת סוניקטור</td><td>סוניקס & חומרים, בע"מ</td><td>מספר</td><td>חלק: 630-0220</td></tr><tr><td>Sonicator microtip</td><td>Sonics & חומרים, בע"מ</td><td>מספר</td><td>חלק: 630-0423</td></tr><tr><td>צנטריפוגה במהירות גבוהה</td><td>בקמן קולטר</td><td>N/A</td><td>מספר דגם: J-20XP (הופסק), דגם חלופי: J-26XP</td></tr><tr><td>רוטור צנטריפוגה במהירות גבוהה</td><td>בקמן קולטר</td><td>369691</td><td>מספר דגם: JA-17</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה פוליקרבונט במהירות גבוהה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 מ"ל, מכסה בורג</td></tr><tr><td>פטרי חד פעמי מלבני צלחת</td><td>VWR International</td><td>25384-322</td><td>75 x 50 x 10 מ"מ</td></tr><tr><td>צלחת פטרי חד פעמית מרובעת</td><td>VWR International</td><td>10799-140</td><td>100 מ"מ x 100 מ"מ</td></tr><tr><td>LEAF&nbsp; מטוהר נגד עכבר CD3&epsilon; נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>InVivoMab נגד עכבר CD28, שיבוט 37.51</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6383</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysulfosuccinimide מלח נתרן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נגד עכבר CD3 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>100212</td><td></td></tr><tr><td>APC נגד עכבר CD28 נוגדן Biolegend</td><td></td><td>102109</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג&nbsp; 96 באר פוליסטירן מוצק</td><td>Microplate Sigma-Aldrich</td><td></td><td>CLS3915 תחתית שטוחה, חלבון פוליסטירן שחור</td></tr><tr><td>LoBind Tubes, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני (+ L-גלוטמין)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td></td> 11875093 <td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td> ציפרופלוקסצין <td>מומת בחום, מסונן סטרילי</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-2 (ללא נשא)</td> <td>Biolegend</td><td>589102</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM ויטמין פתרון (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11120052</td><td></td></tr><tr><td>CD8a+&nbsp; ערכת בידוד תאי T, עכבר</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>ערכת התפשטות תאים CellTrace CFSE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>עמודות</td><td>LS Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מפריד MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>זרימה ציטומטר</td><td>Accuri C6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סינרגיה 2 קורא מיקרופלייט רב זיהוי</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACS מאגר ריצה</td><td>Miltenyi BIotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22363548</td><td>סטרילי, 70 ומיקרו; מ רשת ניילון</td></tr><tr><td>ACK מאגר ליסינג</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (שחור 6) עכבר</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>000664</td><td>זכר, לפחות 7 שבועות</td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות U-Bottom</td><td>VWR</td><td>353227</td><td>צלחות פוליסטירן סטריליות, 96 בארות שטופלו בתרבית רקמות</td></tr><tr><td>40 V ספק כוח</td><td>Probotix</td><td>LPSK-4010</td><td></td></tr><tr><td>PTFE עכבר תיל מצופה</td><td></td><td>602-5858-100-01</td><td>זה מיועד לסליל של 100 רגל אבל חוט שווה ערך יעבוד</td></tr><tr><td>דרייבר מנוע צעד</td><td>Probotix</td><td>MondoStep5.6</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מחבר IDC</td><td>Probotix</td><td>IDCM-10-12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-בקר</td><td>Probotix</td><td>PBX-RF</td><td></td></tr><tr><td>4A נתיכים</td><td>רדיו Shack</td><td>2701026</td><td>נתיכים שווי ערך יעבדו גם</td></tr> כן<tr><td>כבל DB25 זכר לזכר</td><td>Probotix</td><td>DB25-6 USB-A</td><td></td></tr><tr><td>ל-USB-B</td><td>סיכות</td> כבל <td>2094915</td><td>שווה ערך יעבוד גם</td></tr> כן <tr><td>מחברי Amphenol 8 פינים עכבר זכר ונקבה</td><td></td><td>654-97-3100A-20-7P ו-654-97-3106A20-7S</td><td></td></tr><tr><td>מנוע צעד</td><td>Probotix</td><td>HT23-420-8</td><td></td></tr><tr><td>בורג עופרת ימני</td><td>רוטון</td><td>60722</td><td></td></tr><tr><td>בורג עופרת יד שמאל</td><td>רוטון</td><td>60723</td><td></td></tr><tr><td>ברגים</td><td>מקמאסטר קאר</td><td>92196A151</td><td></td></tr><tr><td>גומי ניאופרן</td><td>מקמאסטר קאר</td><td>8698K51</td><td></td></tr><tr><td>אגוז עופרת אוגן ימני</td><td>רוטון</td><td>91962</td><td></td></tr><tr><td>אגוז עופרת אוגן שמאלי</td><td>רוטון</td><td>91963</td><td></td></tr><tr><td>מחשב בקרת לינוקס</td><td>פרובטיקס</td><td>LCNC-PC</td><td>כל מחשב עם מפרט תואם ומערכת הפעלה לינוקס יעבוד</td></tr><tr><td>מערכת מסנן ואקום בקבוק Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS431097</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור של אניסוטרופי אנטיגן מלאכותי פולימריים הצגת תאי cd8 + t cell ההפעלה

