Name: הקציר של תאי אנדותל של קצות בלון קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: למד שיטה לבידוד תאי אנדותל מעורק ריאתי מקצות קטטר Swan-Ganz לאחר צנתור לב ימני. הטכניקה מאפשרת ביופסיה תאית בטוחה לחקר מחלות כלי דם ריאתיים ומנגנוני יתר לחץ דם ריאתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצה תודה לרופאים את הצוות של שירות אי ספיקת לב מתקדמת יתר לחץ דם ריאתי של בית החולים הכללי אלגני ותמיכה במתן מאות דוגמאות קטטר על פני מספר שנים יש פוריה אופטימיזציה של מתודולוגיה זו.

כל המחקרים שתוארו במאמר זה אושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי של הרשת בריאות אלגני. כל המטופלים באתר הסכמה מדעת לפני המינהל מהסוכנים הרגעה, מבטל את אותרו על-ידי הקצאת מספר הלימוד.
1. אוסף המיטה
הערה: כל פרוטוקול זה צריך להיעשות על קרח, שימוש בפתרונות מראש צוננת. חשוב לזירוז stasis קר בתאים כדי לשמר שלהם פנוטיפ ביולוגי באתרו. פרוטוקול זה כרוך הטיפול של דם ותאים המתקבל בני אדם, ולכן צריך להיות שנצפו הזהירות אוניברסלי.
<ol><li>לאחר נסיגה של הקטטר מהנדן, מיד לטבול את הצנתר בתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל המכיל 40 מ ל תמיסת סטרילית צוננת. מערבולת הקטטר מספר פעמים כדי להסיר דם ולאחר אשטוף את הצורך להסיר דם נשמר בתוך השורה.</li>
	<li>לחתוך את 5 ס מ דיסטלי של קצה הצנתור ולאפשר לו ליפול לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ ל המכיל תמיסת מלח צוננת. מיד להסיר את הטיפ הצנתור עם מלקחיים, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל המכיל 15 מ"ל של מדיום הגידול תא אנדותל (EC).</li>
	<li>לאטום את הצינור, הניחו אותו על קרח, להעביר למעבדה כדי להתכונן עיבוד או משלוח. זה קריטי כי הבלון נשאר שקוע בפעילות בינונית, לכן ודא יש קראוון מינימלי בצינור 15 מ"ל על ידי ממלא אותו לחלוטין עם מדיום הגידול EC.</li>
	<li>תהליך הדגימה מיד על ידי הליך 2.1 שלב או חותם, הספינה המדגם על קרח רטוב בין לילה לעיבוד-מעבדה מיומנים פרוטוקול זה. אם תאים בסופו של דבר הולך לשמש תרבית תאים, זה ממליצים כי הטיפ הצנתור יעובדו מיד באותו אתר שבו זה נאסף.</li>
</ol>2 קציר תא
הערה: כל פרוטוקול זה צריך להיעשות על קרח, שימוש בפתרונות מראש צוננת. התאים הם בהקפאה קר, וזה חשוב למנוע התעוררות אותם עד שהם יהיו מוכנים להיות קבוע או תרבותי. פרוטוקול זה כולה צריכה להתבצע בתוך תא למינארי, באמצעות מכשירים סטריליים, אם הכוונה האולטימטיבית היא תרבות PAECs שנקטפו. אם התרבות אינה מתוכננת (למשל, flow cytometry ניתוח), אין צורך לבחון אמצעי זהירות סטרילי.
<ol><li>הוסף 5 מ של פתרון ניתוק התא שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל; מניחים על קרח.</li>
	<li>שואבים את שנותרו בצינור אוסף המיטה לתוך המזרק 1 מ"ל 1 מ"ל של EC מדיה.</li>
	<li>מהר להשלים שלבים 2.3 דרך 2.5. זהו זה סוף חיתוך של קצה הקטטר עם ועוצרי דימום.</li>
	<li>הכנס היטב את המחט של המזרק 1 מ"ל לתוך החור"לבן"מול החוט ("חור שחור"). . שמור על עצמך כדי למנוע פציעות עם המחט.</li>
	<li>להעביר את הטיפ הצנתור לתוך צנטריפוגה 15 מ"ל הצינור המכיל את הפתרון ניתוק התא.</li>
	<li>לנפח את הבלון, נזהר שלא להתפוצץ זה; ניפוח הבלון עם-200 µL של התקשורת עובד.</li>
