תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

מבחן זה פותח כדי לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של קרום פלזמה כדי לקבוע כיצד תאים פגומים ביעילות יכולים לחתום מחדש את קרום הפלזמה שלהם. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למדוד את היעילות של פלזמה קרום resealing בקיבולת תפוקה גבוהה כדי לזהות חלבונים ספציפיים מסלולים המתאימים לתווך פלזמה קרום resealing. התחל על ידי הוספת 20 מיליליטר של 2.5 פעמים 10 לתאי HeLa החמישי למיליליטר של השעיה בינונית צמיחה לתוך אגן פיפטה סטרילי ולהשתמש פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר לערבב ביסודיות את התאים.

לאחר מכן, השתמש micropipette רב ערוצית לזרוע 100 microliters של תאים ל הבא בצלחת 96-גם שטוח, ברור, רקמות פוליסטירן שחור מטופלים צלחת. זכור כי התפלגות תאים הומוגנית היא המפתח לניסוי מוצלח, גם כאשר השוואות בין כל התנאים הניסיוניים דורשות ספירת תאים שוות ערך. לאחר 24 שעות באינקובטור לתרבות התאים הלחים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2, מחממים את קורא הלוחות ל-37 מעלות צלזיוס ומגדירים את התצורה האופטית למונוכרומטור, את מצב הקריאה ל פלואורסצנטיות ואת סוג הקריאה לקינטי.

תחת הגדרות אורך הגל, בחר קריאה של תשעה ננומטר ופס פליטה של 15 ננומטר. עבור מדגים באמצעות propidium יודיד, להגדיר את אורכי גל העירור וההפצלה ל 535 ננומטר ו 617 ננומטר, בהתאמה. תחת סוג לוח, בחרו 96 בארות לפורמט הלוח ובחרו תצורת לוח מוגדרת מראש המתאימה לצלחת תחתונה שחורה ברורה.

תחת אזור קריאה, להדגיש את בארות כי ינותח לאורך ההתנשאות הקינטית. תחת PMT ואופטיקה, הקדים את ההבזקים לקריאה לשישה וסמן את התיבה לקריאה מלמטה. תחת תזמון, הזן אפס שעות 30 דקות ואפס שניות לתוך זמן הריצה הכולל למשך 30 דקות של בדיקה קינטית והזן אפס שעות חמש דקות ואפס שניות למרווח.

אשר את ההגדרות שצוינו במידע ההגדרות ולחץ על אישור. לאחר מכן לחץ על קרא כדי ליזום את הריצה הקינטית. כדי להגדיר את פרמטרי הדימות בתוך מצב ההגדרות, הגדר את MiniMax עבור התצורה האופטית, הדימות עבור מצב הקריאה ונקודת הקצה עבור סוג הקריאה. תחת אורכי גל, בחר אור משודר ואת תיבות הפלואורסצנטיות המתאימות המתאימות לאוררכי הגל הניסיוניים של העירור וה הפליטה.

הגדר את סוג הלוח ואת אזור הקריאה כפי שהודגם זהה ותחת הגדרת אזור באר, הגדר את מספר האתרים בתוך באר שיש לדמיין. תחת הגדרות רכישת התמונה עבור GFP, הגדר את ההתקן כך שדמיין את כל באר עם זמן חשיפה של 20 אלפיות שניה לתמונה. עבור אור משודר, לרכוש תמונה אחת של המרכז של כל באר עם זמן חשיפה שמונה אלפיות השניה.

עבור propidium יודיד, לרכוש תמונה אחת במרכז כל באר עם זמן חשיפה 20 אלפיות השניה. לאחר מכן אשר את ההגדרות במידע ההגדרות ולחץ על אישור וקרא כדי ליזום את הדימות. כדי להגדיר בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות בתפוקה גבוהה לתנאים מתירניים לתיקון, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 microliters של 37 מעלות צלזיוס M1 בינוני לבא והוסיף 100 microliters של טרי 37 מעלות צלזיוס M1 בינוני בתוספת 30 micromolar פרופיליום יודיד לאחר השלכת לשטוף השני.

לתיקון תנאים מגבילים, לשטוף את התאים פעם אחת עם 200 microliters של 37 מעלות צלזיוס M2 בינוני בתוספת חמישה מילימולאר EGTA לגם ואחריו לשטוף אחד עם 200 microliters של M2 בינוני לבד. לאחר השלכת לשטוף השני, להוסיף 100 microliters של טרי 37 מעלות צלזיוס M2 בינוני בתוספת 30 micromolar פרופידיום יודיד לגם. לאחר מכן תדמיין את הלוח תחת אור משודר, GFP ו- PI כפי שהודגם זה הרגע.

