Name: דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למדו שיטה לדמיון אקסונים של נוירונים מוטוריים ברגלי Drosophila בוגרים באמצעות חלבון פלואורסצנטי. הפרוטוקול כולל קיבוע, הרכבה ודימוי תלת-ממדי לחקר מבני עצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים רוברט רנארד על הכנת אוכל לטוס בינוני. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק NIH NS070644 כדי R.S.M., במימון עמותת ALS (#256), עקרות (#AJE20170537445), ATIP-Avenir תוכנית כדי במקום

1. ניתוח של קיבוע רגל
<ol><li>לקחת צלחת זכוכית רב טוב מילוי מספר מתאים של וולס עם 70% אתנול. להוסיף 15 – 20 CO2-מרדימים זבובים (של סקס, בכל גיל) לכל אחד טוב ואני באמצעות מברשת, בעדינות כי אמחה קלות את הזבובים בתוך תמיסת אתנול עד זבובים מלא טובע. הערה: השלב זה כדי להסיר את hydrophobicity של הקוטיקולה. אנחנו לא שוטפים עבור יותר מ- 1 דקות, כי פעולה זו מגדילה אוטומטית-זריחה של הקוטיקולה.</li>
	<li>יש לשטוף את הזבובים 3 פעמים עם פתרון דטרגנט חומרים פעילי שטח nonionic 0.3% 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). שמור את הזבובים בפתרון זה לפחות 10 דקות. הערה: הרגליים כדאי קבועים בעת כלילת דטרגנט, אשר, ככל הנראה להגדיל את חדירת מקבע בתוך הרגל.</li>
	<li>מניחים צלחת רב טוב על הקרח יחד עם שפופרת של 4% paraformaldehyde (PFA). הערה: הכנת טרי 4% כדורגלן מ 16% PFA אתנול מניות פתרון חופשי הוא קריטי.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים כדי להסיר את הראש והבטן של הזבובים מבלי להזיק על קטע בית החזה או הרגליים. הערה: הסרת הבטן מקל להחזיק את הזבוב ומנתחים את הרגליים.</li>
	<li>לנתח את הרגליים של המקטע בית החזה עם מלקחיים ולמקם את הרגליים הבארות המכיל 4% מחברים. עבור זה, לדחוף בעדינות אך בתקיפות בצומת coxa-החזה בעזרת קצה מלקחיים בסדר עד לניתוק הרגל.</li>
	<li>לתקן את הרגליים ב 4% מחברים בין לילה ב 4 ° C (כ 20 שעות סה כ).</li>
	<li>לשטוף את הרגליים עם פתרון דטרגנט חומרים פעילי שטח nonionic 0.3% ב- PBS 1 x, 5 x למשך 20 דקות.</li>
	<li>החלף את המאגר כביסה הרכבה בינונית. לשמור את הרגל הרכבה בינוני לפחות יום לפני הרכבה כדי לאפשר חדירה מלאה שלה לתוך הרגל. הערה: אם המדיום הרכבה בעלי צמיגות גבוהה, לדלל המדיום הרכבה עד 80% עם 1 x PBS כי השינוי הפתאומי של צמיגות יכול לגרום את הקוטיקולה לכווץ או נזק המבנה הכולל של הרגל. בהתאם הנהג Gal4 , זבובים יכולים להישמר שבועות 1 עד 3-4 מעלות צלזיוס הרכבה מדיה עד הרכבה.</li>
</ol>2. הרגל הרכבה
<ol><li>במקום כ 20 µL של 70% גליצרול, בצד שמאל של שקופיות מיקרוסקופ וכן כיסוי עם מרובע 22 x 22 מ מ2 coverslip (איור 2 א, ב'). פיפטה µL כ- 10 של הרכבה בינונית לאורך קו מקביל, במרחק קטן מהקצה הימני של coverslip הזה. להוסיף עוד 30 µL של הרכבה בינונית נוספת על הצד הימני של השקופית (איור 2C). הערה: בעת החלת של coverslip על הרגליים (ראה להלן) המדיום הרכבה בעדינות יתפשט תחת coverslip של אתרים בולטים ברגליים בלי ועקרו אותם מבתיהם.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים בסדר הרם את הרגל מהפתרון, בעדינות את זה המדיום הרכבה ליד coverslip השמאלי. לעשות את אותו הדבר עבור כל רגל וליישר אותן מלמעלה למטה (איור דו-ממדי).<ol>
<li>הרם, להעביר את הרגליים בכל טיפת בינוני בין שני קצות המלקחיים. אוריינט הרגליים בשתי דרכים: מהצד החיצוני למעלה או למטה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר כל הרגליים (עד ל 6-8 רגליים יכול להיות מותקן) מיושרים כראוי, לשים את coverslip השנייה על הרגליים כך coverslip הזה מונח מעט על coverslip הקודם שמוקם (איור 2E) כדי לאפשר שטח בין coverslip את הרקמה למנוע את הרגליים של מקבל פגום (איור 2G). הערה: לחלופין, להשתמש בארות מדבקה או שעווה אורתודונטי כדי ליצור רווח בין coverslip של השקופית.</li>