	<li>לאפשר את הצנתר לשבת בפתרון ניתוק התא על קרח למשך 5 דקות עם בלון מנופח. אם הבלון מצטמקות בכוחות עצמו במהלך 5 דקות, זו קביל.</li>
	<li>שופכים את התוכן של הצינור צנטריפוגה 15 מ"ל לתוך המנה 100 מ מ. מקם את הבלון הפתרון ניתוק התא "שלולית".</li>
	<li>לגרד את הבלון המנופח עם המגרד התא. ניתן להסיק את המגרד תא מסביב לבלון תנועה מעגלית או תנועה צחצוח. להתמקד "הפולנים" של הבלון, שם הוא פוגש את הקטטר. ודא מגרד תא השטח כולו של הבלון יוצר קשר לפחות פעמיים. לשטוף את המגרד תא בפתרון ניתוק התא "שלולית" מעת לעת.</li>
	<li>השטחת קצה את הבלון, לגרד את זה עם תנועה צחצוח. יש לשטוף את המגרד תא בפתרון ניתוק התא "שלולית".</li>
	<li>להתעלם במגרדת עצה ומחט תא את הצנתור בגורם המכיל פסולת המתאים.</li>
	<li>יוצקים את הפתרון ניתוק התא המכיל את הקציר תא לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. לנער את הצינור אוסף ויוצקים התקשורת הנותרים מהצינור אוסף לתוך הדגימה שנאספו גם כן.</li>
	<li>Centrifuge הדגימה ב x 650 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חשוב לציין כי לרוב גלולה לא ישודר. זה יכול להיות מועיל לסמן את המיקום שבו גלולה היה אפשר לראות, אם גלוי, כדי להימנע כ רפה בעברית בגדר במקרה זה קטן מדי כדי לראות... הערה: בדרך כלל, גלולה נתפסת רק כאשר המדגם שזוהמו על ידי הדם. זיהום דם הוא משנה המוצר האולטימטיבי הקציר כי דם נכשל לאגד את החרוזים CD146 שוטף באמצעות המדור. בדיקות מקיפות הוכיחה כי למותג הספציפי של 1.5 mL microcentrifuge צינורות שאוזכרו טבלה של חומרים ממזערת אובדן התא ביחס אחרים צינורות מנוצל במהלך המיטוב פרוטוקול.</li>
	<li>בזהירות תשאף מדיה, ולהימנע מפריע או כ רפה בעברית בגדר.</li>
</ol>3. תא טיהור
הערה: כל פרוטוקול זה צריך להיעשות על קרח, שימוש בפתרונות מראש צוננת. התאים הם בהקפאה קר, וזה חשוב למנוע התעוררות אותם עד שהם יהיו מוכנים להיות קבוע או תרבותי.
<ol><li>Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של תאי הדם האדומים צוננת פירוק פתרון, להעביר אותו צינור microfuge 1.5 מ; בעדינות רוק 10 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. האחות הפתרון פירוק RBC.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב- 60 μL של PBS, μL 20 ה-FcR חוסם μL 20 של האנטי-האדם CD146 גרגרי. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של PBS צוננת. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS צוננת.</li>
	<li>במקום עמודה LS מגנטי על מתלה מגנטי (ראו טבלה של חומרים ספציפיים מסחרי זהותם של פריטים אלה) בטמפרטורת החדר. פריים עמודה על-ידי הוספת 1 מ"ל של PBS ולאפשר האחסון כולו לזרום דרך. למחוק את הזרימה דרך.</li>
	<li>מקם את הדגימה בעמודה מגנטי. למחוק את הזרימה דרך.</li>
	<li>רחץ טורים 3 מ"ל של PBS צוננת שלוש פעמים. למחוק את הזרימה דרך מ. כל כביסה.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של PBS צוננת שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. הסר את העמודה מגנטי מגנט, שופכים את 3 מ"ל של PBS מהצינור צנטריפוגה 15 מ"ל לתוך העמודה ולמקם במהירות את העמודה בצינור צנטריפוגה כדי לתפוס את הזרימה דרך. מיד מזנקת עם הבוכנה שסופק עם עמודה. המדגם הוא עכשיו מטוהרים, מוכנים פיקסציה/צביעת, או תרבות.</li>
</ol>