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

תאים המציג אנטיגן מלאכותית (aAPC) הם פלטפורמה מבטיח עבור אפנון המערכת החיסונית עקב יכולתם חזק כדי לגרות את תאי T. מצעים acellular מציעים יתרונות מרכזיים על פני מבוססת-תא aAPC, כולל שליטה מדויקת של הפרמטרים מצגת אות ומאפיינים פיזיים של פני השטח aAPC כדי לווסת את האינטראקציות שלה עם תאי T. aAPC בנוי אניסוטרופי חלקיקים, במיוחד אליפסואידי חלקיקים, הוכחו להיות יעילים יותר מאשר עמיתיהם הכדורית שלהם על תאי T מגרה בשל הכריכה מוגברת שטח גדול יותר זמין עבור תא T קשר, גם כן כמו מופחתת ספיגת לא ספציפית, המאפיינים פרמוקוקינטיים משופרת. למרות שהאיחוד חלקיקים אנאיזוטרופי, מקובל אפילו מאוד שיטות של יצירת חלקיקים אניסוטרופי כגון סרט דק מותח עשויה להיות מאתגרת להטמיע ולהשתמש reproducibly.
למטרה זו, אנו מתארים פרוטוקול על הזיוף מהירה, מתוקננת של מתכלה אניסוטרופי מבוסס חלקיק aAPC עם tunable, גודל, צורה, אות מצגת עבור תא T הרחבה שמחוץ או ויוו, יחד עם שיטות לאפיין שלהם גודל, מורפולוגיה, תוכן, משטח חלבון כדי להעריך את הפונקציונליות שלהם. גישה זו כדי בודה aAPC אניסוטרופי היא מדרגית, לשחזור, שהופך אותו אידיאלי עבור יצירת aAPC עבור immunotherapies "מדף".

מפרטים טכניים עבור הסרט דק אוטומטית 2D מתיחה התקן ניתנת באיור1. מפרטים טכניים ותיאור עבור סרט דק 1 י מתיחות התקן ניתנת et al. הו17 האלונקה נבנית חלקי אלומיניום באמצעות טכניקות לכרסום וחריטה סטנדרטי. בדומה האלונקה 1 י, האלונקה 2D מורכב אוחז מתכת ומעקות מדריך. ברגים עופרת דו-כיווני משמשים כדי לתרגם ליניארי לתנועה סיבובית. הברגים עופרת הם המצורפת באמצעות הברזים מכני זהים stepper מוטורס עם מומנט מספיק. יהיה מולחם החוטים השליטה המוטורית ste...

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר במהירות, reproducibly articifical בהשראה ביולוגית, מתכלה אנטיגן הצגת תאים (aAPC) עם tunable גודל, צורה של הדם המצגת ל- T cell הרחבה שמחוץ או ויוו .