	<li>השתמש לק כדי לאבטח את המיקום של coverslips בכל פינה (2F איור). הערה: הרקמה מוכן כעת ליצירת תמונה.</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>להגדיר מסלול יחיד באמצעות הלייזר 488 ננומטר וגלאים שני בו זמנית להשיג GFP פלורסצנטיות והן לציפורן אוטומטי-זריחה. שימוש בפקד טווח או התצוגה המחוון בחלון ספקטרלי של החלון נתיב האור של התוכנה, קביעת זיהוי טווח (גלאי 1) גלאי אחד של השני בין 498-535 nm (גלאי 2) בין 566-652 ננומטר. הערה: בדרך כלל, גלאי 1 צריך להיות גלאי חאספ והגלאי 2 צינור האופטיקה. הערוץ 498-535 בצורה אופטימלית מזהה אות GFP אך גם מזהה אוטומטית פלורסצנטיות מ הקוטיקולה. עם זאת, בערוץ 566-652 מזהה רק את אוטומטי פלורסצנטיות מ הקוטיקולה (איור 3 א).</li>
	<li>השתמש 20 X או 25 X שמן טבילה אובייקטיבי, 1024 x 1024 פיקסלים, עומק 12 סיביות והגדרת המרווח Z 1 מיקרומטר. פיקסל קבע להתעכב זמן כמו µs 1.58 בערך ולאחר ממוצע 2 מסגרות/תמונה. השתמש מטרות עם מפתח נומרי גבוהה.</li>
	<li>הגדר כל ההגדרות האחרות, בהתאם מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה התוכנה בשימוש.<ol>
<li>הקפד לקבל אות לציפורן בהיר יותר מ- 566-652 הגלאי ולא הגלאי 498-535. כדי לעשות זאת, השתמש אותו הכוח לייזר 488-לייזר לגלאי בשני. באמצעות הסמנים רוויה, תכוון תחילה את הרווח של גלאי 1 כדי לקבל אות GFP מספיק פיקח (איור 3B, יח). ואז להתאים את הרווח של גלאי 2 כדי להבטיח כי אזורים מסוימים קליטה גבוהה לציפורן (קצוות של הרגליים, המפרקים) לייצר אות רווי בתוך הגלאי הזה (איור 3C, E).</li>
		<li>אם הרגל המורחבת וגדולים גם ליצירת תמונה בתוך מסגרת בודדת, השתמש באפשרות אריח או מיקום בתוכנת הדמיה במיקרוסקופ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשחזר את התמונות הסופי או באמצעות המיקרוסקופ קניינית imaging התוכנה או באמצעות ImageJ/פיג'י freeware (ראו להלן).</li>
</ol>4. post Imaging עיבוד
<ol><li>פתח את המחסנית קונאפוקלית בפיג'י/ImageJ.<ol>
<li>להשתמש תוסף Bioformats (תוספים | ביו-תבניות | Bio-formats יבואן) בפיג'י לפתוח תמונות שאינן בתוך. בפורמט TIF מ קניינית הדמיה חבילות תוכנה9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לפצל את הערוצים על-ידי בחירה תמונה | צבע | פצל ערוצים. הערה: אם תמונות מתוך מספר מיקומים נעשו חייב להיות recombined, השתמש של pairwise תפרים תוסף בפיג'י מ (תוספים > Stitching > של Pairwise תפרים)10,11.</li>
	<li>כדי לחסר את האות לציפורן האות ה-GFP, פתח את המחשבון התמונה (תהליך | תמונת מחשבון): לבחור את המחסנית גלאי 1 1 תמונה (GFP + לציפורן) (איור 4A), על החלון מבצע בחר לחסרובחר את המחסנית של גלאי 2 תמונה 2 (לציפורן) (איור 4B). כתוצאה מכך, רק אנדוגני GFP האות (GFP), מתקבל (איור 4C).<ol>
<li>מיזוג בחזרה זה מחסנית (GFP) עם הערימה 'לציפורן בלבד' המתקבל גלאי 2 (איור 4B תמונה | צבע | מזג ערוצים) כדי לקבל הכוללת תמונות RGB של האות GFP רקמות ספציפיות, כמו גם את האות לציפורן, אשר מסייע בזיהוי של האקסון ובשבילים בתוך המקטעים הרגל (איור 4D).</li>
		<li>כוונון הניגודיות והבהירות של כל תמונה (תמונה | התאם | Brightness/Contrast) ולאחר מכן ליצור תמונת RGB יחיד (תמונה | סוג | צבע RGB). הערה: כדי ליצור תמונה מוקרנת מרבי של Z-המחסנית של (תמונה | ערימות | פרוייקט Z...), השתמש הטלה בעוצמה מרבית כדי להפוך את האות ה-GFP ממוצע עוצמת הקוטיקולה, אשר לאחר מכן ניתן לכוונן את הבהירות לפני מיזוג בין שני הערוצים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלופין, להשתמש במאקרו חיסור אוטומטי ועיבוד תמונות בפיג'י/ImageJ. העתק את הטקסט משלימה 1 הקובץ בעורך המאקרו (תוספים | חדש | מאקרו), לשמור את המאקרו בתיקיה Plugins, ולהפעיל מחדש ImageJ/פיג'י פעם כדי שניתן יהיה להשתמש במאקרו.<ol>
<li>כדי להשתמש במאקרו, פתח את המחסנית קונאפוקלית ולאחר לפתוח את החלון בהירות/ניגודיות (תמונה | התאם | Brightness/Contrast). ואז להפעיל את המאקרו (תוסף | מאקרו | לרוץ) ולעקוב אחר ההוראות.</li>
		<li>כאשר תתבקש לציין את הפעולה (תמונת מחשבון חלון), לבחור תמונה 1 כמו מחסנית 1 (GFP), תמונה 2 כמו מחסנית 2 (לציפורן) וחיסור. הערה: המאקרו יוצר תמונת הקרנה מקסימלי של אות ה-GFP מעובד (MAX_Result של stack1), הקרנת הקוטיקולה (AVG_stack2), התוצאה של החיסור של הערימה לציפורן מתוך הערימה GFP (תוצאה של stack1), ולא את מעובד ממוצע מחסנית לציפורן (stack2).</li>
