Name: Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: למדו שיטות תרבית ומניפולציה גנטית של תאי הרכס העצבי O9-1 בעכברים. הפרוטוקולים כוללים siRNA ו-CRISPR-Cas9 לחקר ביולוגיה של תאי עצב ותזונה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ניקול Stancel, Ph.d., ELS, הפרסומים המדעיים במכון הלב טקסס, סיפק תמיכה העריכה. אנו מודים גם את מקורות המימון הבאים: מענק פיתוח של מדען מרכז של איגוד הלב האמריקני הלאומי (14SDG19840000 כדי ג'יי וואנג), לורנס 2014 מחקר פרס Rolanette, Berdon לורנס עצם המחלה תוכנית טקסס (כדי ג'יי וואנג ), ולא את המכונים הלאומיים לבריאות (DE026561 ו- DE025873 ג'יי Wang, DE016320, DE019650 ל ר מקסון).

<ol><li>Achilleos, A., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cells%3A+discovery%2C+properties+and+potential+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy.</a> Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Dupin, E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X03001138">Multipotentiality of the neural crest.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).</li>
<li>Santagati, F., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+neural+crest+and+the+building+of+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cranial neural crest and the building of the vertebrate head.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).</li>
<li>Cordero, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+neural+crest+cells+on+the+move%3A+their+roles+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).</li>
<li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+birth+defects%3A+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).</li>
<li>Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+migrating+into+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The neural crest migrating into the twenty-first century.</a> Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).</li>
<li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quo+vadis%3A+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li>
<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+neural+crest%3A+a+multigene+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li>
<li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+network+during+neural+crest+induction%3A+from+cell+specification+to+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li>
<li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+neural+crest%3A+achieving+specificity+in+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li>
<li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+progenitors+and+stem+cells%3A+from+early+development+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li>
<li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li>
<li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li>
<li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li>
<li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+early+human+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li>
<li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-activated+kinase+1+%28Tak1%29+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
<li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway%3A+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li>
<li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo%2FYap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).</li>
<li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li>
<li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+organ+development%2C+homeostasis%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li>
<li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li>
<li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208(2016).</li>
<li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li>
<li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%2C+but+not+collagen+I%2C+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).</li>
<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li>
<li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

NCC הוא תורם רב-תכליתי, מפתח ברקמות שונות ואיברים במהלך מורפוגנזה עובריים. שורת התאים O9-1 שומרת את הפוטנציאל להתמיין סוגי תאים שונים רבים ולאחר מחקה ויוו מאפייני NCCs, שהופך אותו כלי שימושי במבחנה ללמוד ג'ין פונקציה ורגולציה מולקולרית ב- NCCs. המצב שונה של O9-1 תאים עשויים להתאים הרכס העצבי שונים רומא ויוו, בהתאם לתנאי התרבות של תאים O9-1. תאים O9-1 יכול להישמר במדינה multipotent כאשר תרבותי בתנאים שאינם מבדילים תרבות, דומה לתרבות תאי גזע רגילים. התאים O9-1 שאינם מבדילים יתאימו ל pre-migratory...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