<ol><li>Galie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2015+ESC%2FERS+Guidelines+for+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+hypertension%3A+The+Joint+Task+Force+for+the+Diagnosis+and+Treatment+of+Pulmonary+Hypertension+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29+and+the+European+Respiratory+Society+%28ERS%29%3A+Endorsed+by%3A+Association+for+European+Paediatric+and+Congenital+Cardiology+%28AEPC%29%2C+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation+%28ISHLT%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT).</a> European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).</li>
<li>Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvest+of+pulmonary+artery+endothelial+cells+from+patients+undergoing+right+heart+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization.</a> Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).</li>
<li>Benza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+expression+of+Bcl-2+in+pulmonary+artery+endothelial+cells+associates+with+pulmonary+arterial+hypertension+relative+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction.</a> Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).</li>
<li>Bull, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+cells+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).</li>
<li>Kaneko, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+reaction+products+of+nitric+oxide+as+quantitative+markers+of+primary+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).</li>
<li>Rothman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvenous+procurement+of+pulmonary+artery+smooth+muscle+and+endothelial+cells+using+a+novel+endoarterial+biopsy+catheter+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model.</a> Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).</li>
<li>Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+and+personalising+therapy+in+pulmonary+hypertension%3A+seeing+the+light+from+the+dawn+of+a+new+era%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Reviews%22%5BJournal%5D)">Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era.</a> European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).</li>
<li>Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+Pulmonary+Arterial+Hypertension%3A+Evolving+Therapeutic+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies.</a> Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).</li>
<li>Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146+%28Mel-CAM%29%2C+an+adhesion+marker+of+endothelial+cells%2C+is+a+novel+marker+of+lymphocyte+subset+activation+in+normal+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood.</a> Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).</li>
<li>Elshal, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+population+of+effector+memory+lymphocytes+identified+by+CD146+having+a+distinct+immunophenotypic+and+genomic+profile%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunolology%22%5BJournal%5D)">A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile.</a> BMC Immunolology. 8, 29(2007).</li>
<li>Newman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PECAM-1+%28CD31%29+cloning+and+relation+to+adhesion+molecules+of+the+immunoglobulin+gene+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily.</a> Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).</li>
</ol>