		<li>כשנשאל להתאמת החדות, השתמש בפקדים בחלון בהירות/בקרה כדי לכוונן הבהירות/ניגודיות של התמונה הקרנה מקסימלי של ה-GFP, ואת התחזית הממוצע הקוטיקולה, כדי ליצור תמונת RGB הממוזג של שני אותות מציג את ה-GFP ב גרין, את הקוטיקולה באפור. מיזוג תוצאה של stack1, stack2, באופן דומה ליצור בשילוב GFP ואת לציפורן מחסנית יכול לשמש בשלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להמחיש את הרגליים בתלת מימד, השתמש תוכנות תלת-ממד מיוחדות עם המחסן החדש שנוצר (איור 4E).<ol>
<li>פתח את מחסנית ה-RGB עם תוכנת תלת-ממד (ראה טבלה של חומרים). בחלון דו-שיח מוקפצות, בחר כל הערוצים במקטע המרה מצב והזן את גודל voxel (נפח של פיקסל). הערה: כל המידע הנחוץ כלול בקבצי תמונה מ בכל תוכנה קניינית מיקרוסקופ בשימוש.</li>
		<li>על ערוץ 2 מודול (אות GFP), לחץ לחיצה ימנית ובחר תצוגה | volren. לאחר מכן, לחץ על מודול volren. במקטע מאפייני (השמאלית התחתונה של המסך) לחץ על שמאל על עריכה ובחר volrengreen.col. על ערוץ 1 מודול (אות לציפורן) לחצו לחיצה ימנית ובחרו תצוגה | volren. לאחר מכן, לחץ על מודול volren. במאפייני מקטע שמאל לחץ על מתקדם , בחר ddr (תצוגה כמו radiograph שקוף), מכן התאם את ערך גמא לראות את הרקע לציפורן (איור 4E).</li>
		<li>כדי ליצור סיבוב תלת-ממד, לחץ לחיצה ימנית על ' פרוייקט ' מחסנית '. לאחר מכן בחר להנפיש | לסובב. שמאל לחץ על המודול לסובב.</li>
		<li>מאפייני מקטע לחץ על השתמש bbox במרכז. על המודול לסובב באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר לחשב | הסרטים. על מודול הסרטים לחץ על לחצן העכבר השמאלי. במקטע מאפייני שמאל שמאל על מתקדם (למעלה מימין ' מאפייני ').</li>
		<li>בשדה שם הקובץ מלא את שם הסרט הסיבוב. השדה ' איכות ' כתבו 1 (מקסימום איכות). נשאיר את מסגרת 200 אם סיבוב s 8.3 רצוי (מספר זה יכול להיות ירד או עלה כדי לשנות את מהירות הסיבוב). לאחר מכן הקש להחיל (הכפתור הירוק, השמאלית התחתונה של המקטע מאפיינים (ראה וידאו 1)).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).</li>
<li>Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li>
<li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+and+Birth+Date+Specify+Motor+Neuron+Targeting+and+Dendritic+Architecture+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li>
<li>Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+and+architecture+of+Drosophila+leg+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).</li>
<li>Enriquez, J., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+Individual+Adult+Motor+Neuron+Morphologies+by+Combinatorial+Transcription+Factor+Codes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li>
<li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter%3A+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+Strategies+Despite+Shared+Lineages+of+Motor+Neurons+and+Glia+to+Achieve+Robust+Development+of+an+Adult+Neuropil+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila.</a> Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).</li>
<li>ImageJ. Bio-Formats. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Bio-Formats">http://imagej.net/Bio-Formats</a> (2018).</li>
<li>ImageJ. Image Stitching. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Image_Stitching">http://imagej.net/Image_Stitching</a> (2018).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li>
<li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila%3A+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199(2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הקוטיקולה של דרוזופילה למבוגרים, של פרוקי רגליים אחרים, אשר מכיל פיגמנטים כהים רבים, זו היא מכשול גדול לצפייה מבנים בתוך הגוף שלהם. בנוסף, מומלץ מאוד פלורסנט אוטומטי אשר נעשה גרוע יותר על ידי קיבוע. שתי תכונות אלה הן בעייתי מאוד עבור תצפיות של צבעי פלורסנט או מולקולות בתוך הגוף של בעלי שלד חיצוני.
התהליך שתיארנו, אנו משתמשים באופן שגרתי במעבדה התשואות תמונות נקיות ומפורט של האקסון מסלולים ושל שלהם סופים מסוף ברגליים דרוזופילה למבוגרים. חשוב מתקבל אות GFP נקי ללא כל זיהום מן ידי קרינה ...

