Name: ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: למדו לנתח מחזור תאים בשורש הזרע של C. elegans באמצעות EdU, שיטה ללא טרנסגנים התואמת לצביעת אימונופלואורסצנציה. חקירה זו מאפשרת מחקר דינמיקת תאים בתנאים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו מודים למרכז מניות של e. coli MG1693; Wormbase; המרכז גנטיקה Caenorhabditis אשר ממומן על ידי נבחרת מוסדות של בריאות של מחקר תשתית בתוכניות Office (P40OD010440) עבור זנים; זאק פינקוס לייעוץ סטטיסטי; פנג Aiping עבור ריאגנטים; לוק שניידר, אנדריאה שרף, סנדיפ קומאר, ג'ון ברנר עבור הדרכה, ייעוץ, תמיכה דיון מועיל; המעבדות קורנפלד, Schedl למשוב על כתב היד הזה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R01 AG02656106A1 כדי KK, R01 GM100756 ל TS], מלגת predoctoral הלאומית למדע [DGE-1143954 ו DGE-1745038 כדי ZK]. מכוני הבריאות הלאומיים וגם הקרן הלאומית למדע היה כל תפקיד בעיצוב של המחקר, איסוף, ניתוח ופרשנות של נתונים, ולא בכתב היד.

<ol><li>Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+and+CDK-2+regulate+proliferative+cell+fate+and+cell+cycle+progression+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline.</a> Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).</li>
<li>Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+analyses+of+the+mitotic+region+in+the+Caenorhabditis+elegans+adult+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line.</a> Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).</li>
<li>Seidel, H. S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+quiescence+maintains+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cells+independent+of+GLP-1%2FNotch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).</li>
<li>Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+accumulation+of+the+proliferating+cell+nuclear+antigen+PCN-1+transitions+from+continuous+in+the+adult+germline+to+intermittent+in+the+early+embryo+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+Cell+Cycle+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">elegans Cell Cycle Analysis.</a> Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).</li>
<li>ThermoFisher. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Click-iT+EdU+Imaging+Kits%22">Click-iT EdU Imaging Kits</a>. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).</li>
<li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPazdernik%2C+N+%22Germ+Cell+Development+in+C.+elegans%22">Germ Cell Development in C. elegans</a>. , Springer. 1-16 (2013).</li>
<li>Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+reproductive+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hansen, D., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+proliferation+versus+meiotic+fate+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+of+S+phases%2C+X+chromosome+replication%2C+and+meiotic+prophase+in+the+C.+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line.</a> Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).</li>
<li>Agarwal, I., Farnow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOP-1+presenilin+deficiency+causes+a+late-onset+notch+signaling+phenotype+that+affects+adult+germline+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).</li>
<li>Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+Caenorhabditis+elegans+hermaphrodite+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline.</a> Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).</li>
<li>Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).</li>
<li>Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsis+and+chiasma+formation+in+Caenorhabditis+elegans+require+HIM-3%2C+a+meiotic+chromosome+core+component+that+functions+in+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation.</a> Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).</li>
<li>Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).</li>
<li>Crawley, O., Barroso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin-interacting+protein+WAPL-1+regulates+meiotic+chromosome+structure+and+cohesion+by+antagonizing+specific+cohesin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes.</a> eLife. 5 (2), 1-26 (2016).</li>
<li>Zhao, H., Halicka, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+signaling%2C+impairment+of+cell+cycle+progression%2C+and+apoptosis+triggered+by+5-ethynyl-2%E2%80%B2-deoxyuridine+incorporated+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA.</a> Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+C.+elegans+Germline.+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK.</a> in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).</li>
<li>Vos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVos%2C+K+%22De+Cell+Counter+Plugin%22">De Cell Counter Plugin</a>. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rasband, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+W+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).</li>
<li>Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+promotes+germline+proliferation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans.</a> Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).</li>
<li>Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-autonomous+DAF-16%2FFOXO+activity+antagonizes+age-related+loss+of+C.+elegans+germline+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Nature communications. 6 (5), 7107(2015).</li>
<li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFB+and+Insulin+Signaling+Regulate+Reproductive+Aging+via+Oocyte+and+Germline+Quality+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance.</a> Cell. 143 (2), 299-312 (2010).</li>
<li>Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-18%2FPTEN+locally+antagonizes+insulin+signalling+to+couple+germline+stem+cell+proliferation+to+oocyte+needs+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans.</a> Development. , 4230-4241 (2015).</li>
<li>Cinquin, A., Chiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+Stem+Cell+Cycling+Balances+Self-Renewal+and%5BTitle%5D)+AND+%22Senescence+of+the+C.+elegans+Germ+Line.+PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and.</a> Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Invitrogen+EdU+%285-ethynyl-2%E2%80%99-deoxyuridine%29%22">Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)</a>. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).</li>
<li>Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+Detection+of+Two+Thymidine+Analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+Primary+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הכנה של חיידקים התווית על-ידי אדו (שלב 1) היא קריטית עבור פרוטוקול זה, ואת הנקודה הראשונה לפתרון. אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים פראי-סוג תווית בצורה אמינה במיוחד ב ה 4 אדו-דופק, שהופך את פקד שימושי עבור כל אצווה חדשה של חיידקים התווית על-ידי אדו. בנוסף, חיידקים התווית על-ידי עידו ללא פגע מזין את המעי (ב בוגרים בעלי חיים או מוטציות פגום מסוים הלוע/מטחנה) תווית עם לחץ על כימיה, מופיעים בהיר מלבני puncta בבטן. טכניקה חלופית עבור תיוג אנדרוגינוסים משתמש "טבילה" ריכוז גבוה (1 מ מ) של אדו3. טכניקה זו מרע...

