Name: כבד-על-שבב תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: חקור מודל כבד-על-שבב תלת-ממדי לזיהום נגיף הפטיטיס B באמצעות תרביות hepatocytes ותאי Kupffer. שיטה זו מאפשרת מחקר ממושך של קינטיקת זיהום ומנגנוני שכפול ויראלי בדגם פיזיולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי מענק Starter של המועצה האירופית למחקר (637304), Wellcome אמון החוקר פרס (104771/ת/14-Z), ועל ידי CN ביו חידושים.

<ol><li>Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Models+for+the+Investigation+of+Hepatitis+B+and+D+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li>
<li>Elaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+the+dedifferentiation+process+of+isolated+hepatocytes+and+their+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.</a> Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).</li>
<li>Konig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+bile+acid+transporter+and+hepatitis+B+virus+receptor+Na%2B%2Ftaurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+preclinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682(2018).</li>
<li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+cccDNA+in+HBV+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Role of cccDNA in HBV Maintenance.</a> Viruses. 9 (6), (2017).</li>
<li>Guo, J. T., Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+hepatitis+B+virus+cccDNA%3A+Implications+for+the+development+of+cccDNA-targeting+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics.</a> Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).</li>
<li>Lucifora, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+antiviral+properties+of+TLR+ligands+against+HBV+replication+in+immune-competent+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).</li>
<li>Hosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+Activates+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription+3+Supporting+Hepatocyte+Survival+and+Virus+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+human+liver+scaffolds+for+functional+tissue+engineering+by+high+shear+stress+oscillation-decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).</li>
<li>Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+promote+survival%2C+proliferation%2C+and+maintenance+of+differentiation+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).</li>
<li>Hwa, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+survive+without+exogenous+VEGF+in+3D+perfused+co-cultures+with+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes.</a> The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).</li>
<li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li>
<li>March, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+coculture+of+primary+human+hepatocytes+and+supportive+cells+for+the+study+of+hepatotropic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li>
<li>Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176555/">Engineering liver.</a> Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).</li>
<li>Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+multiwell+plate+for+3D+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering.</a> Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