MJP RLB הממציאים על הפטנטים בטענה חלקים בשיטות המתוארות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד.

בטכניקה המתוארת במאמר זה ניתנת להערכה הטובה ביותר בהקשר של פרדיגמות ניסיוני הקודם לימוד של אנדותל כלי הדם בריאות. ניסיונות קודמים להשיג PAECs של בני האדם היה מוגבל בריאות explanted/cadaveric5 ועל ניסיון קצר כדי לפתח צנתר מסוגל עורק הריאה ביופסיה6. כאמור ב- סקירה האחרונות7, הטכניקה נוכח נבדל הקציר רקמת הריאה על ידי יכולתו להשיג PAECs של אדם חי, עושים זאת על מספר נקודות זמן ההתקדמות המחלה ו/או טיפול. עם זאת, יצוין כי טכניקה לוויה לאחרונה דווחה לפיה המושרה בתאי גזע pluripotent (IPSCs) יכול להיות transdifferentiated לתוך4,PAECs5. טכניקה זו מייצרת תרבויות בשפע של המטופל הספציפי PAECs ומאפשרת חקר השפעת רקע גנטי לחולה ספציפי על ביולוגיה PAEC. למרות היתרונות האלה, אלה PAECs נגזר IPSC יכול להציע מידע לגבי האינטראקציה בין microenvironment המקומי לבין הרקע הגנטי של החולה הספציפי. קבוצה משלנו הציגה את התצוגה כי "הצנתור עצה" וטכניקות IPSC צפויים להיות סינרגיסטי בקידום שדה8.
במסגרת זו מתנת והיסטוריים, המגבלות של טכניקה זו יש לציין. ראשית, חשוב לציין כי התשואות של PAECs נגזר בשיטה זו יכול להשתנות במידה ניכרת. ככל הנראה, החולה-, מחלת ספציפיים למדינה או רופא גורמים תורמים ההשתנות, כמו הפרוטוקול אינו מכיל שלבים הייתה צפויה לגרום אובדן גדול של חומר המקור. טבלה 1 מציגה את נציג ש-cd146 + התשואות בין מגוון רחב של יבול PAEC ניצול טיפים קטטר המתקבל מגוון רחב של חולים עם מצבי מחלה שונים של יתר לחץ דם ריאתי במגוון אופרטורים רופא. שנית, התשואות תא הכוללת נמוכה הינם הנביטה שלהם לתרבות הוכיחה להיות נמוך עדיין בידיים שלנו. בזמן שלמדנו בעבר תרבויות PAECs באמצעות שיטה זו1, אנו מניחים הצלה מייצגים אלה תוצאות של קבוצת משנה של ובתאים בעקבות die-off של רוב המדגם, הוא רק לסירוגין מוצלח בידיים שלנו. לדוגמה, זה לא נדיר למצוא רק כמה עשרות מחסידי PAECs בתרבות בבוקר לאחר הקציר היה מצופה. לעיתים קרובות המיקרו-תרבויות אלה אינם שורדים להתרחבות. עבודה נוספת יש צורך לייעל את פרוטוקול זה באופן תחזק את הכדאיות של PAECs והתנאים שלהם בתרבות כדי להשיג את המטרה הרצויה של התפשטות של המטופל הספציפי PAEC יבול. בסופו של דבר, הבחירה חיובי CD146 שאנחנו הסתגלו יכול שלא לכלול זיהום עם CD146 + תאים אחרים, כגון העברת תאי אנדותל4, pericytes, תאי שריר חלק, נדיר CD146 + T תאים9,10. יחד עם זאת, תאים אלה הם בחזקת להיות מעט מאוד במספר הדגימות שנאספו באופן זה, CD146 היא במידה ניכרת ספציפית עבור פרוטוקול זה יותר סמנים אחרים התא של תאי אנדותל כגון CD31 (אשר נמצאת גם על מגוון נישא בדם תאים כולל טסיות11). שיפורים עתידיים כלשהם שמטרתם לשפר את ירידה לפרטים לאזן נגד שלהם השפעה שלילית פוטנציאלית על התשואה.

