ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על הרכב וארגון דינמי של קומפלקסים חלבון פוטוסינתטית קרום תילאקואיד הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח של אינטראקציות תפקודיות בין מתחמי חלבון מקומיים ומבהיר את הפלסטיות של הארגון מורכב חלבון בתנאים סביבתיים משתנים. הגדר את גלגלית הג'ל שמונה ס"מ על ידי צלחות 10 ס"מ על פי הוראות היצרן באמצעות 0.75 מילימטר רווחים.

מניחים מערבל הדרגתי על צלחת ערבוב ומחברים אותו עם המשאבה peristaltic על ידי צינורות. מחברים מחט מזרק לקצה השני של הצינור ומ מניחים את המחט בין הזכוכית לצלחת האלומיניום. מניחים ערבוב מגנטי בתא הכבד.

הכינו פתרונות צנטריפוגה חרוטיים של 3.5% ו-12.5% בצינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 מיליליטר כמפורט בפרוטוקול הטקסט לשימוש עבור שיפוע ג'ל ההפרדה. כדי למנוע פולימריזציה בטרם עת לשמור את צינורות צנטריפוגה על קרח בעת הכנת הפתרונות. הוסף 5%APS ו- TEMED ממש לפני הוספת הפתרונות למיקסר ההדרגתי.

פיפטה 12.5% פתרונות לתא הכבד. הסר בועות אוויר מהתעלה המחברת את התא הקל והכבד על ידי פתיחת השסתום המחבר בין שני התאים ומאפשר פתרון להיכנס לתא האור. סגור את השסתום ואת פיפטה עקבות של פתרון בחזרה לתא הכבד.

לבסוף, פיפטה פתרון 3.5% לתא האור. הפעל את המערבב המגנטי. פתח את השסתומים, והדליק את המשאבה ההיסטנטית.

אפשר לפתרונות הג'ל לזרום בין צלחת הזכוכית לאומיניום בקצב זרימה של כ-0.5 מיליליטר לדקה. המחט חייבת להיות מעל הנוזל בכל עת. כאשר התאים הכבדים והאור התרוקנו, מלאו אותם במים אולטרה-חמים.

ולאפשר למים ל כיסוי עדין של משטח הג'ל. פולמריזציה של ג'ל אורכת כשעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. הכינו את פתרון ה-3%acrylamide לג'ל הערימה בטמפרטורת החדר.

פיפטה ג'ל הערימה על גבי ג'ל ההפרדה המפולמורת ומ מניחים מסרק ג'ל מדגם בין צלחת הזכוכית ואלומיניום הימנעות בועות אוויר. לאחר מתן אפשרות לג'ל לעשות פולימריזציה במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את המסרק בעדינות מתחת למים אולטרה-חמים. בשלב זה ניתן לאחסן את הג'ל בארבע מעלות צלזיוס חיוביות בתנאים לחים במשך כמה ימים.

לדלל תיליקואידים מבודדים עם חיץ 25BTH20G קר כקרח לריכוז כלורופיל סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. הכינו שני צינורות לכל דגימת תילקואיד לביצוע מינון בטא-DM ודיגיטונין. כעת הוסף אמצעי אחסון שווה של מאגר חומרי ניקוי.

מערבבים את חומר הניקוי ואת דגימת תילאקואיד בעדינות עם פיפטה ולהימנע עושה בועות אוויר. מבודדים את התילקואידים לשתי דקות על הקרח לצורך מיזביליזציה של בטא-די-אם. או 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין מתמשך על נדנדה או שייקר עבור מינון דיגיטונין.

לאחר הדגירה, להסיר את החומר חד פירעון על ידי צנטריפוגה ב 18, 000 גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס חיובי. העבר את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר והוסף 1/10 נפח של מאגר כחול מבריק קומאסי לדגימה. הגדר את הג'ל במערכת אלקטרופורזה אנכית.

מלאו את תא החיץ העליון במאגר קתודה כחול ויוצקים מאגר אנודה לתא החיץ התחתון. טען את דגימות התילקואידים לתוך האטלאקואידים. התחל את האלקטרופורזה והגדל בהדרגה את המתח כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

הפעל את הג'ל בארבע מעלות צלזיוס חיוביות באמצעות חדר קר או התאמת טמפרטורת הג'ל עם מערכת קירור. שנה את חיץ הקתודה הכחול למאגר קתודיה ברור כאשר חזית הדגימה עברה בערך 1/3 של הג'ל. לאחר הריצה האלקטרופורטית סרוק את הג'ל באמצעות סורק תמונות לאחסון תמונות בארכיון.

כדי לבצע דף 2-SDS להרכיב את מערכת אלקטרופורזה אנכית באמצעות מרווחים מילימטר אחד. הכן ג'ל SDS סטנדרטי עם מסרק דו-מיתי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חותכים את הנתיב מג'ל BN ומ מניחים אותו בצינור חמישה מיליליטר.

לאחר מכן מוסיפים שני מיליליטר של חיץ Laemmli ו דגירה את הרצועה במשך 45 דקות עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. מניחים את הנתיב בעזרת מ רווח על גבי הג'ל הימנעות בועות אוויר. פיפטה חמישה מיקרוליטרים של סמן משקל מולקולרי על פיסת נייר מסנן צרה ומ מניחים את הנייר באר הסטנדרטית.

כדי לאטום את רצועת הג'ל BN ואת נייר הסמן לשפוך 0.5% agarose במאגר פועל על גבי רצועת ג'ל ולאפשר לו להתגבש. בצע אלקטרופורזה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר הריצה האלקטרופורטית דמיינו את החלבונים עם כתם SUPRO Ruby או כתמי כסף.

תוצאות מייצגות של דפוסי חלבון תילקואיד מורכבים של בטא-DM ודגימות מנוזלות דיגיטונין מוצגים כאן. המתחמים הקטנים נודדים מהר יותר במהלך הריצה האלקטרופורטית ולכן נמצאים בחלק התחתון של הג'ל. ואילו המתחמים הגדולים נמצאים בחלק העליון של הג'ל.

דיגיטונין בדרך כלל משמר קומפלקסים של חלבונים בהרכבות גדולות יותר, בעוד שבטא DM מפריע לאינטראקציות חלבון-חלבון בין המתחמים. הרכב תת-אחת של קומפלקסים חלבון של בטא-DM ו thylakoids מנוזל דיגיטונין מוצגים כאן. יוניות המשנה של כל קומפלקס נמצאות מהקו האנכי שמתחת למתחם המיושר.

באופן עקרוני, כל נקודה בג'ל הדו-מינוני מייצגת חלבון בודד. אבל בפועל, מספר חלבונים מאותה מסה מולקולרית עשויים להיות נוכחים במקום אחד. זיהוי הנקודות מבוסס על ניתוח ספקטרומטריית מסה.

לאחר החלת הליך זה ניתן להמשיך בשיטות אחרות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח חלקיקים יחיד של קומפלקס החלבון שחמק מהג'ל הכחול המקומי על מנת לקבל תובנות מבניות על מתחמי החלבון. כדי לזהות תת-יוניות חלבון לא ידועות, ניתן לנתח את כתמי החלבון הבודדים מדף SDS דו-ממדי עם מפרט מסה. אל תשכח כי עבודה עם אקרילאמיד ו digitonin יכול להיות מזיק מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות מגן תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.