האתגרים בשמירה על תרבויות ארוכת טווח של PHH הניעו הפיתוח של מספר מודלים תרבות עם פונקציונליות מוגברת, אריכות ימים, אחד מפגין דיפרנציאלית יתרונות וחסרונות. זה נרחב כעת ידוע כי תרבויות 2D סטטי של PHH הם מחקה היבטים מסוימים של ביולוגיה hepatocyte עבור סכומים מאוד מוגבלת של זמן. לפיכך, micropatterned cocultures12,13,14,תרבויות ספרואיד15, תרבויות הכבד-על-שבב 3D16,17 במהירות החלפת מערכות בסיסי יותר אלו. במיוחד כאשר הלומדים מחלות זיהומיות, אשר יש coevolved עם המנחה שלהם כדי לנצל את microenvironments ספציפיים, הדרישה למתן סביבות פיזיולוגיים היא ביסודה על ידי טיב לעיתים קרובות מאתגרת culturing האדם-חוג מחלות זיהומיות, כולל וירוס הפטיטיס C, HBV ו מלריה.
השלב הקריטי ביותר בביצוע תרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד היא האיכות של סוגי בתחילה מתוצרת התא הראשי. תאים אלה צריך להיבדק על יכולת הדבקות שלהם, רק plateable הרבה PHH אמור לשמש על מנת להבטיח היווצרות רקמת מוצלחת ויצירת תרבות. אף-על-פי PHH מבודדים טרי יכול לשמש, הקפאה קריוגנית שלהם הוא בדרך כלל מורכב ודורש מקפיאים שבשליטת תעריף מיוחד.
בניגוד קונבנציונאלי תרבויות 2D סטטי, הרקע הגנטי של המארח הוא זניח ביחס הרגישות לזיהום HBV, כל התורמים hepatocyte נבדק ובכך-הרחוק הם מסוגלים ליצור זיהום HBV4.
אף-על-פי HBV נגזר המטופל יוצר דלקות של תרבויות 3D, זה הכרחי כדי לנצל זירז פג וטיהרו סוכרוז כרית-HBV בכל פעם באמצעות הסלולרי מפיק HBV inducible קווים לדור של inocula ויראלי. תא supernatants תרבות מוחל ישירות על תרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד, או באמצעות הנוכחות של גורמים מעכבות או עקב חוסר תאימות של גורמי גדילה הנוכחי עם hepatocytes, לא בקלות לגרום זיהום. בנוסף, בעת בחירת המטופל, נגזר inocula ויראלי, רק סרום אמור לשמש, שכן פלזמה באופן בלתי נמנע נקרש שסותם את זרימת הדם microfluidic של פלטפורמת תרבות.
ללא קשר inoculum ויראלי בשימוש, הבטחת הכדאיות הסלולר ובידול, כמו גם להבטיח הסרה מלאה של inoculum הראשונית HBV, הוא המפתח להצלחה בלימודים זיהום לטווח ארוך. הדרך הנוחה ביותר לעשות זאת היא דגימה תרבויות בעקבות הסרת inoculum ויראלי, כמו גם מדידת רמות אלבומין אנושי לאורך כל תקופת תרבות. ראוי לציין, באופן דומה כדי לתאר כל פלטפורמות אחרות, זיהום HBV, הוקמה לאחר, בקלות להתפשט לתאים נגוע. המנגנון הבסיסי זה עודנו מאז HBV זיהום ויוו מדביק ברצון הרוב hepatocytes בתוך הכבד.
לגבי cocultures של תאים PHH ו- Kupffer, מומלץ לבצע בדיקות רבות של תאים Kupffer כדי להעריך את הפרשת IL6 ו TNFα בתגובה לגירוי LPS, מכיוון שלא כל התורמים תא Kupffer זמינים מסחרית של תגובתיות שווה.
חשוב, עבור כל טיפולים תרופות או זיהום ראשוני של תרבויות עם HBV, הנפח הכולל של הבאר (1.4 מ ל), כמו גם החל ערוץ microfluidic (0.2 מ"ל), חייב להילקח בחשבון לחישוב ריכוז סמים או inoculum. על מנת להבטיח מינון מדויק, צעד אחד כביסה בינונית המכיל HBV או סמים זה מבוצע על מנת פריים בערוץ microfluidic.
פלטפורמת בשימוש מנצל PHH 600,000 לכל טוב, המבטיח hepatocytes מרובה שכבות בתוך פיגומים. אף-על-פי מספר תאים יכולים להיות מגוונים, ריכוז התא שבחרת מבטיחה תוצאות אופטימליות. התבנית צלחת מחזיקה סכום כולל של 12 פיגומים, אשר ניתנת לשדרוג פיגומים 36. עם זאת, עקב דרישות microfluidic, אולם שינוי קנה המידה למספרים גבוהים יותר טוב. בלתי אפשרי לצאת
באמצעות גישות אלה, תרבויות יכול להישמר עם ביצועים מיטביים תא לפחות 40 ימים, אשר, עד כה, מציע הזדמנויות חסר תקדים כדי להעריך את הרומן סמים המועמדים, כמו גם ללמוד הגומלין המורכבים בין תאים שונים הכבד אוכלוסיות במהלך זיהום HBV.