תאי הרכס העצבי (NCCs) הם תאי גזע דמוי multipotent עם יכולת מדהימה נודדות, קיום חולף במהלך התפתחות עובריים. NCCs מקורם בין האאקטודרם השטח של הצינור העצבי ולהעביר אל חלקים אחרים של העובר במהלך התפתחות1. בהתבסס על תחומים פונקציונליים שלהם, NCCs יכולים להיות מסווגים לתוך מספר סוגים שונים, כולל הגולגולת, תא המטען, vagal, עצם העצה, NCCs הלב. בנוסף, NCCs ניתן להתמיין שושלות תאים מרובים, כגון תאי שריר חלק, תאים עצם הנוירונים, להצמיח רקמות שונות2,3. הפיתוח של NCCs מאופיין על ידי סדרה מורכבת של אירועים morphogenetic, כי הם יסודי על ידי אותות מולקולריים שונים. לאור מורכבות ויסות NCCs ותרומתם מבנים רבים חשוב, dysregulation של פיתוח NCC יכול להוביל בדרך כלל מולדת למומים מולדים, באיזה חשבון כמעט 30% של כל אדם מולדות מומים מולדים. ליקויים במהלך פיתוח הרכס העצבי יכול להוביל שסוע שפתיים/החיך, פגם באף צורה, תסמונות, פגמים כגון מערכת יצוא לב פגומים או אפילו תמותת1,4,5, 6 , 7. הבנת המנגנונים המולקולריים של פיתוח NCC חשוב לפיתוח טיפולים עבור מחלות הנגרמות על ידי ליקויים בהתפתחות NCC. עם השימוש השונים במבחנה , ויוו מתקרב8,9,10,11,12,13,14 ,15, התקדמות ניכרת נעשתה במחקר NCC. In vivo, מודלים בבעלי חיים, כולל עופות, דו-חיים, דג זברה ועכברים, שימשו כדי לחקור NCCs1. יתר על כן, עוברי אדם שימשו כדי לחקור את תהליך ההעברה NCC במהלך התפתחות העובר מוקדם16. במבחנה, מודלים תא NCCs, כגון NCCs האנושי, כי מקורם החולה השומן התת עורית שימשו כדי לחקור את מחלת פרקינסון17. הקו NCC O9-1, אשר נגזר במקור מתרבויות המונית של NCCs אנדוגני מבודד E8.5 העכבר עוברי18, הוא מודל חזק תא ללמוד NCCs. חשוב, בתנאים תרבות שאינם מבדילים, תאים O9-1 NCCs גזע דמוי multipotent. עם זאת, בתנאים תרבות שונות, תאים O9-1 יכול להיות מובחן סוגי תאים מכובדים, כגון תאי שריר חלק, תאי העצם, chondrocytes וגלייה18. לאור מאפיינים אלה, תאים O9-1 שימשו בהרחבה ללימודים הקשורות NCC, כגון חקירת המנגנון המולקולרי של הפנים הגולגולתי פגמים19,20.
כאן, פרוטוקולים מפורט ניתנים לשמירה על תאי O9-1, המבדילים O9-1 תאים לתוך לסוגי תאים שונים של מניפולציה O9-1 תאים על-ידי ביצוע גנים לימודי אובדן-של-פונקציה עם עריכה הגנום CRISPR-Cas9 ו- RNA מפריעות קטן (siRNA)- מתווכת הטכנולוגיות תמונות ציפורים. בתור דוגמא מייצגת, מתואר השימוש O9-1 תאים כדי לחקור הפה , טאז אובדן-של-פונקציה. הפה טאז effectors במורד הזרם של ההיפופוטם איתות, אשר ממלא תפקיד קריטי התפשטות תאים, בידול ולאחר אפופטוזיס בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מסלול היפו גם הוכח להיות חשוב פיתוח, הומאוסטזיס של מספר ברקמות שונות ואיברים, וכן בפתוגנזה של מחלות שונות20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. מרכיבי הליבה של היפו איתות כוללים את הגידול משתיק קול סטרילית כמו 20 kinases Mst1/2, WW המכילות תחום סלבדור לגרדום חלבונים kinases homolog (Lats1/2) משתיק קול של גידול גדול. היפו איתות מעכב פעילות הפה, טאז ומקדם שפלותם בציטופלסמה. ללא דיכוי של היפופוטם, הפה, טאז יכול translocate לתוך גרעין האטום, לתפקד כמו תעתיק שיתוף activators. אנחנו לאחרונה הראה כי במיוחד inactivating ההיפופוטם איתות effectors הפה, טאז עכבר NCCs באמצעות Wnt1שלcre וכתוצאה Wnt1Cre2SOR נהגים עובריים lethality ב E10.5 עם חמור פגמים ואסטתיים20. אנחנו גם הופיעו מחקרים באמצעות תאים O9-1 כדי לחקור את התפקיד של הפה ו Taz ב- NCCs. כדי לחקור הפה, טאז פונקציה NCC התפשטות, בידול, הפה , טאז נוקאאוט תאים נוצר בתאים O9-1 על-ידי שימוש siRNA, הפה נוקאאוט תאים נוצרו באמצעות עריכת הגנום CRISPR-Cas9. האסטרטגיות אובדן-של-פונקציה באותו הגן ניתן ליישם יעד אחר גנים במשעולים אחרים. בנוסף, רווח-של-תפקוד לימודי, תרביות תאים מבחני ניתן להחיל גם לתאים O9-1 ללמוד ג'ין פונקציה ורגולציה. הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו לשמש על ידי חוקרים מדריכים culturing O9-1 תאים כדי לשמור על multipotent stemness, על הבחנה O9-1 תאים לתוך סוגי תאים אחרים בתנאים תרבות אחרת, ועל לימוד תפקוד הגן, המנגנון המולקולרי של NCCs.

