הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של טוקסיקולוגיה חרקים ופיזיולוגיה חרקים על ידי מדידת האלקטרוגנזה של מערכת העצבים המרכזית Drosophila melanogaster. זה מאפשר לבדוק מגוון רחב של השערות מדעיות ולסייע בגילוי של מצבי פעולה קוטלי חרקים חדשים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מערכת תפוקה פשוטה, ניתנת לשחזור, גבוהה יחסית עם קלט פיננסי מינימלי ללמוד את מערכת העצבים של Drosophila.

כדי להתחיל, פתח את תוכנת הרכישה/ניתוח. לחץ על התקנה בסרגל הכלים הראשי ובחר הגדרות ערוץ, שיפתחו תיבת דו-שיח. הפחת את מספר הערוצים הכולל לשלושה.

ערוץ אחד יתקליט את האות הגולמי מהמגבר עם טווח של 100 מילי-וולט. ערוץ 2 ישמש לספירת מספר האירועים מערוץ 1 שהם מעל סף נתון. לשם כך, לחץ על הכרטיסיה חישוב כדי לפתוח תפריט נפתח עבור ערוץ 2.

בחר מדידות מחזוריות, שיפתחו תיבת דו-שיח שניה. בחר ערוץ אחד כמקור. לאחר מכן, במדידת התפריט הנפתח, בחר 'דקר יחידה באירועים'.

לבסוף, באזור הגדרות הזיהוי, מהתפריט הנפתח, בחרו 'סף פשוט'. רמת הסף היא קלט בחלון התאמת הזיהוי שיש להגדיר מעל רעשי רקע. כדי להמיר את הפעילות החשמלית למגרש קצב המבוטא בהרץ, בחר אריתמטיקה בערוץ השלישי.

בחלון החדש, קלט חלק פי 1000, סוגריים ערוץ שני פסיק 2. לאחר מכן, בחר בתפריט הנפתח יחידות הרץ יחידת התדרים. סגור את תיבות הדו-שיח כדי לחזור למסך הראשי.

ציר ה-y של ערוץ 3 צריך לבוא לידי ביטוי בהרץ ובציר ה-x בזמן. לנתח את מערכת העצבים המרכזית Drosophila הזחל על ידי זיהוי תחילה וחילוץ משוטט השלישי instar Drosophila melanogaster מן בקבוקון התרבות והנחת אותו לתוך 200 microliters של מלוחים. לאחר מכן, לתפוס את ווים בפה עם זוג מדפים עדין, ולתפוס את הבטן של תולעת עם זוג שני של מדפים, עם לחץ קל, כדי למנוע קריעת שכבה cuticular דק.

בעדינות למשוך את ווים בפה והבטן בכיוונים שונים כדי להפריד את הקצה caudal של רימות מאזור הראש ולחשוף את הקרביים של הפלגוט. מערכת העצבים המרכזית תהיה שזורה עם קנה הנשימה ומערכת העיכול. להקניט את מערכת העצבים המרכזית מתוך מערכת העיכול ואת קנה הנשימה עם מדחיסות.

הניתוח של מערכת העצבים המרכזית Drosophila מן הפוגה הוא צעד קריטי להצלחה. הגנגנויות המנותחו חייבות להיות שלמות, ללא כל נזק משמעותי לעצבים המוטוריים היורדים. מספר גדול יותר של עצבים מוטוריים המחוברים לגנגסטרים יגדילו את תדרי הירי הבסיסיים.

במידת הצורך, לשבש את מחסום הדם - מוח על ידי חציית ידנית האחורי של CNS לאונות המוח עם מספריים האביב Vannas. ההטרנזיקציה צריכה להיעשות בהתבסס על המאפיינים הפיזיוכימיים של הכימיקל המשמש. הקו האדום הוא נקודת ההמרה המוצעת ו- CNS המרוטה עם גזעי עצב היקפיים יורדים שלמים המוצגים כאן.

כדי להתחיל, תחילה למשוך את אלקטרודה פיפטה זכוכית מן נימי זכוכית borosilicate להתנגדות של חמישה עד 15 מגה. הכנס את מערכת העצבים המרכזית המרוטפת לתא שעווה המכיל 200 מיקרוליטרים של מלוחים. מהדקים סיכת חרקים לא צותתה עם קליפ תנין שהוצמד לחוט הקרקע, ומכניסים את הסיכה לתמיסת מלח כדי להשלים את המעגל.

באמצעות micromanipulators, לכוון את האלקטרודה לקצה caudal של CNS מגולפת. בטל רעשי רקע על-ידי התאמת רמת הסף בתוכנת הרכישה/ניתוח לפני חיבור גזעי העצבים ההיקפיים. החל לחץ שלילי קל על המזרק כדי למשוך עצבים היקפיים לתוך אלקטרודה היניקה.

התחל את ההקלטה בתוכנה לרכישת נתונים, ואת קצב הירי הבסיסי כדי לצייד במשך חמש דקות לפני איסוף נתוני קצב ירי בסיסי. לאחר חמש דקות, להוסיף 200 microliters של מלוחים ורכב כדי להביא את הנפח הכולל של התא ל 400 microliters להתחיל הקלטת שיעורי ירי שליטה. השלך את ההכנה וההקלטה אם דפוס הטיפול בירי בקרה אינו דומה לדוגמה המוצגת כאן.

כאשר קו הבסיס הוקם לאחר שלוש עד חמש דקות של הקלטה, למשוך 200 microliters של מלוחים ולהוסיף 200 microliters של הסוכן הניסיוני מנושם מלוחים. תווית נקודת זמן זו של יישום התרופה בתוכנת רכישה /ניתוח על ידי הכללת הערה הכוללת את התרופה ואת הריכוז הסופי. מוצג כאן הוא עקבות פריקה עצבית מייצגת לפני ואחרי חשיפה DMSO.

החץ מציין את זמן היישום. תגובה מוגבלת DMSO נתפסת. הגדלת מינונים של propoxur הגביר את תדירות פריקה ספייק של מערכת העצבים המרכזית Drosophila מפוסל באופן תלוי ריכוז, ואילו גאבא neurodepressant הפחית את תדירות פריקה ספייק באופן תלוי ריכוז.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי זהו ניסוי אקס ויוו, ולכן התנאים של מלוחים, כגון pH וטמפרטורה, הוא קריטי עבור פעילות ממושכת של הכנת מערכת העצבים המרכזית. באופן דומה, היעדר פעילות חשמלית חיצונית, כלוב פאראדיי יעיל וצמצום רעש של 60 הרץ הם קריטיים להצלחת ההתמדה הזו. הנתונים שנאספו באמצעות מקשה זו יכולים לעזור לזהות את אופן הפעולה הספציפי של קוטלי חרקים.

אימות עוקב של נתונים אלה באמצעות שיטות אחרות כגון אלקטרופיזיולוגיה מהדק מתח, ניתוחים ביוכימיים, בדיקות פרמקולוגיות נוספות ניתן לבצע.