התפתחות בעלי חיים, מאות, אלפים, מיליונים, ביליונים או אפילו. טריליוני חלוקות תאים נדרשים כדי ליצור האורגניזם למבוגרים. מחזור התא, קבוצת הסלולר אירועים מורכב G1 (מרווח), S (סינתזה), G2 (מרווח), M (מיטוזה) מגדירים את סדרת אירועים להורג כל חלוקת התא. מחזור התא הוא דינמי ומוערכת ביותר בזמן אמת, אשר יכול להיות קשה מבחינה טכנית. טכניקות הוצג פרוטוקול זה מאפשר אחד להפוך את המידות של השלבים והתזמון של מחזור התא מתמונות סטילס.
תיוג עם תחליפי nucleoside כגון 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) או 5-ברומו-2'-deoxyuridine (BrdU) הוא תקן זהב כדי לזהות שלב S במחקרים של מחזור התא דינאמיקה של מבוגר Caenorhabditis elegans (C. elegans) אנדרוגינוס germline1,2,3,4,5. עידו והן BrdU יכול לשמש כמעט כל רקע גנטי, הם אינם סומכים על כל מבנה גנטי. להמחיש BrdU דורש טיפול כימי קשה לחשוף אנטיגן של נוגדן anti-BrdU מכתים, אשר לעתים קרובות אינו תואם ההערכה של סמנים אחרים התאית דמיינו ידי מכתימה במשותף עם נוגדנים נוספים. לעומת זאת, להמחיש אדו מתרחשת על ידי לחץ כימיה בתנאים מתון, ובכך הוא תואם עם נוגדן משותפת מכתים6,7.
ייחודה של התווית ברור, מאז גרעינים לשלב רק אנלוגים (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) תימידין לתוך ה-DNA במהלך שלב S. ויזואליזציה מתקיים בתוך הרקמה קבוע. התווית אדו הוא בלתי נראה בפני עצמו עד אזיד המכילים צבען או fluorophore מגיב covalently אלקין באדו על ידי לחץ מזורז נחושת כימיה8. עידו תיוג יכול לספק מידע מיידי שבו הגרעינים הם שלב S, באמצעות דופק קצר של תיוג. EdU יכולים גם לספק מידע דינמי, באמצעות הדופק. צ'ייס או תיוג רציפה; לדוגמה, בניסוי דופק. צ'ייס, התווית הוא מדולל-כל חלוקת התא או הופץ תאים כמו nondividing, ההתקדמות בפיתוח.
Germline אנדרוגינוס C. elegans הוא מערכת מודל רב עוצמה עבור הלימודים של איתות המסלולים, תאי גזע, מיוזה, מחזור התא. Germline למבוגרים הוא קו הרכבה מקוטב עם תאי גזע בקצה הדיסטלי ואחריו ערך וההתקדמות דרך prophase meiotic, בתיאום עם השלבים של gametogenesis יותר הציר הקרוב (איור 1). בסוף צינתור, oocytes מבוגרים, הם ovulated, מופרית ולהתחיל מופרה הרחם9,10,11. אזור זמן ~ 20 תא-קוטר ליד התא עצה הדיסטלי, אשר כולל הגבעול germline mitotically אופניים, ובתאים תאים S-שלב meiotic אבל לא התאים meiotic prophase, נקרא קדמון אזור2,4 , 9 , 12. קרום התא לספק הפרדה לא שלם בין האטומים ב germline דיסטלי, אבל אזור ובתאים עוברים תא mitotic רכיבה על אופניים במידה רבה באופן עצמאי. משך מחזור התא mitotic החציוני germline ובתאים אזור של אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים הוא ~6.5 h; שלב G1 הוא קצר או נעדר, ואת תרדמה לא נצפית1,2,13. התמיינות תאי גזע Germline מתרחשת דרך בידול ישיר במהותו, ובכך חסרה הגברה-טרנזיט חטיבות4. במהלך התמיינות בשלב pachytene, כ 4 מתוך 5 גרעינים לא יהוו oocytes אך במקום עוברים אפופטוזיס, מתנהג כמו האחות תאים על-ידי תרומת התוכן cytoplasmic שלהם כדי מתפתח oocyte12,14 , 15.
בנוסף תאי תיוג בשלב-S עם תחליפי nucleoside, ניתן לזהות את התאים מיטוזה, מיוזה באמצעות נוגדן מכתים. גרעינים של מיטוזה הם immunoreactive ל H3 אנטי-פוספו-היסטון7,(Ser10) נוגדנים (נקרא pH3)16. גרעינים של מיוזה הם immunoreactive נוגדן anti-לו-3 (ציר כרומוזום meiotic חלבון)17. הגרעינים באזור קדמון יכול להיות מזוהה על ידי העדר לו-3, הנוכחות של REC-8 nucleoplasmic18או הנוכחות של WAPL-119. WAPL-1 עוצמת הוא הגבוה ביותר בלוטת המין הסומטית, גבוה באזור ' קדמון ', ונמוך במהלך המוקדמות meiotic prophases19. מדידות מחזור התא מספר אפשריות עם כמה וריאציות של הפרוטוקול: אני) לזהות את הגרעינים בשלב-S ולמדוד את מדד S-שלב; II) לזהות את הגרעינים בשלב-M ולמדוד את האינדקס M-שלב; III) לקבוע אם הגרעינים היו בשלב mitotic או meiotic S; IV) למדוד את משך G2; V) מודד duartion G2 + M + G1 שלבים; VI) למדוד את קצב הכניסה meiotic; VII) הערכת קצב התקדמות meiotic.
אפשר להכין מספר מידות מחזור התא רק כמה סוגי רטוב-מעבדת ניסויים. להלן הפרוטוקול מתאר של תיוג דופק 30 דקות על ידי האכלה C. elegans אנדרוגינוסים למבוגרים עם עידו שכותרתו חיידקים ותאים M-פאזי תיוג במשותף על ידי צביעת עם נוגדן anti-pH3 ו קדמון אזור תאים על ידי צביעת עם נוגדן anti-WAPL-1. שינויים רק משך הזמן של עידו להאכיל (שלב 2.5), סוג של נוגדנים המועסקים (שלב 5) ולאחר ניתוחים (שלב 8.3) נדרשים עבור המדידות נוספים.