המחקר של HBV מסובך מאת הרגישות המסכן של מערכות התרבות, הדורשים כמה מאות אלפי עותקים הגנום HBV בכל תא ליזום את זיהום1. יתר על כן, hepatocytes האדם העיקרי בדרך כלל חלשים במיוחד, במהירות dedifferentiate במהלך תרבויות קונבנציונאלי2. זה בעיקר בשל העובדה כי משטחי פלסטיק שטוחה וקשה מחקה את סביבות חוץ-תאית טבעיים המצויים בכבד, חוסר חמצון של התרבויות בהיעדר זרימת microfluidic כללי. תרבויות hepatocyte סטטי המקובלת על צלחות מצופה קולגן במהירות dedifferentiate, מאבדים את הרגישות שלהם ל- HBV זיהום3. כאן, אנו מתארים את הקמה זיהום של PHH גדל בתרבויות הכבד-על-שבב 3D, אשר מהווים יתרון במידה רבה על-קונבנציונאלי 2D סטטי PHH תרבויות על צלחות מצופה קולגן בשל היכולת המורחבת שלהם מטבולית ופונקציונליים, הקלת תרבויות לטווח ארוך לפחות 40 יום4. במערכת זו, PHH הם נזרע על פיגומים מצופים קולגן, אשר הם perfused ללא הרף עם מדיום הגידול לאספקת חמצן וחומרים מזינים לתאים. אף-על-פי תרבות חלופית מערכות PHH מבוסס על cocultures מורכבים fibroblasts מאתר או גידול 3D spheroids יש מאומתים, רגישים לזיהומים HBV באמצעות multiplicities של זיהום במקבילות הגנום 500 (GE) של HBV בכל תא, תלת-ממד כבד-על-שבב תרבויות נשארים במערכת מודל במבחנה הבלעדית רגישים 0.05 ג ' נרל אלקטריק של HBV לכל תא4. זה היא בנוסף ביסודה על ידי הצורך באמצעות ריכוז גבוה של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), פוליאתילן גליקול (PEG) להקים HBV זיהום בתרבויות אלה, ובגלל זה לוותר על הזיהום של מערכות התרבות הכבד-על-שבב תלת-ממד 4. בין גולת העיקריים של HBV זיהום הוא מאגר cccDNA, אשר משמש התבנית תעתיק עבור כל de novo–המיוצר virions5,6. אף-על-פי cccDNA ניתן להבחין ב- hepatocyte קונבנציונלי-תרבויות-7,-8, עדיין לא ברור לגבי האם ברגולציה של cccDNA ויש גישות טיפוליות שמטרתן חיסול הם recapitulated ב חלקית או hepatocytes לחלוטין dedifferentiated. אנחנו הראו cccDNA הזה נוצר באופן פונקציונלי בתרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד, מגיב לגירויים פיזיולוגיים, ניתן לפלח על ידי הפרעה את הנגישות של מכונות תעתיק הגנום cccDNA4.
לארח התגובות HBV זיהום ב- 3D לחקות הכבד-על-שבב לאלה הנהוגות HBV נגועים, המאפשר זיהוי סמנים ביולוגיים זיהום, כמו גם ההצלחה הטיפולית. בין התכונות הייחודי של הכבד-על-שבב תרבויות הוא היכולת להעריך תגובות לטווח ארוך מארח בין PHH לבין שאר התאים nonparenchymal בתוך הכבד, כולל תאים4Kupffer, תאי stellate9של הכבד sinusoidal תאי אנדותל10,11. זה מציע הזדמנות ייחודית כדי להעריך את האינטראקציות תא תא microenvironment תלת-ממד מורכבים.
בנוסף, תקופת תרבות מורחב של פלטפורמה זו מקלה על ההערכה של טיפולים בסמים רציפים והשפעתם על התמדה HBV, אשר לא ניתן באמצעות מערכות התרבות hepatocyte קונבנציונלי.
פרוטוקול זה מתאר כיצד 3D הכבד-על-שבב תרבויות נוצרים, עבור monocultures של PHH או עבור cocultures של PHH עם תאים Kupffer. יתר על כן, אנו מתארים את הייצור של HBV מטוהרים ללימודי נמוך-ריבוי-של-זיהום, כמו גם ניתוח עוקבות של המארח ותגובות ויראלי.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium, ללא פנול אדום</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>הפטוציטים בינוניים</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>תוספי הפשרה וציפוי ראשוניים של הפטוציטים</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>תוספי תחזוקת הפטוציטים ראשוניים</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMEM מתקדם</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, ממוצא ארה"ב, מומת בחום, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מעור עגל</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פחמתי נטול מים</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית 99.999%</td> <td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין (אנושי)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>פישר ביו-ריאגנט&nbsp; אלבומין סרום בקר, Fraction V, מטופל בהלם חום</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, ללא UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide מבית Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kits/Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Membrane</td><td>CN Bio חידושים</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip צלחת תרבית תאי זלוף</td><td>CN חידושים ביו</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>מכסה צלחת תרבות LiverChip</td><td>CN חידושים ביו</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון עגול סטרילי</td><td>CN ביו חידושים</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>פיגום חיבור תאים</td><td>CN חידושים ביו</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>טבעת שמירה</td><td>CN ביו חידושים</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>בוכנה סטרילית</td><td>CN Bio חידושים</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy דם ורקמות</td><td>ערכת Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>מבחן Luminex מגנטי אנושי</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA פתרון מצע</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp סט אביזרי RNA ויראלי מיני</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>המכיל נשא RNA</td></tr><tr><td>Millicell HY בקבוק תרבית תאים 5 שכבות, T-1000,</td><td>Millipore סטרילי (Merck)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFHYS1008 MicroAmp אופטי 384 באר צלחת תגובה עם ברקוד</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp מיקרו אמפ אופטי</td><td>דבק סרט חיים</td><td>טכנולוגיות חיים 4311971</td><td></td></tr><tr><td>שקופה שטוחה תחתית חיסונית לא סטרילית 96 בארות קלטת</td> איטום <td>ThermoFisher Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>לצלחות 96 בארות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow סטרילי בקבוק חד פעמי מסננים עליונים עם קרום PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; מגלשות מיקרוסקופיות עם קצוות קרקע, Twin</td><td>Frost Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 מ"ל, 25 x 89 מ"מ</td><td>בקמן קולטר</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>תאים ראשוניים / קווי תאים</ הפטוציטים חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנושיים הניתנים לצפייה, טרנספורטר מוסמך</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>תאי קופפר אנושיים שמורים בהקפאה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19 קו תאים</td><td>Haitao Guo (אוניברסיטת אינדיאנה, אינדיאנה, ארה"ב)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שם<</td><td>strong>חברה</חזק> </td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primers/Tests/Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA קדימה פריימר</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNA probe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA קדימה פריימר</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr><td>פריימר הפוך</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>פריימר קדימה</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>פריימר הפוך</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>פרופסור כריסטוף סיגר (מרכז הסרטן פוקס צ'ייס, פנסילבניה, ארה"ב)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>נוגדנים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטיגן ליבת נגיף נגד הפטיטיס B חלק IgG (פוליקלונלי)</td><td>DAKO</td><td>הופסק</td><td>לוט 10102505</td></tr><tr><td>נוגדן אלבומין אנושי, A80-129A</td><td>מעבדות בתיל. inc</td><td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן סופח אלבומין אנושי, A80-229P</td><td>מעבדות Bethyl. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 594</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>#&nbsp; A-11072</td><td>פריט 1431810</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip משאבת ואקום</td><td>CN Bio חידושים</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip פנאומטי חיבור</td><td>CN ביו חידושים</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת LiverChip</td><td>CN Bio חידושים</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip רציף שטיפת צלחות</td><td>CN Bio חידושים מלקחיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתכתיים ניתנים לחיטוי</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries</td><td>מק"ט: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td><td>בקמן קולטר</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R צנטריפוגה</td><td>תרמו מדעית</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 יניקה רפואית ואקום גבוה זרימה</td><td>גבוהה MGE ברחבי העולם</td><td>&nbsp; חממה מסדרת SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>NUAIRE 5800</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>טורג דיוק אוטומטי</td><td>CN Bio חידושים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מומנט ידני</td><td>CN Bio חידושים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדחס LiverChip</td><td>CN Bio חידושים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex LX-200 מכשיר עם xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore כף יד מגנטית מפריד בלוק</td><td>ThermoFisher מדעי</td><td>Millipore&trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>FluoStar Optima קורא צלחות</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER מברגים חשמליים מדויקים</td><td>VTECH בע"מ</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER ספק כוח</td><td>VTECH בע"מ</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>ציוד אוויר</td><td>הופסק</td><td></td></tr><tr><td>Integra Vacuboy</td><td>INTEGRA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 מערכת PCR בזמן אמת עם בלוק 384 בארות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453536</td><td></td></tr></tbody></table>