ייצור של אניסוטרופי אנטיגן מלאכותי פולימריים הצגת תאי CD8 + T Cell ההפעלה

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת האמינו. כגון, מהו תפקידם של תכונות פיזיקליות של חלקיקים על אינטראקציות תאים חיסוניים ביו-חומריים והפעלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת שליטה עצמאית בגודל ובצורה של חלקיקים ביומימטיים.ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון הטיפול בסרטן כפי שהוא טיפול חלקיקי המדף שיכול לגרום בתגובות חיסוניות מתווכים תא ויוו. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך סרטן אמינו-טיפול, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות. כגון, מחלה זיהומית או סוכרת מסוג אחד.עבור סינתזת חלקיקים מיקרו, להתחיל על ידי שקילה החוצה 100 מיליגרם של פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית)או PLGA, לתוך בקבוקון scintillation והמסת PLGA בחמישה מיליליטר של דיכלורומתאן על ידי מערבולת. מניחים homogenizer ב beaker המכיל 50 מיליליטר של 1% פוליוויניל אלכוהול, או פתרון PVA, כך homogenizer הוא קרוב ככל האפשר לתחתית המקה מבלי לגעת בו. הפעל את homogenizer למהירות המתאימה ולהוסיף את פתרון PLGA לסק לדקה אחת של הומוגניזציה.בסוף הומוגניזציה, יוצקים את פתרון פוליוויניל אלכוהול PLGA מיקרו חלקיקים לתוך מקור המכיל 100 מיליליטר של 5% פתרון PVA על צלחת ערבוב ברדס כימי ומערבבים את הפתרון לפחות ארבע שעות. כאשר הממס התאדה, יוצקים את תמיסת החלקיקים לתוך צינורות חרוטיים 50 מיליליטר ולאסוף את החלקיקים על ידי צנטריפוגה. החלף את העל-טבעי בכל צינור ב-20 מיליליטר של מים מיוננים והשהה מחדש את החלקיקים על-ידי מערבולת.ואז להביא את הנפח הסופי בכל צינור עד 50 מיליליטר עם מים דה מיוננים טריים לשטוף את החלקיקים פעמיים נוספות כפי שהוכח רק. עבור סינתזת חלקיקים ננו, להמיס 200 מיליגרם של PLGA בחמישה מיליליטר של dichloromethane ולהניח בדיקה sonicator בתוך מקור המכיל 50 מיליליטר של 1%PVA פתרון על הקרח מבלי לגעת בחלק התחתון של המקור. התחל את sonication ב 12 וואט ומיד להוסיף את פתרון PLGA לסק עבור sonication שתי דקות כדי ליצור ננו חלקיקים עם קוטר משוער 200 ננומטר.לאחר sonication, יוצקים את 1% פוליוויניל אלכוהול PLGA ננו חלקיקים פתרון לתוך מקור המכיל 100 מיליליטר של 5 פתרון PVA על צלחת ערבוב במשך ארבע שעות של אידוי ממס במכסה המנוע אדים כימיים. כאשר כל הממס מתאדה, יוצקים את תמיסת החלקיקים לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה כדי להסיר את כל חלקיקי מיקרו ולהסיר את supernatants. לאחר מכן להעביר את הננו חלקיקים לתוך צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה במשך שלוש שטיפות במים מיוינים כפי שהוכח.עבור ייצור חלקיקים פולימריים, לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את החלקיקים בערך מיליליטר אחד של מים דה-מיוננים טריים ולהוסיף פתרון יציקת הסרט לחלקיקים לריכוז סופי של 2.5 מיליגרם לכל חלקיקים מיליליטר. מעבירים את השעיית החלקיק ב 10 aliquots מיליליטר לתוך 75 על ידי 50 מילימטר מנות פטרי מלבניות עבור מתיחה מימדית אחת. או ב 15 aliquots מיליליטר לתוך 100 על ידי 100 מילימטר מרובע פטרי מנות עבור מתיחה דו מימדית.לאחר ייבוש לילה ברדס כימי, השתמש פינצטה כדי להסיר את הסרטים לקצץ את הקצוות עם מספריים. עבור מתיחה 1D, למקם את שני הקצוות הקצרים של סרט אחד בין שתי חתיכות של גומי neoprene להרכבה על בלוקי אלומיניום של ציר אחד של מכשיר מתיחה סרט דק אוטומטי. לאחר מכן השתמש מפתח ברגים אלן לדפוק את ידיות המתכת על גבי הגומי להחזיק את הסרט במקום.