האמריקאי והאירופי לפי ההנחיות דורשות הלב הנכון צנתור לאבחון של יתר לחץ דם ריאתי1. רופאים, מדענים מחפשים להבין את המחלה רצון דגימות ביולוגיות להערכת ריאתי כדי להשלים את הנתונים והמודינמיקה הנאסף במהלך RHC. למרבה הצער, שהסיכון ביופסיה כלי דם ריאתי הוא גבוה מאוד, ולכן דגימות ביולוגיות של להערכת ריאתי הם לעיתים נדירות, אם אי פעם המתקבל החיים בחולים שעברו RHC. בעוד צברה הרבה תובנה של רקמת הריאה וסקולריים המתקבל cadaveric או הריאות explanted, הדוגמיות הללו אינם מסוגלים לשקף את הביולוגיה של תהליך המחלה PH כמו זה מתקיים לחולה לחיות. בשנת 2013, אנחנו קודם דיווחו תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) הם חשופה מן הענפים של עורק הריאה על ידי מגע פיזי עם בלון קצה הצנתר ברבור-גנץ במהלך RHC, ניתן לשחזר במספרים קטנים מן העצות קטטר לאחר הליך2.
מאמר זה מדגים את הטכניקה שלנו עבור הסרת וטיהור תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) מכל קצות בלון קטטר Swan-גנץ בעקבות הלב הנכון צנתור. עד כה, המתודולוגיה לביצוע טכניקה זו הקציר תואר בפירוט לא מספיק בספרות כדי להבטיח תוצאות אחיד בין מעבדות ביצוע הטכניקה. מאמר זה נועד להתגבר על מחסור, המציע מטמיעים הפגנה של הטכניקה, מאוסף המיטה קטטר הטיפים כדי המוצר הסופי של מטוהרים CD146 + אנדותל תאים. טכניקה זו צריכה לסייע בקידום המחקר לתוך pathobiology חבלות מסיבות שונות של PH, יכול לגרום בפיתוח של מבחני אבחון חדש כדי להשלים והמודינמיקה הנתונים שנאספו במהלך RHC.
החשיבות של טכניקה זו בתחום המחקר והרפואה כלי דם ריאתי הוא כי זה מספק גישה תצלום בזק של הביולוגיה של אנדותל ריאתי באתרו, בניגוד מחקרים מוקדמים יותר על הריאות explanted או cadaveric, לא מייצג נקודת קצה של הנושא ריאות. לאחרונה, הראינו כי סמן אנטי-מוות תאים אלה עשויה להיות תועלת ב ליתר דיוק phenotyping הקשורים זנים של יתר לחץ דם ריאתי3. התשואה של תאים שהושג הוא יחסית קטן, ~ 5, 000-25,000 PAECs עבור דגימה, תאים אלה הם קשים (אך לא בלתי אפשרי) לתרבות. אנו מאמינים כי חכם קלינאים וחוקרים ימצא הסינרגיה בין שיטות אלה מסייע על מנת לקדם מחקר כלי דם ריאתי, אבחון, prognostics.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבות 100 מ"מ</td><td>פישר</td><td>NC9385690</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>Midsci</td><td>C15R</td><td></td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד</td><td>פישר</td><td>PI28908</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td></td><td>תמיסת ניתוק תאים</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>תרמו מגרד תאים</td><td>פישר</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>יישומי תאים של מדיית צמיחת תאי אנדותל</td><td></td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>המוסטט</td><td>בכל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרופוגה LoBind</td><td>פישר</td><td>13-698-794&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi CD146 חרוזים</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-596</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi FCR חוסם</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi LS עמודות</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi מגנט</td><td>Miltenyi</td><td>MidiMACS</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi RBC מאגר ליזה</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>פישר</td><td>BP2438-4</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr></tbody></table>

הקציר של תאי אנדותל של קצות בלון קטטר swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני

Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization

מגוון רחב של פתולוגיות להוביל יתר לחץ דם ריאתי (PH), אשר מוגדר רשע עורק הריאה בלחץ העולה על 25 מ מ כספית במנוחה. עוד יותר לאבחן ולנהל PH, המטופלים עוברים הלב הימני חוזרות catheterizations (RHC) שבו קטטר Swan-גנץ מתקדמת לתוך ענף עורק הריאה, בלון מנופח לתקוע את קצה הקטטר. מאמר זה מדגים פרוטוקול לפיה תאי אנדותל עורק הריאה (PAECs) עשוי להיות שנקטפו לאחר RHC העצות בבועות טקסט של קטטר Swan-גנץ וטיהרו עם טכניקה טור אנטי-CD146 זיקה לטהר בשם PAECs. תאים אלה עשויה לשמש כדי לספק תמונה באתרו של מצב ביולוגי אנדותל להערכת ריאתי כהשלמה מדידות והמודינמיקה שהתקבל במהלך RHC. שנבצרו, מטוהרים PAECs עשוי לשמש גם תרבית תאים או עוקבות מבחני אנליטי כגון זרימת cytometery.