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי hepatocytes ותאים kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס b

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

למרות infectivity יוצא דופן של הנגיף הפטיטיס B (HBV) אין ויוו, שבו רק שלושה הגנום הנגיפי יכול לגרום כרוניות שימפנזות השפעול נגוע, ביותר במבחנה מודלים דורשים כמה מאות אלפי הגנום הנגיפי לכל תא סדר ליזום זיהום ארעית. בנוסף, תרבויות 2D סטטי hepatocytes אנושי ראשוני (PHH) מאפשרים רק לטווח קצר מחקרים עקב dedifferentiation המהירה שלהם. כאן, אנו מתארים 3D תרבויות הכבד-על-שבב של PHH, monocultures או cocultures עם שאר התאים בכבד תושב nonparenchymal. אלה מציעים שיפור משמעותי ללמוד זיהומים HBV לטווח ארוך עם התגובות התא המארח פיזיולוגיים. בנוסף בהנחיה התרופות היעילות לימודי ניתוח רעילות, חקירות פתוגנזה מערכות התרבות microfluidic אלה מאפשרים הערכת טיפולי ריפוי זיהום HBV שמטרתן חיסול covalently סגור, מעגלי (ccc) ה-DNA. זה הציג שיטה מתאר את הסידור של PHH monocultures, PHH/Kupffer תא תרבויות המשנה שלהם זיהום עם HBV מטוהרים, הניתוח של תגובות המארח. שיטה זו ישימה במיוחד על הערכת ההשפעות לטווח ארוך של זיהום, שילובי טיפול פתוגנזה ו HBV.

