Culturing בודדים של Tigriopus משטרגליים וניתוח כמותי של התנהגותם שומרים על חבר

היתרון העיקרי של טכניקת culturing זו היא שאתה יכול להשיג copepods בתולה תוך שליטה על חוויית הזוג שלהם ומעקב אחר התפתחותם. שיטת ניתוח ההתנהגות הבאה יכולה לסייע בניסויים מבוקרים ובלתי ניתנים לשחזור על התנהגות ה-mate-guarding של קופפודים טיגריופוס שהם זואופלנקטון נפוץ בבריכות גאות ושפל סלעיות. למרות ששיטות אלה יכולות לספק תובנה לגבי התנהגות הרבייה של טיגריופוס, ניתן להשתמש בהן גם כדי להסתכל על האופן שבו גורמים גנטיים וסביבתיים משפיעים על הפיזיולוגיה וההתנהגות של קופפודים אלה.

כדי להתחיל, להשתמש פיפטה פסטר לאסוף נקבות gravid נושאת ביצים כתומות ברורות מתרבות המניות. שוטפים את הנקבות במדיום תרבותי נקי באמצעות צינורות עדינים. לאחר מכן, מניחים כל נקבה לתוך באר בודדת של צלחת תרבות תא שש באר עם מדיום תרבות נקייה.

ואז למקם את הצלחת באינקובטור לתרבות הנקבות עד שהם משחררים את שאק הביצה. לאחר ששק הביצה משתחרר, השתמש פיפטה פסטר כדי להסיר את הנקבות מן בארות הצלחת. ברגע שבעלי חיים בשלב ה-copepodid הראשון או CI מתחילים לצוץ, השתמש במיקרופיגט P-10 כדי לאסוף אותם.

כל יומיים עד שלושה ימים, לפקח על בארות עבור exuviae molted. לאחר מכן, סקס בעלי החיים על ידי בחינת מורפולוגיה האנטנה שלהם. כדי לזהות נכון נקבות בוגרות, ודא כי הם כבר molted חמש exuviae בארות תרבות כי ההבדלים בצורת אנטנות בין נקבות בוגרות וצעירים אינם משמעותיים בעליל באוכלוסיות מסוימות.

לאחר בחירת בעלי חיים בשלב המתאים ומין, להאכיל את האנשים שנבחרו עם מזון דגים טחון דק. בזמן שבעלי החיים אוכלים, הכינו שתי צלחות תרבות תאים תחתונות שטוחות 48 היטב כתא בדיקה. לאחר 30 דקות חלפו, לשטוף כל בעל חיים על ידי צינור אותו לתוך רצף של ארבע בארות של צלחת 24 באר מלא מי ים מלאכותיים נקיים.

לאחר מכן מניחים את האנשים שטוף בארות של צלחות A ו- B על כרית אור LED. אפשר לבעלי החיים להתאקלם במשך 30 דקות, ולאחר מכן להשתמש פיפטה פסטר להעביר את המטרות מצלחת B לצלחת A.Allow זכר יעד לקיים אינטראקציה בכל באר עבור זמן התצפית המיועד לפני עצירת הקלטת וידאו. ראשית, לבחון את הווידאו עבור העיתוי כאשר כל יעד הועבר לתוך באר על צלחת A.Next, להגדיר את החניכה של ניסיון שמירה על ידי זכר כמגע של האנטנה של הזכר עם כל חלק הגוף של המטרה.

הגדר את סיום ניסיון השמירה על ידי זכר כנקודה שבה שתי האנטנה של הזכר מתנתגת מגוף המטרה. לאחר מכן, הגדר חניכה של הזדווגות על ידי עיקול גוף הגבי של זכר, ואחריו לחץ חוזר ונשנה של urosome נגד זה של הנקבה. תחילה, צור סרטון וידאו המציג את פרק העניין על-ידי גיזום הסרט באמצעות תוכנה לעריכת סרטים.

לאחר מכן, פתח את ImageJ וייבא את סרטון הווידאו. בחרו באפשרות 'גווני אפור סמויים של 8 סיביות' כדי להקטין את הזיכרון הדרוש לעיבוד תמונה. לאחר מכן, בחרו בכלי בחירת הקו הישר לכיול spacial וציירו קו בחירה לאורך קוטר הבאר.

פתח את תפריט קנה המידה של קבוצה והזן את האורך הידוע בתיבת המרחק הידועה ואת היחידה בתיבת האורך של יחידת האורך. לאחר מכן, פתח את תפריט המאפיינים והזן את מרווח המסגרות בתיבה מרווח מסגרות. פתח את תוסף MTrackJ על-ידי בחירת תוספים ו- MtrackJ.

לאחר מכן, לחץ על לחצן המעקב בחלון הדו-שיח כדי לפתוח את תפריט תצורת המעקב. סמן החלת הצמדת סמן מקומי במהלך הרצועה ובחר centroid כהה כתכונת הצמדה. לאחר מכן, לחץ על לחצן הוסף בחלון הדו-שיח MTrackJ כדי להתחיל במעקב.

מקם סמן כדי לכסות את האנשים בסרטון הווידאו למעקב. לאחר מכן, לחץ כדי לזהות את המרכז הכהה של האובייקט בתוך הריבוע. כדי ליצור טבלת נתונים, לחץ על טבלת המידה בחלון הדו-שיח MTrackJ ולאחר מכן לחץ על לחצן הסרט כדי ליצור סרט עם המסלול המסוים שצויר כקו צבעוני.

לבסוף, לחץ על לחצן השמירה בחלון הדו-שיח MTrackJ כדי לשמור את התוצאות, כולל הנתונים במסלול הדו-ממדי המסוים. בניסוי זה, התנהגות שמירה על בני זוג של קופפודים Tigriopus נרשם וצפה. הניתוח מראה הבדל במשך הממוצע של ניסיונות שמירה בין זוגות זכר-נקבה לבין זוגות זכר-זכר של טיגריופוס californicus שבו זכרים בזוגות זכר-זכר הציגו משך זמן קצר יחסית של ניסיונות מאשר אלה בזוגות זכר-נקבה.

מעקב מרחבי בן שני ממדים אחר זוגות שומרים שזה עתה נוצרו של טיגריופוס קליפורניקוס גילה כי זוגות זכרים-זכרים נטו להראות מהירות גבוהה יותר מאשר זוגות זכר-נקבה בשלוש השניות הראשונות של ניסיונות שמירה. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה לחוקרים בתחומי האתולוגיה, הביוכימיה והגנטיקה האבולוציונית לחקור את מערכת ההזדווגות הייחודית של קופפודים מסוג זה.