בזמן שהצלחת מצולמת, מניחים מיקרופלאט פוליפרופילן תחתון 96 עגול היטב על קרח ומגדירים את הצלחת כפי שהוכח רק עבור הצלחת הקודמת. לתיקון תנאים מתירניים, להוסיף 100 microliters של קרח קר M1 בינוני בתוספת 60 micromolar propidium יודיד לגם ואחריו תוספת של 100 microliters של קרח קר M1 עם או בלי 4X ליסטריוליצין O לבא. לתיקון תנאים מגבילים, להוסיף 100 microliters של קרח קר M2 בינוני בתוספת 60 micromolar propidium יודיד לגם ואחריו תוספת של 100 microliters של קרח קר M2 עם או בלי 4X ליסטריוליצין O לבא.

זה הכרחי להכין ליסטריוליסין O בריכוז הניסיוני המתאים על הקרח כחמש דקות לפני תחילת ההבטחה הקינטית כאשר צלחת אחת היא על קרח צלחת 2 הוא להיות מוכן. כאשר הצלחת הראשונה מסיימת הדמיה, מיד להעביר את הצלחת על גיליון של רדיד אלומיניום על הקרח. לאחר חמש דקות, להעביר 100 microliters מכל באר של הצלחת השנייה ל הבאר המתאימה המתאימה בצלחת מקורר הראשון, החדרת טיפים פיפטה מתחת למניסקוס של פתרון בכל באר לפני הוצאת נפח מבלי לערבב להפצה נכונה של הרעלן.

אפשרו לטוקסין להיקשר לתאי המארח למשך דקה אחת והעברו מיד את הלוח הראשון לקורא הלוחות לצורך בדיקה פוסט-קינטית במצב ספקטרופלואורומטר. בסוף ההקדמה הקינטית, מיד לרכוש הדמיה פוסט קינטית של תמונת הלוח כפי שהוכח עבור הדמיה טרום קינטית. כדי לקבוע את ספירת התאים בהתבסס על הפלואורסצנטיות הגרעינית, בתוכנת ספירת תאי המיקרופלאט תחת הגדרות, בחר ניתוח מחדש ובהגדרות ניתוח התמונה, בחר ניתוח אובייקטים דיסקרטי באמצעות 541 כאורך גל לחיפוש אובייקטים.

בתוך האפשרות חפש אובייקטים, השתמש בציור על שיטת חיפוש תמונות, בחר גרעינים ולחץ על החל ולאחר מכן לחץ על אישור וקרא כדי ליזום את אלגוריתם ספירת התאים. ביטוי GFP אינו מפריע מדידות עוצמת יודיד פרופיד בנוכחות או היעדר טיפול ליסטריוליצין O. הביטוי של יודיד פרופידיום יכול לדמם דרך פלואורסצנטיות GFP כפי שמוצג על ידי עלייה בעוצמת פלואורסצנטיות GFP בתאי HeLA H2B-GFP בהדמיה פוסט קינטית בדיקה לעומת ניתוח טרום קינטי.

חשוב לציין עם זאת, קרוסאובר זה אינו משפיע על ספירת תאים, כמו תהליך פילוח מעורב ספירת הגרעינים אינו מושפע על ידי עלייה פלואורסצנטיות GFP. בהיעדר ליסטריואליסין O, שלמות קרום הפלזמה נשארת קבועה בנוכחות או היעדר סידן חוץ תאי, בעוד טיפול ליסטריואליסין O בנוכחות סידן בתוספת תוצאות בינוניות בעלייה מתמדת בעוצמת פלואורסצנטיות פרופידיום יודיד. בהיעדר סידן חוץ תאי עם זאת, יש עלייה תלולה משמעותית בפרואורסצנטיות של פרופידיום יודיד, המשקפת את היעדר כריתת הממברנה.

לחלופין, ניתן להחליף צבע מחייב חומצת גרעין קרבוציאנין עם פלואורסצנטיות באדום הרחוק ליודיד פרופידיום כדי למזער את החפיפה הספקטרלית עם GFP. בנוסף, מקדם העירור הגדול יותר לצבע האדום הרחוק מפגין יחס אות לרעש גבוה יותר ורזולוציה טובה יותר בין התנאים המתירניים והתיקון של התיקון. בעת ניסיון הליך זה, מומלץ לסמן את כל הצינורות יום לפני הניסוי, כמו זה יכין אותך לכל ההכנה reagent ביום הניסוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ציטומטריית תמונה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם נקבובית ויוצרת רעלן פוגעת בכל התאים באופן אחיד או שהם חלק מהתאים רגישים יותר מאחרים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומים של מחלות זיהומיות ותיקון קרום פלזמה כדי לחקור את ההשפעות של גודל הנקבוביות על יעילות התיקון של סוגי תאים שונים.