אנו מתארים פלטפורמה פשוטה, רב-תכליתי עבור התרבות לטווח ארוך של התאים Kupffer העיקרי של האדם ו/או hepatocytes ולדלקת שלהם עם HBV. ראשי תאים אנושיים הם נזרע על פיגומים פוליסטירן מצופים הקולגן בתוך אסיפה צלחת microfluidic, אשר ללא הרף perfuses התאים עם מדיום הגידול (איור 1 א').
PHH, אשר בדרך כלל יציבים רק כמות מוגבלת של זמן במערכות תרבות קונבנציונאלי, יכול להישמר פונקציונלית במשך פרקי זמן ארוכים. אלבומין האנושי, אשר מופרש על ידי hepatocytes פונקציונלי, והוא נחשב הסמן הטוב ביותר על ההערכה של מטבוליזם בכבד, stably, מאוד מבוטא על ידי תרבויות 3D עד היום 40 פוסט-זריעה (איור 2). עבור cocultures, Kupffer תא הפונקציונליות ואת הכדאיות יכול להיות מוערך על ידי הפרשת ציטוקינים ספציפיים (למשל, IL6 ו TNFα). למדידת ייצור ציטוקינים, מומלץ השימוש באמצעי זיהוי מבוסס-לכידת על LPS-גירוי של cocultures (איור 3).
תאים יוצרים microtissues הכבד, בדרך כלל תוך 3 ימים של זריעה של PHH, הוכחת פונקציונלי. מרה canaliculi, התא מלא קיטוב (איור 2). בנוסף תמך חילוף החומרים הסלולר פיזיולוגיים שלהם, תרבויות אלה הופכים במיוחד לזיהומים HBV. HBV DNA וסמנים ויראליות אחרות, בניגוד למערכות אחרות תרבות, להפוך בקלות לזיהוי מזיהום שלאחר יום 2 (איור 4). בנוסף מופרשים סמנים של זיהום נגיפי, פיגומים המכילות hepatocyte יכול להיות מאוחזר התרבויות ומשמש immunofluorescence איתור אנטיגנים ויראלי (למשל, HBsAg, HBcAg) (איור 4). כאשר תרבויות hepatocyte המקובלת דורשים חיסון עם ג ' נרל אלקטריק לפחות 500 HBV לכל תא, על התוספת של 2% דימתיל סולפוקסיד ו 4% פג, גם 0.05 HBV ג ' נרל אלקטריק בהיקף מסוגלים ליזום זיהום בתרבויות תלת-ממדי ללא הדרישה של דימתיל סולפוקסיד או PEG (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> איור 1: הקמה של תרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממדי. () זה סכמטית פריסה עבור ההרכבה של צלחת תרבות כדי להבטיח את הקמתה של מחזור הדם microfluidic. (b) לוח זה מציג מבט מקרוב על הבארות תרבות, כולל נייר סינון לגרדום, הטבעת הסגירה. (ג) לוח זה מראה את התהליך של צלחת equilibration לפני זריעה התרבויות. הלוחות שני הבא להראות את התהליך של זריעה עבור monocultures hepatocyte (ד) ו- (e) hepatocyte/Kupffer תא cocultures. (f) לוח זה מראה את השלבים כביסה מעורבת בינונית שינויים. (g) לוח זה מראה את הסידור זיהום HBV, לרבות הסרת inoculum. ש. מ. = בינוני זריעה, ועותרת = תחזוקה בינוני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> איור 2: הכדאיות היווצרות של hepatocyte הכבד microtissue. לוח זה () מציג תמונות האורך brightfield של monocultures 3D hepatocyte הוכחת היווצרות microtissue בעקבות זריעה. (b) לוח זה מראה immunofluorescence הדמיה של תרבויות עבור גרעינים (כחול), אנושי אלבומין (ירוק). (ג) לוח זה מראה האורך הכולל אלבומין, כמו גם בכל תא מותאם ייצור אלבומין, במהלך 40 ימים של hepatocyte monocultures, כפי שנקבע על ידי אליסה. הנתונים המוצגים הינם SD. זאת אומרת ± דמות זו מותאמת אורטגה-פרייטו ואח '4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> איור 3: Kupffer תא פונקציונליות תלת-ממדי cocultures. לוחות אלה מציגות את הפרשת () IL6 ואת (b) TNFα ב- hepatocyte monocultures, hepatocyte/Kupffer תא cocultures 11 ימים שלאחר זריעה בתגובה LPS exogenously נוסף-יום 9 פוסט זריעה, כפי שנקבע באמצעות האדם מגנטי Luminex assay. דמות זו מותאמת אורטגה-פרייטו ואח '4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> איור 4: HBV זיהום בתרבויות הכבד-על-שבב- () לוח זה מציג זיהוי מיקרוסקופ immunofluorescence HBcAg (אדום), HBsAg (ירוק), גרעינים (כחול) 10 ימים בעקבות הזיהום של התרבויות עם HBV. (b) לוח זה מראה את הרגישות של התרבויות לזיהום HBV באמצעות multiplicities שונות של זיהום, כפי שיקבע על כימות של HBV DNA ב supernatants התרבות. (ג) לוח זה מציג כימות של הצטברות האורך של HBV pgRNA ביחס הגן משק בית RPS11. הנתונים המוצגים הינם SD. זאת אומרת ± דמות זו מותאמת אורטגה-פרייטו ואח '4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע ניסויים זיהום "כבד-על-שבב" תלת-ממדי עם הנגיף הפטיטיס B.