פרוטוקול זה מתבטא הטיהור של תאים, טיפים קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני, לאגד עמודת בחירה CD146, יש פרופילים לפנים לצד פיזור הם נבדלים מן האדם העיקרי בתרבית ריאתי עורק תאי אנדותל (איור 1). בהתחשב בכך הבלון הצנתר הוא במגע פיזי עם רק introducer נדן (תא ללא חומר), הקיר כלי עורק הריאה, ואת הדם, נתונים ניתנת בזאת כדי להדגים כי תאים אלה לא נגזרות הדם (איור 2) , ואת ולכן ההנחה היא כי הן אכן נוצרו מן הקיר כלי עורק הריאה. הקורא צריך לציין כי beads מגנטי anti-CD146 המשמשים לטהר את התאים נשארים מחסידי השטח תא לאחר ההליך, ובכך זה היא שיוצרת כדי לנסות לנתח את יבול תא עבור CD146 כסמן של תאי אנדותל. CD31 או סמנים אנדותל אחרים ככל הנראה יהיה זמין עבור תיוג, יכול להיחשב חלופות.
המרכיבים העיקריים של פרוטוקול זה זוהו זה עשוי להשפיע על התוצאות. ראשית, חשוב לשטוף את קצה הקטטר ליד מיטת החולה על מנת להסיר את הדם. איור 3 מראה את הצד פיזור (האס) / פיזור קדמי (FSC) פרופילים של זרימה דרך מן העמודה anti-CD146 עבור אחד לטעום את זה היה כמו שצריך לשטוף, אחד זה לא היה. העמודה מופיעה כדי לא לכלול תאים דם-derived יבולים (איור 2), אך הצעד השטיפה יבטיח מינימלי זיהום אפשרי מלהסתובב תאי אנדותל (אשר קיימים בדרך כלל ב- &lt; 50 תאים למ"ל של דם4). הבחנו את eluate של CD146 העמודה היא ברורה לחלוטין, אפילו במקרה של דגימות קצה הצנתר מדמם מאוד. זה מרמז כי העמודה הוא מסוגל להתמודד עם כמויות משמעותיות של דם ללא סתימת או שמירה שאינם-CD146 + bloodborne תאים.
שנית, חשוב לנפח את בלון עיצה לפחות פעם אחת במהלך השלב במגרדת תא תא פתרון ניתוק. בהתחשב בכך PAECs בשם בקצה הבלון להישאר למרות חסיד רינס מלוחים צעד, סביר להניח שהם חלקית לכודים על ידי קפלי הבלון ויניל כמו זה הוא מנוכה המחירים לקראת הסרת מן המטופל. ככל הנראה, הצעד האינפלציה משחרר את PAECs, לאפשר להם להיות שפשוף בעדינות. . זה לא ברור אחד יכול לבדוק השערה זו, אבל תשואות נמוכות של תאים נצפו כאשר הבלון היא לא מופקע (נתונים לא מוצג).
לבסוף, חשוב לציין כי התשואות של PAECs נגזר בשיטה זו יכול להשתנות במידה ניכרת. ככל הנראה, החולה-, מחלת ספציפיים למדינה או רופא גורמים תורמים ההשתנות, כמו הפרוטוקול אינו מכיל שלבים הייתה צפויה לגרום אובדן גדול של חומר המקור. טבלה 1 מציגה את נציג ש-cd146 + התשואות בין מגוון רחב של יבול PAEC ניצול טיפים קטטר המתקבל מגוון רחב של חולים עם מצבי מחלה שונים של יתר לחץ דם ריאתי במגוון אופרטורים רופא.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig1.jpg"> איור 1 : תרבות האס/FSC פרופילים של יבול עצה בלון קטטר טיפוסי מטופלת ביתר לחץ דם ריאתי (א), מספר דומה של תאים רכשה באופן מסחרי ראשי האדם PAEC (ב). שתי דוגמאות היו מטוהרים עם העמודה anti-CD146, קבוע, permeablized כפי שמתואר הפרוטוקול, לפני ניתוח FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig2.jpg"> איור 2 : האס/FSC פרופילים של בלון קטטר טיפוסי עצה הקציר מיתר לחץ דם ריאתי המטופל (א) ו טורי 1:10 דילול Ficoll מטוהרים הדרגתי האנושי באפי את המעיל (B, C, D). (א) היה טהור עם העמודה anti-CD146 ואילו (B-D) לא היו. כל הדגימות תא קבוע, permeablized כפי שמתואר הפרוטוקול, לפני ניתוח FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig3.jpg"> איור 3 : האס/FSC פרופילים של יבול עצה בלון קטטר ממטופל יתר לחץ דם ריאתי דם היה גלוי בקצה הקטטר לפני עיבוד. לפני שלב 3.1 של הפרוטוקול, המדגם היה מפוצל, פירוק מאגר היה להוסיף aliquot אחד שנוכו השני. (א) ו- (ג) להראות את הפרופילים האס/FSC מדגם lysed, בשני התאים נשמרים על ידי עמודת (א), של הזרימה דרך מן העמודה. (B) ו- (ד) להראות את הפרופילים האס/FSC מדגם unlysed, בשני התאים נשמרים על ידי עמודת (B), של הזרימה דרך מן העמודה (D). אנו מסיקים כי פירוק מסיר חלק אבל לא כולם של לויקוציטים אבל זה לויקוציטים אינן נשמרות באמצעות העמודה, ובכך לא יכללו את הקציר הסופי, ללא קשר פירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מדגם</td>
			<td>תאריך</td>
			<td>תפוקת תא</td>
			<td>אבחון</td>
		</tr>
<tr>
<td>433</td>
			<td>4/17/2018</td>
			<td>7364</td>
			<td>מחלות ריאה אינטרסטיציאליות-PH</td>
		</tr>
<tr>
<td>279</td>
			<td>4/17/2018</td>
			<td>7130</td>
			<td>PH-סקלרודרמה</td>
		</tr>
<tr>
<td>432</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>3976</td>
			<td>PH-Multifactorial</td>
		</tr>
<tr>
<td>431</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>3634</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>390</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>5666</td>
			<td>פה</td>
		</tr>
<tr>
<td>423</td>
			<td>3/23/2018</td>
			<td>9024</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>272</td>
			<td>3/23/2018</td>
			<td>7098</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>408</td>
			<td>2/27/2018</td>
			<td>4784</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>403</td>
			<td>2/14/2018</td>
			<td>10376</td>
			<td>PH-ASD + מחלות המסתם הדו-צניפי</td>
		</tr>
<tr>
<td>396</td>
			<td>1/26/2018</td>
			<td>4890</td>
			<td>HFpEF-IPCPH</td>
		</tr>
<tr>
<td>397</td>
			<td>1/26/2018</td>
			<td>7672</td>
			<td>ספיקת הדם נורמלי</td>
		</tr>
<tr>
<td>318</td>
			<td>1/4/2018</td>
			<td>7002</td>
			<td>HFrEF-האל-וואד הנוכחי</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: CD146 + התשואות ממגוון רחב של יבול PAEC. נציג CD146 + התשואות בין מגוון רחב של יבול PAEC ניצול טיפים קטטר המתקבל מגוון רחב של חולים עם מצבי מחלה שונים של יתר לחץ דם ריאתי במגוון אופרטורים רופא.