<table><tbody><tr><td>E. coli MG1693coli</td> <td>Genetic Stock Center</td><td>6411</td><td>גדל בסדר גמור ב-LB</td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>emCaenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>900584-50MG</td><td>או השתמש ב-EdU המסופק בערכה</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>D9434-500G</td><td>D-(+)-דקסטרוז</td></tr><tr><td>תיאמין (ויטמין B1)</td> <td>סיגמא</td><td>T4625-5G</td><td>ריאגנט</td></tr><tr><td>כיתה תימידין</td><td>סיגמא</td><td>T1895-1G</td><td>BioReagent</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטהידראט</td><td>סיגמא</td><td>M1880-1KG</td><td>MgSO4, נתרן פוספט בדרגת ריאגנט</td></tr>, <tr><td>דיבסקי</td><td></td><td>, נטול מיםBP332-500G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, סיגמא חד-בסיסי</td><td></td><td>P5379-500G</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>A4514-500G</td><td>NH4Cl, מגיב בתוספת</td></tr><tr><td>אגר בקטריולוגי</td><td>ארה"ב C13071058</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביולוגי סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא</td><td>C3881-500G</td><td>CaCl</td></tr><tr><td>LB מרק (מילר)</td><td>סיגמא</td><td>L3522-1KG</td><td>בשימוש ב 25 גרם/ליטר</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756-5G</td><td>0.241 גרם/10 מ"ל</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Calbiochem Omnipur</td><td>6506</td><td>PBS תוצרת בית עובד באותה מידה</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde, אמפולות בדרגת EM</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td>10 מ"ל אמפולות</td></tr><tr><td>100% מתנול</td>מתנול תווית זהב של <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A454-1L</td><td>הוא קריטי למורפולוגיה תקינה עם נוגדנים מסוימים</td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td>Lot 1671330</td></tr><tr><td>rabbit-anti-WAPL-1</td><td>Novus biologicals</td><td>49300002</td><td>Lot G3048-179A02, בשימוש ב 1:2000</td></tr><tr><td>שיבוט עכבר-אנטי-pH3 3H10</td><td>Millipore</td><td>05-806</td><td>Lot#2680533, בשימוש בשעה 1:500</td></tr><tr><td>עז-אנטי-ארנב מצומד IgG Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Lot 1256147, בשימוש ב-1:400</td></tr><tr><td>עז-אנטי-עכבר מצומד IgG Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Lot 1511347, בשימוש ב-1:400</td></tr><tr><td>Vectashield antifade מדיום הרכבה המכיל 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>ניתן להשתמש במקום זאת במדיום הרכבה ללא DAPI, בעקבות לק דגירה נפרד של DAPI</td></tr><tr><td></td><td>Wet n Wild</td><td>DTC450B</td><td>כל לק שקוף אמור לעבוד</td></tr><tr><td>S-medium</td><td>שונים</td><td></td><td>ראה wormbook.org עבור פרוטוקול</td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>שונים</td><td></td><td>ראה wormbook.org לפרוטוקול</td></tr><tr><td>M9 אגר</td><td>שונה</td><td></td><td>מתכון זהה למאגר M9, אך הוסף 1.7% אגר</td></tr><tr><td>מדיום גידול נמטודה</td><td>שונים</td><td></td><td>ראה wormbook.org לפרוטוקול</td></tr><tr><td>ניתוח זכוכית שעון</td><td>קרולינה ביולוגי</td><td>42300</td><td></td></tr><tr><td>סרט מעבדה פרפילם</td><td>Pechiney פלסטיק</td><td>אריזות PM-996</td><td>4 אינץ 'רחב סרט מעבדה</td></tr><tr><td>צלחות</td><td></td><td></td> פטרי <td>קוטר 60 מ"מ</td></tr><tr><td>זכוכית ארוכה פסטר פיפטות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 1 מ"ל</td><td>MidSci Avant</td><td>2926</td><td></td></tr><tr><td>טיפים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל בקבוק</td><td></td><td></td><td></td>ארלנמאייר</tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td><td></td>אלומיניום</tr><tr><td>25 גרם מחטים 5/8 אינץ'</td><td>BD PrecisionGlide&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>305122 צינור צנטריפוגה מזכוכית 5 מ"ל</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות זכוכית בורוסיליקט 1 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>לא 1 כיסויים 22 x 40 מ"מ</td><td></td><td></td><td>לא 1.5 עשויים לעבוד, גם</td></tr><tr><td>37 & deg; C שייקר אינקובטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחנית צנטריפוגה קלינית</td><td>IEC</td><td>428</td><td>עם 6 רוטור דלי מתנדנד</td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 & deg; אינקובטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C 4 & deg; מקרר</td><td></td><td></td><td></td> C</tr> <tr><td>-20 & deg; מקפיא</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>Observer Z1 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 63X 1.4 עדשת אובייקטיבית לטבילה בשמן</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraview Vox מערכת קונפוקלית דיסק מסתובב</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td></td><td>מערכת קונפוקלית של דיסק מסתובב של ניקון עובדת טוב מאוד, גם, כמתואר כאן: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ניתוח מחזור התא c. elegans germline עם עידו אנלוגי תימידין