כמו האיבר חוליות, הרגל למבוגרים דרוזופילה מאורגן למקטעים. כל רגל לטוס מכיל 14 השרירים, שכל אחת מהן כוללת סיבי שריר מספר1,2. הגופים תא של הרגל למבוגרים MNs ממוקמים ב (prothoracic) T1, T2 (mesothoracic), ו T3 הגרעינים (metathoracic) בכל צד של חוט עצבי הגחון (VNC), הנדסי מקביל חוליות חוט השדרה (איור 1). ישנם כ- 50 MNs כל הגרעינים, היעד שבו השרירים ארבעה חלקים של הרגל חולשת (coxa תל הירך, עצם הירך, שוקה) (איור 1)3. חשוב, כל רגל מבוגרים בודדים MN יש זהות מורפולוגי ייחודי זה מאוד סטריאוטיפית בין בעלי חיים3,4. כל MNs ייחודיים אלה נגזרים מתאי גזע 11, שנקרא neuroblasts (שהודיעו) בהפקת הרגל MNs במהלך ה3,דרגות זחל4. בסוף כל הזחל MNs postmitotic ילדותי להבדיל במהלך המטמורפוזה לרכוש שלהם ובשבילים דנדריטים ספציפיות ויעדים עצב מסוף המגדירים שלהם3,ייחודי מורפולוגיה4. קודם לכן בדקנו את ההשערה כי קוד קומבינטורית של גורמי שעתוק (TFs) מציינת המבנה הייחודי של כל רגל למבוגרים דרוזופילה MN5. כמודל, השתמשנו השושלת B, לאחד שושלות NB 11, אשר מייצרת שבעה מתוך MNs והפגינו קוד קומבינטורית של TFs הביע ברגל למבוגרים postmitotic MNs מכתיבה מורפולוגיות בודדים שלהם. על ידי reprograming את הקוד TF של MNs היינו מסוגלים להחליף MN מורפולוגיות באופן צפוי. אנחנו קוראים להם שר: mTFs (TFs מורפולוגי)5.
אחד החלקים המאתגרים ביותר של המורפולוגיים של MNs למבוגרים הוא להמחיש את האקסונים דרך הקוטיקולה עבה, auto-פלורסנט עם רזולוציה גבוהה. בדרך כלל מתייגים אקסונים עם GFP מתויג ממברנה מתבטאת MNs עם מערכת בינארית הביטוי, כגון DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP או DVglut-העל / QUAS mCD8::GFP, כאשר DVglut הוא נהג חזק לידי motoneurons6. על ידי שילוב של כלים אלה עם טכניקות טיפול נוספות המשובטים פסיפס ניתוח עם סמן repressible (MARCM)7, cis-MARCM8או MARCMbow5, אנחנו ניתן להגביל את הביטוי GFP כדי subpopulations של MNs ביצוע הניתוח פנוטיפי של אקסונים קל יותר. יש לנו שנוצר פרוטוקול על מנת לשמור על הרגל מורפולוגיה עצב MN ללא פגע עבור שחזור 3D הדמיה ובעקבות שתתייחסי לנושאים ספציפיים מהותי הרגל דרוזופילה למבוגרים כגון קיבוע (1) של המבנים הפנימיים של הרגל למבוגרים מבלי להשפיע על מורפולוגיה האקסון ביטוי פלורסנט אנדוגני, לשריר הרגל, (2) הרכבה של הרגל כדי לשמר את המבנה הכללי תחת של coverslip, את הכיוון המתאים לעיבוד כדי להשיג את הקוטיקולה תמונה הדמיה, ו- (3) ברקע, כמו גם עצב אות ניאון. אמנם יש כבר מפורט פרוטוקול זה איתור פלורסנט ביטוי MN אקסונים, ניתן להחיל אותה לדמיין רכיבים אחרים של הרגל neuromusculature של פרוקי רגליים.

