ייצור של אניסוטרופי אנטיגן מלאכותי פולימריים הצגת תאי CD8 + T Cell ההפעלה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת האמינו. כגון, מהו תפקידם של תכונות פיזיקליות של חלקיקים על אינטראקציות תאים חיסוניים ביו-חומריים והפעלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת שליטה עצמאית בגודל ובצורה של חלקיקים ביומימטיים.

ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון הטיפול בסרטן כפי שהוא טיפול חלקיקי המדף שיכול לגרום בתגובות חיסוניות מתווכים תא ויוו. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך סרטן אמינו-טיפול, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות. כגון, מחלה זיהומית או סוכרת מסוג אחד.

עבור סינתזת חלקיקים מיקרו, להתחיל על ידי שקילה החוצה 100 מיליגרם של פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית)או PLGA, לתוך בקבוקון scintillation והמסת PLGA בחמישה מיליליטר של דיכלורומתאן על ידי מערבולת. מניחים homogenizer ב beaker המכיל 50 מיליליטר של 1% פוליוויניל אלכוהול, או פתרון PVA, כך homogenizer הוא קרוב ככל האפשר לתחתית המקה מבלי לגעת בו. הפעל את homogenizer למהירות המתאימה ולהוסיף את פתרון PLGA לסק לדקה אחת של הומוגניזציה.

בסוף הומוגניזציה, יוצקים את פתרון פוליוויניל אלכוהול PLGA מיקרו חלקיקים לתוך מקור המכיל 100 מיליליטר של 5% פתרון PVA על צלחת ערבוב ברדס כימי ומערבבים את הפתרון לפחות ארבע שעות. כאשר הממס התאדה, יוצקים את תמיסת החלקיקים לתוך צינורות חרוטיים 50 מיליליטר ולאסוף את החלקיקים על ידי צנטריפוגה. החלף את העל-טבעי בכל צינור ב-20 מיליליטר של מים מיוננים והשהה מחדש את החלקיקים על-ידי מערבולת.

ואז להביא את הנפח הסופי בכל צינור עד 50 מיליליטר עם מים דה מיוננים טריים לשטוף את החלקיקים פעמיים נוספות כפי שהוכח רק. עבור סינתזת חלקיקים ננו, להמיס 200 מיליגרם של PLGA בחמישה מיליליטר של dichloromethane ולהניח בדיקה sonicator בתוך מקור המכיל 50 מיליליטר של 1%PVA פתרון על הקרח מבלי לגעת בחלק התחתון של המקור. התחל את sonication ב 12 וואט ומיד להוסיף את פתרון PLGA לסק עבור sonication שתי דקות כדי ליצור ננו חלקיקים עם קוטר משוער 200 ננומטר.

לאחר sonication, יוצקים את 1% פוליוויניל אלכוהול PLGA ננו חלקיקים פתרון לתוך מקור המכיל 100 מיליליטר של 5 פתרון PVA על צלחת ערבוב במשך ארבע שעות של אידוי ממס במכסה המנוע אדים כימיים. כאשר כל הממס מתאדה, יוצקים את תמיסת החלקיקים לתוך צינורות חרוט 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה כדי להסיר את כל חלקיקי מיקרו ולהסיר את supernatants. לאחר מכן להעביר את הננו חלקיקים לתוך צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה במשך שלוש שטיפות במים מיוינים כפי שהוכח.

עבור ייצור חלקיקים פולימריים, לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את החלקיקים בערך מיליליטר אחד של מים דה-מיוננים טריים ולהוסיף פתרון יציקת הסרט לחלקיקים לריכוז סופי של 2.5 מיליגרם לכל חלקיקים מיליליטר. מעבירים את השעיית החלקיק ב 10 aliquots מיליליטר לתוך 75 על ידי 50 מילימטר מנות פטרי מלבניות עבור מתיחה מימדית אחת. או ב 15 aliquots מיליליטר לתוך 100 על ידי 100 מילימטר מרובע פטרי מנות עבור מתיחה דו מימדית.

לאחר ייבוש לילה ברדס כימי, השתמש פינצטה כדי להסיר את הסרטים לקצץ את הקצוות עם מספריים. עבור מתיחה 1D, למקם את שני הקצוות הקצרים של סרט אחד בין שתי חתיכות של גומי neoprene להרכבה על בלוקי אלומיניום של ציר אחד של מכשיר מתיחה סרט דק אוטומטי. לאחר מכן השתמש מפתח ברגים אלן לדפוק את ידיות המתכת על גבי הגומי להחזיק את הסרט במקום.