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

ניתוח מחזור התא פרוקריוטים מנצל לעתים קרובות כרומוזום מורפולוגיה, ביטוי ו/או לוקליזציה של ג'ין המוצרים הנדרשים עבור שלבים שונים של מחזור התא, או שילוב של תחליפי nucleoside. במהלך שלב זה, ה-DNA polymerases לשלב תימידין תחליפי כגון EdU או BrdU בהכפלת ה-DNA, לסמן את התאים עבור ניתוח. עבור C. elegans, nucleoside אדו אנלוגית היא שתתה את התולעים במהלך תרבות קבוע והוא תואם עם טכניקות immunofluorescent. Germline של C. elegans היא מערכת מודל רב עוצמה עבור הלימודים של איתות המסלולים, תאי גזע, מיוזה, מחזור התא כי זה שקוף, נתיישב גנטית, meiotic prophase, בידול הסלולר/gametogenesis מתרחשים הרכבה דמוי ליניארי. תכונות אלה להפוך אדו כלי נהדר ללמוד היבטים דינמיים של תאים mitotically אופניים ופיתוח germline. פרוטוקול זה מתאר את אופן בהצלחה להכין חיידקים אדו, להאכיל בהם פראי-סוג C. elegans אנדרוגינוסים, לנתח את בלוטת המין אנדרוגינוס, כתם על התאגדות אדו לתוך ה-DNA, כתם עם נוגדנים כדי לזהות את מחזור התא השונים, סמנים התפתחותית, תמונה של בלוטת המין ולנתח את התוצאות. הפרוטוקול מתאר הווריאציות שיטת וניתוח לשקילת S-פאזי אינדקס, M-פאזי אינדקס, G2, משך מחזור התא, בקצב חדירה meiotic ומשך קצב התקדמות meiotic prophase. בשיטה זו ניתן להתאים כדי ללמוד על מחזור התא או היסטוריה תא אחרים רקמות, שלבים, רקע גנטי והתנאים פיזיולוגיים.

מאז לסינתזת DNA נדרש לשלב אדו, ניתן להסיק כי הגרעינים התווית על-ידי עידו עברה שלב S במהלך חלון הזמן תיוג-אדו. אחד יכול לפרש הגרעינים שהמדבקה ב 30 דקות הנקה עם עידו כאנטי חיידקים גרעינים ב S-שלב ביצוע ניתוח. גרעין זה תווית ב עוד רציף אדו האכלה ניסוי עשוי תייגת מוקדם בחלון הזמן ומאז S שמאל-שלב, או ייתכן תייגת בחלק מאוחר של חלון הזמן אדו. עידו אות רגישה במשותף עם דאפי אות. ב כמה גרעינים, אדו אות מכסה כל הכרומוזומים, ואילו בגרעינים אחרים אדו האות. רגישה ל 1-2 puncta בהיר (איור 4</stro...

שיטה מבוססת הדמיה מתואר כי ניתן להשתמש כדי לזהות שלב S ולנתח מחזור התא דינמיקה ב germline אנדרוגינוס C. elegans באמצעות של תימידין אדו אנלוגי. שיטה זו דורשת לא transgenes והוא תואם עם immunofluorescent מכתים.