פרוטוקול זה מתאר את ההסרה של טיהור של עורק הריאה אנדותל תאים (PAECs) לדבוק קצות בלון קטטר Swan-גנץ בעת שהם נמצאים תקוע בעורק הריאה במהלך צנתור הלב הימני יישארו חסיד בלון מנוכה בעקבות הסרת מן הגוף של המטופל.

הקציר של תאי אנדותל של קצות בלון קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני

A variety of pathologies lead to pulmonary hypertension (PH), which is defined as a mean pulmonary artery pressure exceeding 25 mmHg at rest. To further ...

שיטה זו מספקת גישה חדשה לטיפול בשאלות מפתח בתחום מחקר כלי הדם הריאתי, כגון הנתיב המולקולרי של מנגנונים של התפשטות אטימלית ביתר לחץ דם ריאתי. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ביופסיה תאית דקה של אנדותל כלי הדם ריאתי ללא סיכון נוסף למטופל. הדגימה של ההליך תהיה מיס ריינה פרז, המתאמת הקלינית שלנו, וד"ר פיליפ גאלו, מנהל המעבדה שלי.לאחר הקטטר הוא נסוג מן נדן, מיד לטבול אותו צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר של מלוחים סטריליים מצוננים. מערבל את הקטטר מספר פעמים כדי להסיר כל דם, ולשטוף את הקו במידת הצורך כדי להסיר את הדם שנשמר בתוכו. חותכים את הדיסטלי חמישה סנטימטרים של קצה הקטטר, ולאפשר לו ליפול לתוך צינור הצנטריפוגה.השתמש מדפים כדי להסיר מיד את הקצה, ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל 15 מיליליטר של מדיום צמיחת תא אנדותל. לאחר מכן, לאטום את הצינור. שים את הצינור על קרח, ולהעביר אותו למעבדה.או לעבד את המדגם באופן מיידי או לארוז את המדגם על קרח רטוב למשלוח לילה למעבדה שבה העיבוד יתרחש. זה קריטי כי הבלון נשאר שקוע במדיום. אז לוודא שיש שטח ראש מינימלי בצינור 15 מ"ל על ידי מילוי זה לחלוטין עם מדיום צמיחת תא אנדותל.ראשית, להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון ניתוק תאים לצינור צנטריפוגה נקי 15 מיליליטר. שים את הצינור הזה על קרח. באמצעות מזרק מיליליטר אחד, לצייר מיליליטר אחד של מדיה תא אנדותל ממה שנשאר בצינור איסוף ליד המיטה.בזהירות להכניס את המחט של מזרק מיליליטר אחד לתוך החור הלבן מול חוט המדריך. מניחים את קצה הקטטר לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל את פתרון ניתוק התא. לנפח את הבלון עם כ 200 microliters של מדיה, נזהר לא לפוצץ אותו.מניחים את הצינור על קרח, ולתת קטטר לשבת בתסכול ניתוק התא במשך חמש דקות עם הבלון מנופח. לאחר מכן, יוצקים את תכולת הצינור לתוך צלחת 100 מילימטר, לוודא כי הבלון ממוקם בשלולית זו של פתרון ניתוק התא. באמצעות מגרד תאים, לגרד את הבלון המנופח, להתמקד בקטבים של הבלון שבו הוא פוגש את הקטטר.לאחר מכן, ודא שמגרד התאים יוצר קשר עם כל פני השטח של הבלון לפחות פעמיים, ושטף מעת לעת את מגרד התאים בפתרון ניתוק התא. לנפח את הבלון ולגרד אותו עם תנועת צחצוח. ואז לשטוף את מגרד התא בשלולית של פתרון ניתוק התא.השלך את קצה הקטטר, המחט ומגרד התאים למיכל פסולת מתאים. יוצקים את פתרון ניתוק התא המכיל את קציר התא לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. לנער את צינור האיסוף, ויוצקים את המדיה הנותרת ממנו לתוך המדגם שנאסף גם כן.צנטריפוגה המדגם ב 650 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שאף את התקשורת, נזהר לא להפריע או לשוגם את גלולה. תעבירו את גלולה במיליליטר אחד של תספוס תמוגה של תאי דם אדומים מצוננים, והעברו את המתלה הזה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיקרוליטר, וטלטלו בעדינות את הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. ואז שאף את פתרון תותבת תאי הדם האדומים. תן שימוש חוזר לכדור בתתכונה המכילה PBS, חוסם FcR ומיקרוביאדות CD-146 אנטי-אנושיות.דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS מצונן. צנטריפוגה ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS מצונן. לאחר מכן, מניחים עמוד LS מגנטי על מתלה מגנטי בטמפרטורת החדר. הקף את העמודה לכותרות על-ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS, ומתן אפשרות לאמצעי האחסון כולו לזרום דרכה.השלך את הזרימה דרך. טען את הדגימה בעמודה המגנטית ומחק את הזרימה. לשטוף את הטור שלוש פעמים באמצעות שלושה מיליליטר של PBS מקורר עבור כל לשטוף.השלך את כל הזרימה הזו. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של PBS מצונן לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. מוציאים את עמוד המגנט מהמדף ויוצקים את ה-PBS מהצינור לתוך העמוד.הנח במהירות את העמוד לתוך צינור הצנטריפוגה כדי לתפוס את הזרימה דרך. מיד לצלול עם הבוכנה המסופקת עם העמוד. המדגם מטוהר כעת ומוכן קיבעון, כתמים או תרבות.במחקר זה, התאים מטוהרים מטיפים לצנתור ברבור-גנץ לאחר צנתור לב ימין. תאים אלה נקשרים לעמודת בחירה של CD-146, ויש להם פרופילי פיזור קדימה וצד שאינם ניתנים להבחנה מתאי אנדותל עורק ריאתי ראשוניים מתורבתים. מכיוון שבלון הקטטר נמצא רק במגע פיזי עם נדן המבוא, קיר כלי הדם הריאה והדם, והתאים מוכחים כבלתי נגזרים מהדם, ההנחה היא שהם נגזרו מקיר כלי הדם הריאה.בעקבות ההליך תאים שנקטפו ניתן לנתח על ידי מגוון רחב של שיטות, כגון cytometry זרימה, qPCR, רצף, פרוטאומיקס. תפוקת התאים נמוכה מדי עבור כתם מערבי קונבנציונלי, אך ניתן לשקול מתודולוגיות סופגות קלט נמוכות. תאים יכולים להיות מתורבתים, אבל זה מאוד קשה, וזה לא תמיד מצליח בידיים שלנו.אם יש לנסות את התרבות, חשוב למזער את המרווח בין איסוף קצה הצנתור מהמטופל, לבין שלבי הטיהור וציפוי הסופיים, ובטח שהדגימה נשמרת קרה לאורך כל שלבי הטיפול של השיטה. אל תשכח שהפרוטוקול הזה כרוך בעבודה עם דם ורקמות אנושיים. יש לשמור על אמצעי זהירות אוניברסליים.בפרט, יש צעד מוקדם בפרוטוקול שכולל החדרת מחט חדה לקצה החתך של קצה הקטטר אשר מזוהם בדם של המטופל. לעולם אל תשכח כי קצה קטטר חייב להיות מוחזק עם hemostats במהלך שלב זה, לא עם האצבעות שלך, על מנת למנוע את הסיכון של מקל מחט.

harvest-endothelial-cells-from-balloon-tips-swan-ganz-catheters-after

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שיטה טיטניום זריעת דם biomaterials ליצור קשר עם תאים עצמיים ו biocompatibility בדיקות מתואר. שיטה זו משתמשת ובתאים אנדותל צינורות טיטניום, זורעים בתוך דקות של ניתוח ההשתלה לתוך חזירי venae cavae. טכניקה זו ניתנת להתאמה מכשירים רבים אחרים ביו מושתלת.

עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקוד הלב-ריאה בחזירים ערים, במנוחה ובמהלך פעילות גופנית מדורגת על הליכון. מכשור כרוני מאפשר מדידות המודינמיות חוזרות ונשנות שאינן מושפעות מחומרי הרדמה קרדיו-דיכאוניים.

מיקום כירורגי של קטטרים לטווח ארוך בדיקת תרגיל לב וכלי דם ב חזירים

המוצג כאן הוא פרוטוקול לקצירת וריד אנדוסקופי מהרגל התחתונה, אשר ניתן להציג בבטחה בהשתלת עורק כלילי שגרתית. שתלי וריד להציג איכות השתל מעולה בעקבות פרוטוקול זה מתוקננת עם מיקום של הרגליים, גישה פולשנית מינימלית לווריד, ו הקציר אנדוסקופית ורידים אנאליים.

סינגיזינג אנדוסקופי עם קציר וריד לשיפור איכות השתל וריד הגדול מהרגל התחתונה

החייאה ודפיברילציה הם האפשרויות הטיפוליות היעילות היחידה במהלך דום לב הנגרמת על ידי פרפור פרוזדורים. מודל זה מציג משטר מתוקננת כדי לגרום, להעריך, ולטפל במצב פיזיולוגי זה במודל חזירי, ובכך לספק גישה קלינית עם הזדמנויות שונות עבור איסוף נתונים וניתוח.

מודל מתוקננת של פרוזדורים המוח ותמיכה מתקדמים בחיים הלב בחזירים

כאן אנו מציגים גישה של חזה סגור להקלטות לולאת נפח לחץ דו-חדרית המבוססות על אשפוז בחזירים עם תפקוד לקוי חריף של החדר הימני.

סגור חזה Biventricular לחץ-נפח לולאה הקלטות עם צנתרי כניסה במודל חזירי

מתוארת גישה אמינה וניתנת לשחזור להחדרה ותחזוקה של קטטר היקמן מנהור לגישה ארוכת טווח של כלי דם בחזירים. הצבת צנתר ורידי מרכזי מאפשרת דגימה יומית נוחה של דם שלם מבעלי חיים ערים ומתן תוך ורידי של תרופות ונוזלים.

שימוש בצנתר היקמן לגישה ארוכת טווח לכלי דם במודל חזירי פרה-קליני

מחקר זה מציג מודל חזירי של תסחיף ריאתי (PE) באמצעות תסחיפים אוטולוגיים גדולים המשכפלים PE חריף בסיכון בינוני. המודל מתאים היטב להערכת פתופיזיולוגיה ותגובות לטיפול.

מודל חזירי של תסחיף ריאתי אוטולוגי חריף

היצרות ורידים ריאתיים (PVS) היא סיבוך מסכן חיים של פיברוזינג מדיאסטיניטיס (FM), עם פרוגנוזה גרועה אם לא מטפלים בה כראוי. נכון לעכשיו, אנגיופלסטיקה אנדווסקולרית מבוססת צנתר היא אסטרטגיה טיפולית מבטיחה עבור PVS הקשור ל-FM. פרוטוקול זה מתאר בעיקר גישה מדורגת להליך הטרנסקטטר עבור PVS הקשור ל-FM.

אנגיופלסטיקה אנדווסקולרית מבוססת צנתר להיצרות וריד ריאתי הקשורה לפיברוזינג מדיאסטיניטיס

מאמר זה מספק פרוטוקול להערכת אקו בגודל חדר ממני ויתר לחץ דם ריאתי בעכברים. יישומים כוללים קביעת הפנוטיפ והערכה סידורי במהונדס ומודלי עכבר מושרה רעל של קרדיומיופתיה ומחלת כלי דם ריאתי.

אקו הערכה של הלב הימני בעכברים

מאמר זה מתאר את מדידת תפקוד החדר השמאלי של העכברים באמצעות ניתוח לחץ/נפח בקצב לב שונה.

צנתור לב בעכברים כדי למדוד את יחסי נפח לחץ: חקירת אפקט Bowditch

למד שיטה לבידוד תאי אנדותל מעורק ריאתי מקצות קטטר Swan-Ganz לאחר צנתור לב ימני. הטכניקה מאפשרת ביופסיה תאית בטוחה לחקר מחלות כלי דם ריאתיים ומנגנוני יתר לחץ דם ריאתי.

הקציר של תאי אנדותל של קצות בלון קטטר Swan-גנץ לאחר צנתור הלב הימני

גלה סרטונים נוספים