עבור מתיחה דו-ממדית, הר את כל ארבעת הקצוות על ארבעה בלוקי אלומיניום כדי למתוח את הסרט על שני הצירים למדוד ולתזמן את אורך הסרט בין בלוקי אלומיניום על ציר אחד עבור מתיחה D אחד או שני הצירים עבור מתיחה דו-ממדית ולחשב את המרחק הנדרש כדי למתוח את הסרט בכיוונים אחד או שניים בהתבסס על מתיחת הקיפול הרצויה. לאחר מכן מניחים את מכשיר מתיחה טעון הסרט בתנור ב 90 מעלות צלזיוס ליד מקור גדול יותר של כמות קטנה של מים כדי להביא את הסרט לטמפרטורה מעל 10 דקות. כאשר המתיחה הושלמה, תן לסרט להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.

עבור מתיחה חד-מימדית, גזור את הסרט מהמכשיר המתוח בקצוות. עבור מתיחה 2D, לגזור ולשמור את הריבוע המרכזי של הסרט כי הוא נמתח באופן אחיד על שני הצירים. מניחים את הסרטים ב 50 צינורות חרוט מיליליטר עם לא יותר משני סרטים לכל צינור ולהוסיף כ 25 מיליליטר של מים מיוננים לכל צינור למערבולת.

כאשר הסרטים נמסים, לשטוף את החלקיקים שלוש פעמים במים מיוינים כפי שהוכח. השעיה מחדש של החלקיקים בכמיליליטר של מים לא מיוננים טריים לצינור לאחר הכביסה האחרונה. ואז להקפיא את החלקיקים במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת או לילה lyophilization.

למחרת בבוקר, להשעות מחדש את מיקרו ליופילי או חלקיקי ננו ב 20 מיליגרם למיליליטר במאגר MES מוכן טרי עם מערבולת. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון החלקיק לצינור פוליפרופילן מיקרו צנטריפוגה המכיל 900 microliters של מאגר MES ולהוסיף 100 microliters של פתרון NHS EDC מוכן טרי. מערבבים את החלקיקים על ידי מערבולת ודגירה החלקיקים על מהפך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.

בסוף הדגירה, לאסוף את החלקיקים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את כדורי חלקיקי מיקרו במיליליטר אחד של PBS על ידי מערבולת או להשעות מחדש את הננו חלקיקים במיליליטר אחד של PBS על ידי חמש שניות של sonication ב 2-3 וואט. לאחר מכן, הוסיפו שמונה מיקרוגרם של אות מתאים חלבון אחד ו-10 מיקרוגרם של נוגדן CD28 נגד עכברים למיקרו-חלקיקים, או 16 מיקרוגרם של האות חלבון אחד ו-20 מיקרוגרם של CD28 נגד עכברים לננו-חלקיקים. מביאים את הנפח הסופי בכל צינור ל-1.1 מיליליטר עם PBS ומטמיירים את החלקיקים בן לילה על מהפך בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, לשטוף את החלקיקים שלוש פעמים במים מיוינים כפי שהוכח. ננו PLGA אלה חלקיקים מיקרו היו מסונתזים באמצעות טכניקות אמולסיה אחת כפי שהודגם בתמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור וסריקה. לאחר הומוגניזציה, המיקרו-חלקיקים הדגימו קוטר ממוצע של כשלושה מיקרומטרים.

חלקיקי המיקרו כדורי היה מקצב גובה-רוחב של כאחד, בעוד חלקיקי 1D מתוח prolate אליפסואידים היה יחס גובה-רוחב גדול יותר של כשלוש וחצי ואת 2D נמתח חלקיקים אליפסואידים oblate היה יחס גובה-רוחב של כ 1.2, בערך שמירה על יחס גובה-רוחב של אחד. תוצאות יעילות ההטיה חושפות את כמויות החלבון הדומות על פני השטח של תאים מיקרו-מלאכותיים מיקרו-מלאכותיים כדוריים אליפסואידיים, או AAPC וננו-AAPC, המוכיחים כי זיווג חלבונים במהלך סינתזת AAPC מתרחש באופן תלוי ריכוז. AAPC אליפסואיד פרולט נמצאו לגרום לרמות גבוהות יותר של התפשטות תאי T במינונים תת רוויים מאשר AAPC כדורי עם ההפרדה הטובה ביותר שהושגה במינון 01 מיליגרם.

לאחר שבעה ימים, ספירה ידנית של תאי T גילתה כי AAPC אליפסואידית prolate ביעילות רבה יותר לעורר תאי T בהשוואה לעמיתיהם כדוריים בסולם מיקרו ננו באופן תלוי מנה. בעקבות הליך זה, AAPC ניתן לנהל ב vivo כדי לאמוד את היעילות הטיפולית שלהם פרמקוקינטיקה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סייעה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום האימונו-הנדסה לחקור את ההשפעה של אניסוטרופיה על יעילות AAPC.