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על מחזור התא ודינמיקה אוכלוסיית תאי גזע קו נבט ב C.elegans. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת מהונדסים, היא תואמת לכתמים immunofluorescent, ו ניתן לשנות אותה כדי לחקור תאים בתנאים רבים ושונים. התרגשתי מאוד כשראיתי לראשונה את השיטה הזו בשימוש במעבדת שדה.למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך מחזור התא C.elegans, זה יכול להיות מיושם גם על שאלות רחבות יותר על הזדקנות, תזונה, או גנוטיפים משתנים. בדרך כלל מעבדות חדשות לשיטה זו עשויות להיאבק עם idiodisprepation הראשונית או כתם המטוקסילין C.elegans. התחל באמצעות טכניקה סטרילית להוסיף 200 microliters של 10 מילימולרים EdU ב 100 מיליליטר של מאגר M9 ואת התוספים המתאימים ארבעה מיליליטר של תרבות MG 1693 E.coli טרי.ביצוע idiodiscious דורש איזון עדין בין EdU ותוספת תימדין. כמו כמות התימידין חייב להיות מספיק עבור קולי E לגדול היטב, בעוד כמות EdU חייב להיות מספיק עבור המגן החזק מפני החלקה. לאחר לא יותר מ 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד, להשתמש בטכניקה סטרילית כדי לפצל את התרבות בין שניים לארבעה סטרילי 50 צינורות חרוט מיליליטר עבור צנטריפוגה.תן שימוש חוזר בפלטין ארבעה מיליליטר של חיץ M9 טרי ולהשתמש באותה פיפטה כדי להחיל על 8 טיפות של פתרון E Coli MG1693 שכותרתו E Coli למרכז טמפרטורת החדר בודדים 60 מיליליטר M9 צלחות פטרי שומר. כדי להאכיל את החיידקים המסווים EdU לנמטודות, השתמש PBS טרי לשטוף את C.Elegans מצלחת בינונית צמיחה nematode לתוך צינור 1.5 מיליליטר ולאפשר לבעלי החיים להתיישב לזמן קצר על ידי כוח הכבידה. לשטוף את בעלי החיים פעם עד פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS ולהשתמש פיפטה פסטור זכוכית להעביר את nematodes למרכז מדשאת EdU בטיפה זעירה של PBS.המתן כמה דקות עד שהנוזל ייקלט ויפגר את התרבות לפחות 30 דקות ב-20 מעלות צלזיוס על פי פרוטוקול הניסוי. בסוף הדגירה, השתמש בשני מיליליטר של PBS כדי לשטוף את התולעים מצלחת התרבות של EdU לתוך צלחת ניתוח זכוכית. לאחר ניתוח וקבוע של גונדות נמטודה כפי שתואר לעיל, לשטוף צינור זכוכית בורוסיליקט מיליליטר קטן אחד פיפטה פסטור זכוכית ארוכה עם PBS בתוספת 0.1% tween 20 ולהשתמש פיפטה להעביר את המצעים קבועים לצינור בכמות קטנה של Tween PBS.