<table><tbody><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>פישר</td><td>E/6550DF/17</td> חומר ניקוי פעילי שטח <td>לא יוני בדרגת ריאגנט אנליטי</td></tr><tr><td></td><td>מוחלט סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8787</td><td>טריטון X-100, לביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F6521</td><td>מלקחיים תכשיטנים, דומונט מס' 5</td></tr><tr><td>צלחת זכוכית מרובת בארות</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>71563-01</td><td>9 חלל פיירקס, 100 מ"מ x 85 מ"מ</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Thermofisher</td><td>28908</td><td>Pierc 16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנול</td></tr><tr><td></td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 229-1</td><td>גליצרול (ביולוגיה מולקולרית)</td></tr> <tr><td>Spacers</td><td>Sun Jin Lab Co</td><td>IS006</td><td>iSpacer, ארבע בארות, בסביבות 12 &mu; L נפח עבודה לבאר, קוטר 7 מ"מ, עומק 0.18 מ"מ</td></tr><tr><td>ריבוע 22 מ"מ x 22 מ"מ כיסויים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FIS#12-541-B</td><td>עובי מס' 1.5-0.16 עד 0.19 מ"מ</td></tr><tr><td>הרכבה מעבדות וקטור בינוני</td><td></td><td>H-1000</td><td>Vectashield Antifade הרכבה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td> בינוני <td>קארל זייס</td><td></td><td>LSM780; אובייקט בשימוש LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (שמן/ סיליקון/גליצרול/מים טבילה) (420852-9871-000)</td></tr> <tr><td>תוכנת הדמיה</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2011</td></tr><tr><td>תוכנת תלת מימד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Amira 6.4</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>ImageJ/FIJI</td></tr></tbody></table>

דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

רוב העבודה על המפרט עצביים התבצע במודלים גנטית, מבחינה פיזיולוגית צייתן כמו C. elegans דרוזופילה הזחלים, דגים, אשר כולם עוסקים תנועות undulatory (כמו זחילה או שחייה) כמצב העיקרי שלהם ומכניקה. עם זאת, יותר מתוחכם הבנה של מפרט נוירון מוטורי הפרט (MN) — לפחות מבחינת להודיע טיפולים למחלות — דורש מערכת לא פחות צייתן יותר מודלים מורכבים מבוססי גפה ומכניקה של סכמות חולייתנים. למבוגרים דרוזופילה גינקולוגיות המערכת אחראית על הליכה עונה כל קריטריונים אלה בקלות, שכן במודל זה ניתן ללמוד את המפרט של מספר קטן של הרגל בקלות מכובד MNs (כ 50 MNs לכל הרגל) באמצעות שני עצום מערך של כלים רבי-עוצמה גנטי, בהקשר פיזיולוגיים של מזימת מבוססי גפה ומכניקה. כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את העצבוב שריר הרגל ב זבוב למבוגרים.

כפי שמוצג באיור4, הליך זה מאפשר הדמיה מצוינת של אקסונים GFP שכותרתו ברגליים דרוזופילה למבוגרים, יחד עם ובשבילים מסוף שלהם. חשוב מתקבל אות GFP נקי ללא כל זיהום מן ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלטת לציפורן הרגל. האיתות הקוטיקולה אז יכול להיות משולב עם האות ה-GFP כדי לזהות את המיקום של אקסונים ברגליים (4E איור, איור 1ו- 1 וידאו). אנושות, חשוב לקבל את הרגליים היטב קבוע. איור 5</...

כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את מיקוד עצב עם חלבון נמכרות ברגליים למבוגרים של זבוב החומץ על ידי קיבוע, הרכבה, הדמיה, ההדמיה שלאחר צעדים.

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות להתבוננות באותות מחלבונים פלואורסצנטיים אחרים או לשמש לאקסונים תמונה במבוגר אחר היתרון העיקרי של טכניקה זו להקל על שחזור תלת מימדי מעולה הדמיה של האקסונים ואת הסרבורים סופניים שלהם. התחל על ידי מילוי המספר המתאים של בארות בצלחת זכוכית רב באר עם 70% אתנול. השתמש במברשת כדי להוסיף 15 עד 20 זבובים הרדמה פחמן דו חמצני בכל גיל או מין לכל באר בעדינות לטבול את הזבובים לתוך האתנול עד שהם שקועים לחלוטין.לאחר לא יותר מדקה אחת, יש לשטוף את הזבובים שלוש פעמים בתמיסת דטרגנט לא יונית למשך 10 דקות לפחות. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש במטליות כדי להסיר את הראש והבטן של כל זבוב מבלי לפגוע בקטע בית החזה או ברגליים ולהשתמש בקצה של זוג מדפים עדין כדי להפעיל בעדינות אך בתקיפות לחץ על צומת coxa-thorax לנתק רגל אחת מקטע בית החזה. מניחים את הרגליים באר אחת של צלחת רב באר חדשה המכילה טרי מוכן 4% paraformaldehyde על קרח עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.חשוב לדחוף את הרגליים בעדינות לתוך חיץ קיבוע מבלי לתת להם לצוף כדי לקבל רגליים קבועות היטב. למחרת, לשטוף את הרגליים חמש פעמים טרי 0.3% פתרון דטרגנט פעילי שטח לא יוני במשך 20 דקות לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, להחליף את חומר הניקוי עם מדיום הרכבה ולשמור את הרגליים במדיום הרכבה לפחות 24 שעות.למחרת, להוסיף כ 20 microliters של 70% גל