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בזיהומים hepatotropic ושדות מחלת כבד. כגון תרומתן של אוכלוסיות תאים תושבות כבד, לפתוגנזה ויראלית, קינטיקה של זיהום אורך, מנגנונים של שכפול ויראלי, פלישה חיסונית, במערכת מודל פיזיולוגית ובדיקות סמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לכבוש מחדש microenvironment בשבח.אשר יכול להישמר לפרקי זמן ממושכים והוא רגיש באופן טבעי לזיהום הפטיטיס B ברמות רלוונטיות פיזיולוגיות. זה היה בעבר אילוץ בסיסי בשדה הפטיטיס B. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת טיפול או אבחון של זיהום HBV כי מחקרים בדיקות סמים יכול להתבצע בפלטפורמה פיזיולוגית עבור משכי זמן ארוכים.זה מאפשר הערכה של טיפולים תרופתיים רציפים לצד ניתוח היעילות של אסטרטגיות טיפול קיימות ורומן. שיטה זו יכולה לספק הבנה לתוך הפטיטיס B, והוא יכול להיות מיושם גם על מחקרים אחרים של המחלה, כולל זיהומים hepatotropic אחרים, מחלות כבד, או מחקרים חילוף החומרים של התרופה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, כי זה דורש תשומת לב לפרטים מסוימים כדי לאפשר תחזוקה מוצלחת של רקמת הכבד במשך פרקי זמן ארוכים.וגם היכרות עם הכלים והציוד המיוחדים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. כולל הרכבה של הצלחות, כמו גם הפשרה זרע של התאים.מאז צעדים המעורבים בתרבות ארוכת הטווח של תאים שמקורם בכבד הם מאתגרים בעת שימוש במערכת תרבות חדשנית. ראשית, הפעל הן את המדחס והן את משאבת הוואקום הקשורה לפלטפורמת שבבי הכבד. המשיכו לארון צינור זכוכית כדי להרכיב ולהאיב את הצלחות.מניחים קרום סטרילי על בסיס הלוח כדי להתחיל בהרכבה בלתי מיומנות של הלוחות המיקרופלואידיים. מוודאים שהממברנה הסטרילית מונחת בצורה חלקה על שני הפינים של לוחית הבסיס. לאחר מכן הוסיפו את הצלחת העליונה המכילה היטב.מוסיפים מכסה צלחת סטרילי. ולהשתמש במומנט דיוק אוטומטי, מוגדר ל 33 ק"ג. באמצעות רצף הידוק ספירלי להדק את הברגים בבסיס הצלחת.באמצעות ממנט ידני, ודא שכל הברגים מהודקים ל-35 פאונד. לאחר מכן, מחממים מראש את זריעת ההפטוציט בינונית עד 37 מעלות צלזיוס לפני ההטיה. מניחים את הצלחת שהורכבה לחלוטין ברציף הכביסה.ותוודא שהצלחת תישבר לגמרי. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מדיום זריעת hepatocyte לצד המאגר של כל באר כדי להפוך את הצלחת. לאחר מכן, ליזום זרימה בכיוון כלפי מעלה במשך 3.5 דקות ב microliter אחד לשנייה.האינדיקטורים האדומים בצד הצלחת יציינו אם זרימת המיקרופלואידית מתפקדת כראוי. לאחר המדיום נשאב לצד צמיחת התא של הצלחת, להוסיף 1.2 מיליליטר נוספים של מדיום זריעת hepatocyte. מעבירים בזהירות את הצלחת לתחנת העגינה בתוך אינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.ליזום זרימה בכיוון כלפי מעלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה במשך 16 שעות. לאחר מכן, מעבירים את הצלחת לרציף כביסה. בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לחסל את כל הבועות.באמצעות מדפים סטריליים, הוסף נייר סינון עגול סטרילי לכל באר. לאחר מכן הוסיפו פיגום עם חיבור תא וטבעת שמירה לכל באר. השתמש בוכנה סטרילית לדחוף למטה כל באר ולנעול את הטבעות תמך פיגומים למקומם.לאחר מכן, שאף את כל המדיום. ומוסיפים בעדינות 400 מיקרוליטרים של זריעת הפטוציט מחוממת מראש על הפיגום. ליזום זרימה בכיוון כלפי מטה ב microliter אחד לשנייה במשך 3 1/2 דקות.שאפו את כל המדיום נשאב מהצד המאגר של הצלחת. הוסף 1.4 מיליליטר של זריעת hepatocyte בינוני לכל באר. לאחר מכן להחזיר את הצלחת לרציף להביא את הנפח הכולל ל הבאר עד 1.6 מיליליטר.ראשית, מחממים מראש את מדיום ההפשרה של ההפטוציט ואת זריעת ההפטוציט בינונית עד 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להפשיר בקבוקון אחד של hepatocytes האדם העיקרי על פי הוראות הספק. בארון צינור זכוכית, תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיום זריעת הפטוציט.לאחר מכן מניחים את התאים המתווסכלים על קרח. באמצעות כחול טריפאן, ספור את התאים כדי להבטיח שהכדאיות של התאים היא מעל 90%העבר את הצלחת שהורכבה במלואה לרציף הכביסה. ושוכם את כל המדיום מה בארות.