עבור מתיחה דו-ממדית, הר את כל ארבעת הקצוות על ארבעה בלוקי אלומיניום כדי למתוח את הסרט על שני הצירים למדוד ולתזמן את אורך הסרט בין בלוקי אלומיניום על ציר אחד עבור מתיחה D אחד או שני הצירים עבור מתיחה דו-ממדית ולחשב את המרחק הנדרש כדי למתוח את הסרט בכיוונים אחד או שניים בהתבסס על מתיחת הקיפול הרצויה. לאחר מכן מניחים את מכשיר מתיחה טעון הסרט בתנור ב 90 מעלות צלזיוס ליד מקור גדול יותר של כמות קטנה של מים כדי להביא את הסרט לטמפרטורה מעל 10 דקות. כאשר המתיחה הושלמה, תן לסרט להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.עבור מתיחה חד-מימדית, גזור את הסרט מהמכשיר המתוח בקצוות. עבור מתיחה 2D, לגזור ולשמור את הריבוע המרכזי של הסרט כי הוא נמתח באופן אחיד על שני הצירים. מניחים את הסרטים ב 50 צינורות חרוט מיליליטר עם לא יותר משני סרטים לכל צינור ולהוסיף כ 25 מיליליטר של מים מיוננים לכל צינור למערבולת.כאשר הסרטים נמסים, לשטוף את החלקיקים שלוש פעמים במים מיוינים כפי שהוכח. השעיה מחדש של החלקיקים בכמיליליטר של מים לא מיוננים טריים לצינור לאחר הכביסה האחרונה. ואז להקפיא את החלקיקים במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת או לילה lyophilization.למחרת בבוקר, להשעות מחדש את מיקרו ליופילי או חלקיקי ננו ב 20 מיליגרם למיליליטר במאגר MES מוכן טרי עם מערבולת. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון החלקיק לצינור פוליפרופילן מיקרו צנטריפוגה המכיל 900 microliters של מאגר MES ולהוסיף 100 microliters של פתרון NHS EDC מוכן טרי. מערבבים את החלקיקים על ידי מערבולת ודגירה החלקיקים על מהפך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.בסוף הדגירה, לאסוף את החלקיקים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את כדורי חלקיקי מיקרו במיליליטר אחד של PBS על ידי מערבולת או להשעות מחדש את הננו חלקיקים במיליליטר אחד של PBS על ידי חמש שניות של sonication ב 2-3 וואט. לאחר מכן, הוסיפו שמונה מיקרוגרם של אות מתאים חלבון אחד ו-10 מיקרוגרם של נוגדן CD28 נגד עכברים למיקרו-חלקיקים, או 16 מיקרוגרם של האות חלבון אחד ו-20 מיקרוגרם של CD28 נגד עכברים לננו-חלקיקים. מביאים את הנפח הסופי בכל צינור ל-1.1 מיליליטר עם PBS ומטמיירים את החלקיקים בן לילה על מהפך בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, לשטוף את החלקיקים שלוש פעמים במים מיוינים כפי שהוכח. ננו PLGA אלה חלקיקים מיקרו היו מסונתזים באמצעות טכניקות אמולסיה אחת כפי שהודגם בתמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור וסריקה. לאחר הומוגניזציה, המיקרו-חלקיקים הדגימו קוטר ממוצע של כשלושה מיקרומטרים.חלקיקי המיקרו כדורי היה מקצב גובה-רוחב של כאחד, בעוד חלקיקי 1D מתוח prolate אליפסואידים היה יחס גובה-רוחב גדול יותר של כשלוש וחצי ואת 2D נמתח חלקיקים אליפסואידים oblate היה יחס גובה-רוחב של כ 1.2, בערך שמירה על יחס גובה-רוחב של אחד. תוצאות יעילות ההטיה חושפות את כמויות החלבון הדומות על פני השטח של תאים מיקרו-מלאכותיים מיקרו-מלאכותיים כדוריים אליפסואידיים, או AAPC וננו-AAPC, המוכיחים כי זיווג חלבונים במהלך סינתזת AAPC מתרחש באופן תלוי ריכוז. AAPC אליפסואיד פרולט נמצאו לגרום לרמות גבוהות יותר של התפשטות תאי T במינונים תת רוויים מאשר AAPC כדורי עם ההפרדה הטובה ביותר שהושגה במינון 01 מיליגרם.לאחר שבעה ימים, ספירה ידנית של תאי T גילתה כי AAPC אליפסואידית prolate ביעילות רבה יותר לעורר תאי T בהשוואה לעמיתיהם כדוריים בסולם מיקרו ננו באופן תלוי מנה. בעקבות הליך זה, AAPC ניתן לנהל ב vivo כדי לאמוד את היעילות הטיפולית שלהם פרמקוקינטיקה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סייעה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום האימונו-הנדסה לחקור את ההשפעה של אניסוטרופיה על יעילות AAPC.