לאסוף את gonads על ידי צנטריפוגה ולהשתמש ארוך, שלף את פיפטה מרעה זכוכית כדי להסיר על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולת גונד. לגילוי EdU, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של קוקטייל EdU לחץ על הנקניקיות וכסו את הצינור בסרט מעבדה במשך 30 עד 60 דקות דגירה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את השוטפים פעם אחת עם 100 microLiters של חיץ שטיפה תגובה, וארבע פעמים עם מיליליטר אחד של Tween PBS.לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום בתוספת DAPI למדגם. בזמן שהמדיום מתיישב מעל הקנאדות, מניחים משטח גדול של 2.5% על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית סטנדרטית. ואז לשטח עם שקופית שנייה.לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטור זכוכית ארוכה ולשמור את כל הנוזלים ואת gonads בקצה הצר של פיפטה כדי למזער את אובדן מדגם בעת העברת gonads ל כרית. באמצעות עפעף מודבק קיסם, להפיץ את הישנים על כרית אגרוז ולהסיר את כל חלקיקי אבק. ואז לאט לאט להוריד כיסוי זכוכית מלבני להחליק על הבלוטות, דואג להימנע בועות אוויר, והסרת כל פתרון עודף עם רקמת מעבדה.ספירת תאים בשלושה ממדים דורשת תרגול מסוים. שימוש בתוסף מונה התאים של פיג'י ובקובץ Script כמו מסמן את התאים כדי להסיר כפילויות מסייע להפוך את הספירות לבלתי ניתנות לשחזור. לאחר מתן אפשרות לתלוש הכיסוי להתיישב בן לילה, השתמש בתוסף מונה התאים ובפיג'י כדי לספור באופן ידני כל גרעין, תוך תיוג כל גרעין בודד על פי נוכחות או היעדר תווי תא Phosphohistone שלושה EdU או pregenetor.אות EdU שותף לוקליזציה עם אות DAPI. בגרעין מסוים, אות ה-EdU מכסה את כל הכרומוזומים, ואילו בגרעין אחר, אות ה-EdU מתמקם ל-1-2 פאנקטה בהירה, ככל הנראה על כרומוזום ה-X, המשכפל בשלב מאוחר של שלב ה-S. אות EdU מתווית מוצלחת של 30 דקות לוקליזציה לכמחצית הגרעינים באזור הקדם-גניטור.בעוד הטכניקה פועלת באופן עקבי בבעלי חיים צעירים מסוג בר, חלק ניכר של הרמפרודיטים בני 5 ימים לא מצליח לתייג בדופק EdU של 30 דקות. משך G2 ניתן להעריכה על ידי ניתוח אחוז הגרעינים בשלב M כי הם חיוביים EdU לאורך קורס הזמן, המאפשר חישוב של משך החציון והמקסימום של G2. משך G2 ו- G1 ניתן מוערך מאחוז כל גרעיני אזור pregenetor כי הם חיוביים EdU, המאפשר חישוב של משך הזמן המרבי של השלבים המשולבים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באותה אצווה של מנות EdU כדי למזער את השונות הבין-ניסיונית.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתמים בנוגדנים נוספים או לענות על שאלות נוספות על מחזור התא, גורל התא או מסלולי איתות. אל תשכח כי עבודה עם אנלוגים גרעין parafermeldahyde יכול להיות מסוכן, כי אמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות ניט רול, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