לאחזר את התאים מהקרח, ולהוסיף 600, 000 hepatocytes לכל באר בנפח 500 מיקרוליטר של מדיום זריעת hepatocyte. ליזום זרימה בכיוון כלפי מטה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה. הוסף 900 מיקרוליטרים של זריעת hepatocyte בינוני לכל באר כדי להביא את הנפח הכולל בכל אחד 1.6 מיליליטר.מעבירים את הצלחת לתחנת העגינה בתוך אינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. ליזום זרימה בכיוון כלפי מטה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה במשך שמונה שעות. לאחר מכן, הפוך את הזרימה לכיוון כלפי מעלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה למשך שמונה שעות.לאחר מכן מעבירים את הצלחת לרציף הכביסה, ושוטפים את כל המדיום מה בארות. הוסף 400 מיקרוליטרים של אמצעי תחזוקה hepatocyte לכל באר. וליזום זרימה בכיוון כלפי מטה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה למשך 3 וחצי דקות.לאחר מכן, שאפו את כל המדיום מהמאגר, והוסיפו 1.4 מיליליטר של מדיום תחזוקת הפטוציט. מעבירים את הצלחת לתחנת העגינה בתוך אינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. ליזום זרימה בכיוון כלפי מעלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה במשך 48 שעות.לאחר 48 שעות, לשטוף את הצלחת על ידי העברתו לרציף הכביסה. שאף את כל המדיום מה בארות. ותוסיף 400 מיקרוליטרים של אמצעי תחזוקה.וליזום זרימה בכיוון כלפי מטה במיקרוליטר אחד לשנייה למשך 3.5 דקות. ואז שאף את כל המדיום המופיע בצד המאגר של בארות. הוסף 1.4 מיליליטר של מדיום תחזוקה hepatocyte.ואז להעביר את הצלחת בחזרה לתחנת העגינה באינקובטור לח. ליזום זרימה בכיוון כלפי מעלה בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשנייה במשך 48 שעות. החלף את המדיום באמצעות תהליך שטיפה והחלפה זה כל 48 שעות.hepatocytes האנושי העיקרי הם בדרך כלל רק יציב במשך כמות מוגבלת של זמן בעת שימוש במערכות תרבות קונבנציונליות. עם זאת, באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, הם יכולים להישמר באופן פונקציונלי לפרקי זמן ארוכים. אלבומין אנושי מופרש על ידי hepatocytes פונקציונלי, והוא נחשב הסמן הטוב ביותר להערכת תפקודי hepatic.אלבומין נתפס להיות דקירה מאוד לידי ביטוי על ידי תרבויות 3D עד לפחות יום 40 לאחר הזריעה. עבור תרבויות אחרות, הפונקציונליות והכדאיות של תאי קופפר מוערכות על ידי מדידת הפרשת ציטוקיניות ספציפיות. כפי שניתן לראות כאן, הרמות הנמדדות של IL-6 ו- TNF אלפא מצביעות על כך שהתאים נשמרו באופן תפקודי ובר קיימא.בנוסף לשמירה על חילוף החומרים התאי הפיזיולוגי שלהם, תרבויות אלה הפכו רגישים במיוחד לזיהום HBV. דנ"א HBV וסמנים ויראליים אחרים ניתנים לזיהוי בקלות מהיום השני שלאחר ההדבקה. בעוד תרבויות קונבנציונליות דורשות חיסון עם לפחות 500 HBV המקבילות הגנום בתוספת DMSO ו PEG, תרבויות 3D אלה נגועים עם מעט כמו 05 מקבילות גנום unsupplemented.בנוסף לסמנים מופרשים של זיהום ויראלי, פיגומים המכילים hepatocyte מאוחזרים מתרבויות אלה. מיקרוסקופיה Immunofluorescence מגלה כי פיגומים אלה מכילים אנטיגנים ויראליים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עדין בעת טיפול hepatocytes לפני הזריעה כדי למנוע מוות של תאים.בנוסף, חיוני לוודא כי הלוחות מורכבים כראוי וכל ערוצי הזרימה מאפשרים זרימת מדיה נכונה לפני זריעת hepatocytes. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו שפעת חיסונית על מנת לענות על שאלות נוספות. כולל המיקום והתדירות של תאים נגועים בתוך הרקמה.המצב הפיזיולוגי של hepatocytes ניתן להעריך גם על ידי כתמים עבור אלבומין או מבנים בהיפוך כולל חלבון צומת הדוק ZO-1. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הווירולוגיה לחקור זיהום הפטיטיס B ותגובות חיסוניות במערכת מודל תלת מימד פיזיולוגית. אל תשכח כי עבודה עם וירוס הפטיטיס B יכול להיות מסוכן, ואמצעי זהירות כגון חיסון קודם, השימוש PPE המתאים, ועובד תחת הנחיות בטיחות ביולוגית מתאימות תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