<table><tbody><tr><td>תאי הזנה פעילים STO</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1503</td><td>זמין גם בצורה לא פעילה של מיטומיצין C, קטלוג # ATCC 56-X</td></tr><tr><td>O9-1 קו תאי פסגה עצבית גולגולתית של עכבר</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>Millipore Sigma</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין - סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA 0.25% ב-HBSS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco) ללא סידן או מגנזיום</td><td>לונזה</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות (MEM NEAA) 100Xx</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO גורם מעכב לוקמיה (LIF) 106 יחידה/מ"ל</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים אנושי רקומביננטי - בסיסי (rhFGF-basic)</td> <td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>מיטומיצין C</td><td>רוש</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת מטריג'ל</td><td>קורנינג</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (דימתילסולפוקסיד)</td><td>Millipore Sigma</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x)</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי, אלפא 1x עם מלחי ארל, ריבונוקלאוזידים, דאוקסיריבונוקלאוזידים ו-& L-גלוטמין</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-041057</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus לא ממוקד Pool</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-046247</td><td></td></tr><tr><td>FCS (סרום עגל עוברי)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ITS (אינסולין-טרנספרין-סלניום)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF-b3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה</td><td></td><td></td><td></td>אסקורבית</tr><tr><td>BMP2 (חלבון מורפוגנטי עצם 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr>תוסף <tr><td></td> דקסמתזון <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי o9-1

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

תאי הרכס העצבי (NCCs) מעביר multipotent תאי גזע יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, להצמיח מרובים רקמות ואיברים. שורת התאים O9-1 נגזרת אנדוגני העכבר NCCs עובריים ושומר על multipotency שלה. עם זאת, בתנאים תרבות מסוימת, O9-1 התאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומי מחקר. לאחרונה, עם השילוב של העכבר מחקרים ולימודים תא O9-1, אנחנו הראו כי ההיפופוטם איתות לשביל effectors הפה, טאז תפקיד חשוב בהתפתחות ואסטתיים נגזר הרכס העצבי. למרות תהליך culturing עבור תאים O9-1 הוא מסובך יותר בשימוש עבור שורות תאים אחרים, שורת התאים O9-1 הוא מודל חזק על חקירת NCCs חוץ גופית בתוך. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing הקו תא O9-1 כדי לשמור על stemness שלה, כמו גם פרוטוקולים עבור המבדילים O9-1 תאים לתוך לסוגי תאים שונים, כגון תאי שריר חלק, תאי העצם. בנוסף, פרוטוקולים מתוארים לביצוע מחקרים אובדן-של-פונקציה ג'ין בתאים O9-1 על-ידי שימוש CRISPR-Cas9 והמומנט קטן מפריעות נוקאאוט בתיווך RNA.

המטרה של הניסויים שלנו תמונות ציפורים, נוקאאוט היה לחקור את ההשפעות של הפה , טאז אובדן-של-פונקציה בתאים O9-1. לפני הניסויים תמונות ציפורים, הסתרה, אנחנו חייבים לוודא המכינות עבור מדיה הבזליים ותאים תרבות O9-1 כפי שתואר לעיל (לדוגמה, קרום המרתף לצרכים במטריקס כדי לכסות את כל הצלחת, כפי שמוצג באיור 1ו O9-1 תאים התאושש מחנקן נוזלי, כפי שמוצג באיור 2). ביצענו ניסויים תמונות ציפורים כמתואר לעיל בו הפה , ...

O9-1 הוא קו תא multipotent העכבר הרכס העצבי. כאן נתאר מפורט שלב אחר שלב פרוטוקולים culturing O9-1 תאים, המבדילים O9-1 תאים תאים מסוים סוגים של מניפולציה גנטית O9-1 תאים על-ידי שימוש בתיווך siRNA נוקאאוט או עריכה של הגנום CRISPR-Cas9.

Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

קו התא O9-1 הוא כלי שימושי מאוד לחקר תאי סמל עצבי במבחנה. יש לו פוטנציאל גדול לשימוש במגוון רחב של יישומים בשימוש במגוון רחב של מחקר. לתאי O9-1 יש יתרונות ברורים, כגון גישה קלה, והשגת מספרי תאים מספקים לניסויים במהירות, מה שהופך אותו לשיטה רבת עוצמה המשלים למחקרים במבחנה של תאי סמל עצבי.כדי להתחיל, הכן מדיה בזלית עבור תרבות תא O9-1, על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לסנן את המדיה הבסיסית, ולעטוף אותו בנייר כסף כדי להגן עליו מפני האור. לאחר מכן, אסוף מדיה בזלית מותנה מתאים STO פעילים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.ראשית, להפשיר aliquot של מטריצת קרום מרתף על קרח במשך שעתיים. לאחר מכן, לדלל את מטריצת קרום המרתף עם DMEM מעוקר מסונן עם 10%FBS לריכוז סופי של 0.5mg/ml. מצפים את הצלחת עם מטריצת קרום המרתף בטמפרטורת החדר במשך שעה.לאחר מכן, שאף את מטריצת קרום המרתף תוך הטיית הצלחת. יבש את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בעת הוספת מטריצת קרום המרתף לצלחת, ודא שהפתרון כיסה את הבאר באופן שווה כדי לשמור על מאפייני התא ולהימנע משינויים מיותרים בין הניסויים.לשחזר O9-1 תאים על ידי הצבת cryo-בקבוקון לתוך 37 מעלות צלזיוס מים אמבטיה. לאט מערבלים את הבקבוקון עד שהתסכול הופך לחלוטין לנוזל. לאחר מכן, להעביר את פתרון התא מן cryo-בקבוקון לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.הוסף חמישה אמצעי אחסון של DMEM עם 10%FBS לצינור

culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כדי לטפח גזע עצביים לפסגה תאים (NCSC) במבחנה, בינוני מיוחד (NCSCM) נדרשת. חלק חיוני של NCSCM הוא עובר אפרוח לחלץ (CEE). כאן אנו מתארים טכניקות מדויקות כדי לייצר כמות מוגדל של איכות CEE טהור גבוהה, כולל פרטים כמו בידוד, מסמוס, צנטריפוגה, תהליכי סינון.

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את...

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

סרטון זה מדגים את השימוש ב-RNA מפריע קטן (siRNA) כדי להשתיק גנים ספציפיים בעלי עניין בתאי גזע עצביים ולהתמיין אותם לסוגי תאים רצויים באמצעות אמצעי התמיינות מתאים. הליך זה מאפשר לחקור את התפקיד הקריטי של גנים ספציפיים בתהליך ההתמיינות של תאי גזע עצביים.

השתקת גנים בתיווך siRNA בתאי גזע עצביים

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד קפלים עצביים גולגולתיים מאזור המוח התיכון של עוברי אפרוחים. הוא מציג תהליך דיסקציה מפורט של הקפלים העצביים, מיקומם וחיבורם על כיסויים מצופים פיברונקטין ואחריו תצפית על נדידת תאי הפסגה העצבית מהקפלים העצביים.

בידוד קפלים עצביים גולגולתיים מעובר אפרוח לצורך תרבית תאי קרסט עצבית

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח והתרבות של תאי ציצה עצביים הגולגולת מדגמי העכבר, בעיקר למחקר של הגירה תא. אנו מתארים את טכניקות ההדמיה החי בשימוש וניתוח של מהירות וצורה תא שינויים.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה יציבה, בידול יעיל מאוד עבור הדור של נוירונים האוהדים הסימפתטית של האדם בתאי גזע בעלי עוצמה גבוהה. מודל זה יעשה הנוירונים זמינים לשימוש במחקרים של הפרעות אוטונומיות מרובות.

יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.

מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

פרוטוקול רב-תכליתי זה מתאר את הבידוד של תאי פסגה עצבית קדם-מיגרטיבית (NCCs) באמצעות כריתה של קפלים עצביים גולגולתיים מעוברי אפרוחים. עם הציפוי והדגירה, NCCs נודדים מגיחים מתוך קצוות עצביים, מה שמאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים ונדידה בסביבה דו-ממדית פשוטה.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

פרוטוקול זה מתאר ניסוי נדידה חוץ גופית המתאים לניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת in vivo של תאי פסגה עצבית לתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן.

במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

אנו מציגים פרוטוקול התמיינות תלת מימדי (תלת מימדי) במבחנה המייצר נוירוספירות בגודל הניתן לשחזור כדי לייצר תאי פסגה עצבית גולגולתית מתאי גזע עובריים של עכברים. אנו מראים כי מתודולוגיה זו מפחיתה את השונות בהשוואה לפרוטוקולים קודמים וכיצד ניתן להשתמש בה לבדיקה מרובה לחקר התפתחות תאי פסגה עצבית גולגולתית.

תאי פסגה עצבית גולגולתית פרוטוקול התמיינות תלת מימדי במבחנה לבדיקה מרובבת

למדו שיטות תרבית ומניפולציה גנטית של תאי הרכס העצבי O9-1 בעכברים. הפרוטוקולים כוללים siRNA ו-CRISPR-Cas9 לחקר ביולוגיה של תאי עצב ותזונה.

Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1

גלה סרטונים נוספים