visualize-drosophila-leg-motor-neuron-axons-through-the-adult-cuticle

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו תיאר תכונות מבניות של גליה-neuromuscular הסינפסות הכנה בתוך-out רקמת הרומן של זחלי זבוב חי באמצעות צבעי ניאון עם מיקרוסקופיה confocal. אנחנו שכותרתו מסופי נוירון לחיות עם נוגדנים העיקרי ניאון HRP, וגם דמיינו את החלל perisynaptic עם Dextrans ניאון.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

הזחלים תסיסנית melanogaster לספק מערכת מודל אידיאלי לחקור את המנגנונים של תחבורה axonal בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. באמצעות הליך זה, 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות ניתן להשוות את הזחלים סוג בר.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

פרוטוקול זה דן חי דיסקציה...

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית...

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן.

הכנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים מרכזיים עבור<em&gt; באתר</em&gt; התיקון clamping

סרטון זה מתאר שיטה לנתח, לתקן ולהרכיב את הרגל הבוגרת של דרוזופילה תוך שמירה על שלמותה העצבית-שרירית לצורך ניתוח הדמיה.

עיבוד רגלי חרקים למיקרוסקופ פלואורסצנטי: שיטה לשימור מבנים עצביים-שריריים לדימות

מקור: Guan, W., et. al. הדמיה Drosophila Leg motor neuroon axons דרך הציפורן הבוגרת. J. Vis. Exp. (2018) סרטון זה מדגים הדמיה שלDrosophila רגליים עם נוירונים מוטוריים ירוקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לייזר ושני גלאים לוכדים GFP ואוטו-פלואורסצנטיות של הציפורן. התמונות מעובדות על-ידי פיצול ערוצים, הפחתת אוטו-פלואורסצנטיות ומיזוג לתמונה מורכבת צבעונית כדי להמחיש אקסונים בתוך מקטע הרגליים.

הדמיה של נוירונים מוטוריים בעלי תווית פלואורסצנטית ברגל דרוזופילה בוגרת

מקור: Jeong, S. הדמיה של דפוס ההקרנה האקסונלי של נוירונים מוטוריים עובריים ב-Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הקרנות אקסונליות בעוברים Drosophila. תיוג חיסוני של נוירונים מוטוריים, דיסקציה מדויקת לחשיפת מבנים עצביים ומיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות חושפים ביחד ארכיטקטורה עצבית מפורטת, תוך שימת דגש על דפוסי ההקרנה האקסונלית.

הדמיה של דפוסי הקרנה אקסונליים של נוירונים מוטוריים עובריים בדרוזופילה

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

אנו מתארים טכניקת ניתוח המשמרת את הארכיטקטורה של הצומת הנוירו-שרירי ומאפשרת מחקר אימונוציטוכימי מפורט של נוירונים מוטוריים ברגלו הבוגרת של דרוסופילה .

ניתוח ואימונוהיסטוכימיה של הרגל הבוגרת של דרוסופילה לזיהוי שינויים בצומת הנוירו-שרירי עבור נוירון מוטורי מזוהה

למדו שיטה לדמיון אקסונים של נוירונים מוטוריים ברגלי Drosophila בוגרים באמצעות חלבון פלואורסצנטי. הפרוטוקול כולל קיבוע, הרכבה ודימוי תלת-ממדי לחקר מבני עצבים.

דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים

גלה סרטונים נוספים