liver-on-chip-cultures-primary-hepatocytes-kupffer-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

כאן אנו מתארים מערכת הכתב החדש שפותח הפטיטיס B וירוס (HBV) לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור החיים HBV. זה פשוט יותר במערכת במבחנה יסייע ההקרנה של תרופות אנטי-HBV משתמש באסטרטגיה תפוקה גבוהה.

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

כאן, אנו מציגים גישה האנזימטית לבודד hepatocytes העיקרי של עכברים בוגרים, ואנחנו מתארים כימות של תגובה דלקתית באמצעות ELISA ו- בזמן אמת PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

הציג כאן הוא פרוטוקול לדיכוי יעיל של צהבת B וירוס (HBV) שכפול בעכברים על ידי ניצול התא המאמצת העברה (ACT) של תא גזע הנגזר אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי לימפוציטים T. הליך זה עשוי להיות מותאם לטיפול חיסוני מבוסס-חוק של זיהום HBV.

גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור הפטיטיס B וירוס (HBV) זיהום בתאי 293T מהונדסים הרומן (293T-NE-3NRs, הבעת NTCP אנושי, HNF4α, RXRα ו PPARα) ותאי הכבד המסורתית (HepG2-NE, ביטוי האדם NTCP).

דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

מערכת תרבות אורגנויד חוץ גופית חוץ גופית ארוכת טווח הוקמה מהפטוציטים של עכברים. אורגנוידים אלה ניתן לעבור מניפולציה גנטית על ידי זיהום lentivirus של בנייה shRNA / חוץ רחמי, transfection siRNA והנדסת CRISPR-Cas9.

מניפולציה ממסדית וגנטית של אורגנוידים של מורין הפטוציט

אנו מציגים פרוטוקול לסינון תרכובות נגד נגיף הפטיטיס B (HBV) המכוונות לשלבי מחזור החיים של הכניסה לפני ואחרי הנגיף, תוך שימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית למדידת זיקה קושרת (KD) עם פוליפפטיד קו-טרנספורטינג של נתרן טאורוכולאט מארח. היעילות האנטי-ויראלית נקבעה באמצעות דיכוי סמני מחזור חיים נגיפיים (היווצרות cccDNA, שעתוק והרכבה ויראלית).

מודל הפטוציטים מוסמך הבוחן את כניסת נגיף הפטיטיס B דרך נתרן טאורוחולאט קוטרנספורטינג פוליפפטיד כמטרה טיפולית

כאן אנו מציגים שיטה לא גנטית ליצירת ספרואידים אוטולוגיים אנושיים בכבד באמצעות תאים חד-גרעיניים שבודדו מדם היקפי במצב יציב.

ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד

כאן אנו מתארים פלטפורמה המאפשרת הדמיה לא פולשנית in vivo של ספרואידים בכבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר. תהליך העבודה משתרע מיצירת ספרואידים מתאי כבד ראשוניים להשתלה בעין העכבר והדמיית in vivo ברזולוציה תאית במיקרוסקופ קונפוקלי.

In Vivo הדמיה של כדורי כבד המושתלים בחדר הקדמי של עין העכבר

פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

חקור מודל כבד-על-שבב תלת-ממדי לזיהום נגיף הפטיטיס B באמצעות תרביות hepatocytes ותאי Kupffer. שיטה זו מאפשרת מחקר ממושך של קינטיקת זיהום ומנגנוני שכפול ויראלי בדגם פיזיולוגי.

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

גלה סרטונים נוספים