fabrication-anisotropic-polymeric-artificial-antigen-presenting-cells

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

שיטה חדשה DC עצמאית לזירוז והרחבה של אנטיגן ספציפי לערמונית בתאי T מתואר. HLA-A2 איג תאים מלאכותיים הצגת מבוסס Antigen (aAPC) נטענים עם HLA-A2 פפטידים מוגבלת ביעילות להרחיב CTL הספציפיות אנטיגן מגוונים. טכנולוגיה זו מחזיקה פוטנציאל גדול עבור חיסוני CTL מבוססי המאמצת.

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

כאן אנו מתארים שיטה להפעלה והרחבת תאי NKT אדם מאוכלוסיות תאי T בתפזורת באמצעות תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPC). השימוש בaAPC CD1d המבוסס מספק שיטה סטנדרטית ליצירת מספר רב של תאי NKT פונקציונליים.

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבידוד תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן נדיר באמצעות תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים מבוססי ננו-חלקיקים מגנטיים (aAPCs) המתפקדים עם MHC-Igs אנטיגני ונוגדנים נגד CD28. אינטראקציה של aAPCs עם תאי CD8+ T המבטאים באופן ספציפי את קולטני תאי T הממוקדים בפפטידים, ולאחר מכן התרחבותם במבחנה, מביאה להעשרה והרחבה של אוכלוסיית תאי CD8+ T זו.

העשרה מבוססת ננו-חלקיקים והרחבה של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן

סרטון וידאו זה מדגים שיטה לפירוק קומפלקס היסטותאימות פפטיד מז'ור הניתן להפעלה באמצעות קרינת UV. תהליך הדעיכה חושף את רצף הפפטידים, ומאפשר הפעלה מדויקת של תאי T.

הערכה של הפעלה מבוקרת של תאי T עם פפטיד MHC הניתן להפעלה

הנחיות מוצגות עבור הדור של אנטיגן המלאכותי רוצח הצגת תאים, KaAPC, כלי יעיל לדלדול במבחנה של תאי T אנטיגן ספציפי לאדם ולפתרון חלופי לטיפול חיסוני תאי לטיפול במחלות אוטואימוניות בתיווך תא T בantigen- אופנה ספציפית מבלי להתפשר על המערכת החיסונית שנותרה.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל במבחנה דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

תאי T אנטיגן ספציפי קשים לאפיין או לנצל טיפולים עקב שלהם בתדר נמוך מאוד. במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול לפתח חלקיק מגנטי אשר ניתן לאגד בתאי T אנטיגן ספציפי כדי להעשיר תאים אלה ולאחר מכן להרחיב אותם כמה פי100 אפיון וטיפול.

להעשיר ולהרחיב בתאי T אנטיגן ספציפי נדיר עם חלקיקים מגנטיים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של רשת יחיד MHC מחלקה אני מתחמי לחקור מולקולרית באינטראקציה האנושית CD8 + T תאים הפעלה: דור של הנדסה אנטיגן הצגת תאים המבטאים שרשרת אחת בונה, תרבות של שיבוט אנושי של תא CD8 + T וניסויים תא T הפעלה.

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת אנטיגן גידול פונקציונלי-ספציפי המושרה pluripotent תא גזע בודד באמצעות OP9/DLL1 מערכת התרבות המשותף.

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

למדו לייצר תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים אניסוטרופיים מפולימרים ביודגרדביליים להפעלת תאי T CD8+. שיטה זו מאפשרת שליטה עצמאית בגודל ובצורת החלקיקים ליישומים בתחום האימונותרפיה נגד סרטן ומחלות נוספות.

ייצור של אניסוטרופי אנטיגן מלאכותי פולימריים הצגת תאי CD8 + T Cell ההפעלה

גלה סרטונים נוספים