cell-cycle-analysis-c-elegans-germline-with-thymidine-analog

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים לכמת שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. אסטרטגיה זו שימושית כדי לזהות מחזור התא של חיים ארוכים רקמות, שינוי בשעור, או מעבר, הגברה תאים.

איתור Immunofluorescent של שני אנלוגים Thymidine (CldU ו IdU) ברקמה ראשי

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

מנהל של שני אנלוגים של תימידין, edu וBrdU, בעכברים בהריון מאפשר הניתוח של התקדמות מחזור התא בעצבי ובתאים במוח העכבר העוברי. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את ההשפעות של מתח genotoxic, כוללים קרינה מייננת, בהתפתחות המוח.

התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic

כאן, אנו מתארים כיצד לחקור לוקליזציה מיטוכונדריאלית של קינאז (מחזור התא), וכיצד לקבוע את מיקומו התת-מיטוכונדריאלי כמו גם מצעים/מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות. ביטוי מאולץ של חלבונים למיטוכונדריה מספק כלי שימושי לחקר ההשלכות התפקודיות של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של חלבון מעניין.

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

כאן מוצג כיצד לעקוב ולכמת תהליכי התפתחות ב-C. elegans. השיטות המוצגות מבוססות על כלי קוד פתוח הניתנים ליישום בקלות. הוא מודגם כיצד לשחזר מודלים תלת מימדיים בצורת תא, כיצד לעקוב באופן ידני אחר מבנים תת-תאיים וכיצד לנתח זרימת התכווצות קליפת המוח.

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

אנו מדווחים על שני פרוטוקולים של סינכרון תאים המספקים הקשר ללימוד אירועים הקשורים לשלבים ספציפיים של מחזור התא. אנו מראים כי גישה זו שימושית לניתוח הרגולציה של גנים ספציפיים במחזור תאים לא מופרע או בחשיפה לסוכנים המשפיעים על מחזור התא.

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

למדו לנתח מחזור תאים בשורש הזרע של C. elegans באמצעות EdU, שיטה ללא טרנסגנים התואמת לצביעת אימונופלואורסצנציה. חקירה זו מאפשרת מחקר דינמיקת תאים בתנאים שונים.

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

גלה סרטונים נוספים